Лаборатория инженерии белка

Отдел биоинженерии

Руководитель: Долгих Дмитрий Александрович, д. б. н.
dolgikh@nmr.ru+7(495)336-80-11, +7(495)995-55-57#2503

белковая инженерия, мембранные белки, de novo дизайн белковых молекул, структурно-функциональные исследования белков, получение и исследование природных и модифицированных рекомбинантных белков для медицины и биотехнологии

Лаборатория занимается конструированием и исследованием различных рекомбинантных  белков, прежде всего, представляющих интерес для медицины и биотехнологии. В частности, сотрудники изучают токсины, антитела, циткины, мембранные белки (рецепторы, транспортеры, ионные каналы и другие).

Группа Екатерины Люкмановой исследует «трехпетельные» белки человека семейства Ly6/uPAR и родственные им нейротоксины из яда змей. В центре внимания находятся молекулярные механизмы взаимодействия изучаемых белков с их рецепторами. Коллектив группы владеет передовыми технологиями рекомбинантной продукции «трехпетельных» белков, недоступных из природных источников. Это позволило впервые исследовать пространственную структуру и провести ряд функциональных исследований таких белков человека как Lynx1 (фактор регуляции нейропластичности), а также SLURP-1 и SLURP-2 (ауто/паракринные регуляторы эпителиальных клеток). Эти белки в будущем могут быть использованы в качестве прототипов для препаратов, улучшающих когнитивные функции, противораковых препаратов, а также лекарств, направленных на лечение ряда кожных заболеваний.

В настоящее время активно ведется исследование новых малоизученных «трехпетельных» белков Lypd6 и Lypd6B. Кроме того, группа сотрудничает с группой структурной биологии ионных каналов ИБХ РАН в исследовании потенциалозависимых ионных каналов человека.

Группа Теймура Алиева занимается дизайном и усовершенствованием (гуманизация, увеличение аффинности) рекомбинантных моноклональных антител, разработкой методов их экспрессии в клетках млекопитающих. Такие антитела могут быть использованы для терапии и диагностики аутоиммунных, онкологических и инфекционных заболеваний.

В Лаборатории получают антитела против вируса гриппа А с использованием иммуноглобулина А в попытке создать универсальное профилактическое средство против всех подтипов вируса А. Помимо этого, сотрудники получают уникальные антитела для создания средства профилактики и терапии на ранних стадиях лихорадки Эбола.

Кроме того, Лаборатория занимается созданием искусственных связывающих белков, обладающих функциями антител. Для отбора белков разрабатывается система клеточного дисплея белкового домена фибронектина. В частности, для этих целей используется белок внешней мембраны микроорганизма, выделенного из вечной мерзлоты, – аутотранспортер Psychrobacter cryohalolentis. Другим интересным объектом является протеородопсин Exiguobacterium sibiricum, впервые изученный сотрудниками Лаборатории. Совместно с Институтом структурной биологии в Гренобле исследована пространственная структура этого белка.

Еще одна группа под руководством Марине Гаспарян разработала и получила уникальный рецептор – селективный мутантный вариант противоопухолевого цитокина TRAIL (tumour-necrosis-factor-related apoptosis-inducing ligand) – DR5-B, который на порядок эффективнее убивает опухолевые клетки по сравнению с TRAIL дикого типа как отдельно, так и в комбинации с химиопрепаратами. Препарат DR5-B в доклинических испытаниях показал отсутствие токсичности, а значит, может рассматриваться как эффективное средство для терапии опухолевых заболеваний различного происхождения.

Группа Риты Чертковой проводит исследования функциональных активностей белка-переносчика электронов – цитохрома с из различных организмов. С помощью мутагенеза удалось установить аминокислотные остатки, которые отвечают за проявление активности этого белка в апоптозе, а также остатки, отвечающие за связывание с белковыми редокс-партнерами, благодаря чему осуществляется перенос электронов в дыхательной цепи. Проводятся исследования механизмов меж- и внутримолекулярного электронного транспорта цитохрома с, результаты которых могут быть использованы для получения электронных устройств с молекулами белка в виде монослоя на проводящих поверхностях.

На протяжении многих лет в Лаборатории создаются и исследуются искусственные белки на основе альбебетина – первого искусственного белка, созданного под заданную структуру. В результате были получены варианты альбебетина, обладающие противовирусной, антипролиферативной и инсулин-подобной активностью. Кроме того, альбебетин и его биологически активные варианты использовали в качестве модельных белков для исследования закономерностей формирования амилоидных фибрилл, лежащих в основе болезни Альцгеймера.

Исследования проводятся в сотрудничестве с Биологическим факультетом МГУ, НИИ гриппаВсероссийским научным центром молекулярной диагностики и леченияИнститутом белка РАНИнститутом физико-химических и биологических проблем РАНПочвенным институтом им. В.В. ДокучаеваУниверситетом КопенгагенаУниверситетом Калифорнии в Ирвайне и др.

Лаборатория инженерии белка создана в 2002 году как самостоятельное научно-исследовательское структурное подразделение ИБХ РАН на основе лаборатории химии генов и группы белковой инженерии лаборатории спектрального анализа. Лабораторию основал академик Михаил Петрович Кирпичников, который сейчас является деканом Биологического факультета МГУ и руководителем отдела биоинженерии ИБХ РАН. За пионерские работы по конструированию искусственных белков с заданной структурой и биологической активностью, положившие начало развитию молекулярной биоинженерии в нашей стране, М.П.Кирпичникову и Д.А.Долгих была присуждена Государственная премия РФ в области науки и техники за 1999 г. (совместно с О.Б. Птициным и А.В. Финкельштейном из Института белка РАН).

Сейчас Лабораторией руководит профессор Дмитрий Александрович Долгих. Он специализируется в области структурно-функциональных исследований, дизайна и биоинженерии белков. Под его руководством сотрудники Лаборатории провели фундаментальные исследования структуры и функции целого ряда белков, представляющих первостепенный научный и научно-прикладной интерес, в том числе цитокинов, биологически активных искусственных белков, нейротоксинов, цитохрома с, ионных каналов, антител.

Лаборатория инженерии белка ИБХ РАН проводит фундаментальные и социально ориентированные прикладные исследования в области генетической и белковой инженерии, в том числе:

  • получение и исследование рекомбинантных белков, представляющих биомедицинский интерес; прежде всего, мембранных и мембранно-активных белков;
  • изучение структурно-функциональных отношений в белках;
  • конструирование de novo белков для исследования принципов их структурной организации;
  • создание новых, не существующих в природе белков, обладающих заданными полезными свойствами.

К основным достижениям лаборатории инженерии белка с момента ее создания относятся следующие работы:

  • На основе белка de novo альбебетина с заданной структурой были сконструированы искусственные белки, моделирующие противовирусный центр связывания aльфа2-интерферона человека и обладающие выраженной противовирусной активностью, сравнимой с активностью aльфа2-интерферона.
  • Была создана уникальная высокоэффективная экспрессирующая система для получения нейротоксина II из яда кобры Naja oxiana, в результате чего были проведены структурно-функциональные исследования и сконструированы мутантные варианты нейротоксина II c измененной специфичностью взаимодействия с рецепторами и предложена модель взаимодействия нейротоксина с липидным окружением рецептора.
  • Были сконструированы и получены мутантные варианты цитохрома с, лишенные апоптозной активности, но сохраняющие функцию переносчика электрона в дыхательной цепи и антиоксидантные свойства цитохрома с.
  • Была получена новая холодоактивная эстераза Грам-отрицательной бактерии Psychrobacter cryohalolentis, выделенной из вечной мерзлоты, определена ее пространственная структура и функциональные свойства.
  • Был получен бактериородопсин Exiguobacterium sibiricum – новый уникальный представитель семейства ретиналь-содержащих белков, осуществляющих трансмембранный перенос протонов, и выявлены основные этапы этого процесса, а также определена его пространственная структура и показано, что он представляет собой новый тип протонного насоса: его протон-акцепторный участок включает сопряженные остатки His57 и Asp85, а донором протонов для основания Шиффа является остаток лизина.
  • Были получены рекомбинантные нейромодуляторы Lynx1 и SLURP-1 человека – уникальные белки-регуляторы никотинового ацетилхолинового рецептора и проведено исследование их физико-химических свойств; была определена пространственная структура Lynx1.
  • Была разработана бесклеточная система синтеза интегральных мембранных белков, основанная на использовании мембраномиметиков (мицеллы детергентов, бицеллы, липосомы и липид-белковые нанодиски), которая позволяет получать структурированные и функционально активные мембранные белки. С помощью этой уникальной системы мы планируем в ближайшее время получить ряд мембранных белков, исследование которых позволит создавать новые высокоэффективные препараты для медицины и биотехнологии.
Ф.И.О.ДолжностьКонтакты
Долгих Дмитрий Александрович, д. б. н.рук. подр.dolgikh@nmr.ru+7(495)336-80-11, +7(495)995-55-57#2503
Вульфсон Андрей Николаевич, к. х. н.в.н.с.andreywulfson@mail.ru+7(495)330-72-74
Некрасов Алексей Норбертович, к. ф.-м. н.с.н.с.an_nekrasov@mail.ru
Гаспарян Марине Эдуардовна, к. б. н.с.н.с.marine_gasparian@yahoo.com+7(495)335-28-88
Черткова Рита Валерьевна, к. б. н.с.н.с.cherita@inbox.ru+7(495)335-28-88
Литвинов Иван Сергеевич, к. б. н.с.н.с.litvinov@mail.ibch.ru+7(495)3307265
Петровская Лада Евгеньевна, к. х. н.с.н.с.lpetr65@yahoo.com+7(495)330-69-83
Шингарова Людмила Николаевна, к. х. н.с.н.с.lshing@mx.ibch.ru+7(495)330-69-83
Болдырева Елена Филипповнан.с.+7(495)330-66-29
Панина Анна Алексеевнан.с.+7()3306638
Яголович Анна Валерьевна, к. б. н.н.с.anne-gor2002@yandex.ru+7(926)3780155
Топорова Виктория Александровнам.н.с.toporova-viktorija@rambler.ru+7(495)330-69-83
Артыков Артем Александровичм.н.с.art.al.artykov@gmail.com+7(915)4695747
Балабашин Дмитрий Сергеевичм.н.с.
Гапизов Султан Шахбановичм.н.с.gsultan3@gmail.com
Ларина Мария Викторовнам.н.с.willis03@yandex.ru
Маркова Татьяна Геннадиевнатех.-лаб.+7()3307265
Журавлева Фаина Вячеславовнаинж.-иссл.

Ранее здесь работали:

Колосов Михаил Николаевич, академикрук. подр.
Люкманова Екатерина Назымовна, к. б. н.с.н.с.ekaterina-lyukmanova@yandex.ru
Шульга Александр Николаевичс.н.с.
Шульга Алексей Анатольевич, к. б. н.с.н.с.schulga@gmail.com
Шулепко Михаил Анатольевич, к. б. н.н.с.mikhailshulepko@gmail.com
Зырянова Ирина Михайловна, к. б. н.н.с.zyrianova@yandex.ru
Гончарук Марина Валерьевна, к. б. н.н.с.m.s.goncharuk@gmail.com
Гончарук Сергей Александрович, к. б. н.н.с.ms.goncharuk@gmail.com
Кульбацкий Дмитрий Сергеевичм.н.с.d.kulbatskiy@gmail.com
Брянцева Татьяна Владимировнам.н.с.tato-tato@yandex.ru
Ким Я Васп.
Бычков Максим Леонидовичасп.mlb@live.ru
Охрименко Иван студ.i.s.okhrimenko@yandex.ru
Нуреев Михаил инженерmnureev@mail.ru
Добрынина Татьяна Владимировнаинж.-иссл.

Избранные публикации (показать все)

Загружаются...

Долгих Дмитрий Александрович

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 33, комн. 424
  • Тел.: +7(495)336-80-11
  • Эл. почта: dolgikh@nmr.ru

Функциональные исследования ретинального белка Exiguobacterium sibiricum (ESR) (2018-11-30)

Ретиналь-содержащий белок Exiguobacterium sibiricum (ESR) представляет собой светозависимую протонную помпу, обладающую уникальной структурной особенностью – наличием остатка лизина в положении, соответствующем внутрибелковому донору протонов для основания Шиффа. Впервые получены и исследованы производные ESR, содержащие синтетические аналоги ретиналя. С помощью прямого электрометрического метода изучена кинетика образования светоиндуцированного мембранного потенциала протеолипосомами со встроенным ESR, а также его мутантным вариантом K96A. Показано, что при нейтральных и щелочных значениях рН для ESR дикого типа наблюдается положительный фотоэлектрический ответ, соответствующий переносу протонов во внешнюю среду. Замена остатка К96 сопровождается исчезновением миллисекундной электрогенной фазы, которая связана с репротонированием основания Шиффа. Впервые показано, что пониженная эффективность транспорта протонов в мутанте K96A объясняется не только замедлением фотоцикла, но и повышением вклада обратных реакций.

Cовместно с Биологическим факультетом МГУ, ИБХФ РАН и МФТИ

Публикации

  1. Siletsky SA, Mamedov MD, Lukashev EP, Balashov SP, Dolgikh DA, Rubin AB, Kirpichnikov MP, Petrovskaya LE (2018). Elimination of proton donor strongly affects directionality and efficiency of proton transport in ESR, a light-driven proton pump from Exiguobacterium sibiricum. BIOCHIM BIOPHYS ACTA 1860, 1–11
  2. Belikov NE, Melnikova IA, Demina OV, Petrovskaya LE, Kryukova EA, Dolgikh DA, Kuzmichev PK, Chupin VV, Lukin AY, Shumsky AN, Chizhov I, Levin PP, Kirpichnikov MP, Varfolomeev SD, Khodonov AA (2018). The effect of the chromophoric group modification on the optical properties of retinal proteins. MENDELEEV COMMUN 28 (4), 406–408

Фрагмент (76)PGTKMIFA(83) лошадиного цитохрома с играет ключевую роль в его электрон-транспортной активности (2017-11-28)

Исследовано влияние конформации петлевого участка P76GTKMIFA83 лошадиного цитохрома с на электрон-транспортную активность белка. На основе данных анализа информационной структуры получен ряд вариантов цитохрома с с множественными заменами в сайте P76GTKMIFA83, направленными на понижение его конформационной подвижности. Исследованы сукцинат:цитохром с-редуктазная и цитохром с-оксидазная активности митопластов печени крысы в присутствии вариантов цитохрома с. Показано, что способность к переносу электрона мутантных вариантов была снижена в разной степени. Согласно данным спектроскопии резонансного (РКР) и гигантского (ГКР) комбинационного рассеяния снижение электрон-транспортной активности мутантных вариантов коррелирует с конформационными изменениями и уменьшением подвижности гемопорфирина. Полученные результаты свидетельствуют о ключевой роли фрагмента P76GTKMIFA83 в функционировании цитохрома с.

Публикации

  1. Chertkova RV, Brazhe NA, Bryantseva TV, Nekrasov AN, Dolgikh DA, Yusipovich AI, Sosnovtseva O, Maksimov GV, Rubin AB, Kirpichnikov MP (2017). New insight into the mechanism of mitochondrial cytochrome c function. PLoS One 12 (5), e0178280

Доклиническое исследование мутантного варианта цитокина TRAIL с повышенной селективностью к «рецептору смерти» DR5 (2016-03-29)

Гаспарян М.Э., Бычков М.Л., Яголович А.В., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. (ИБХ)

Налобин Д.С., Калабушев С.Н., Ахаев Д.Н. (Биофак МГУ)

Проведено доклиническое исследование препарата на основе мутантного варианта противоопухолевого цитокина TRAIL, обладающего повышенной селективностью к рецептору смерти DR5. Вариант DR5-B отличается от белка TRAIL дикого типа шестью заменами; он связывается с рецептором DR5, проводящим сигнал апоптоза, столь же эффективно, что и белок дикого типа, но значительно хуже связывается с ингибирующими TRAIL-индуцируемый апоптозный сигнал рецепторами-ловушками. Проведенные нами эксперименты на клеточных культурах показали, что DR5-B убивает опухолевые клетки различного происхождения (как отдельно, так и в комбинации с химиопрепаратами) в 2-10 раз эффективнее, чем TRAIL дикого типа, который недавно прошедший клинические испытания в США и показал весьма ограниченный терапевтический эффект. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что этот мутантный вариант (DR5-B) не токсичен и может стать эффективным препаратом для лечения многих видов рака, при которых наблюдается повышенная экспрессия рецептора DR5. (Совместно с лабораторией прототипирования и испытаний биотехнологических разработок Биологического факультета МГУ).

Библиография

M.E.Gasparian, M.L.Bychkov, A.V.Yagolovich, D.A.Dolgikh, M.P.Kirpichnikov. Mutations enhancing selectivity of antitumor cytokine TRAIL to DR5 receptor increase its cytotoxicity against tumor cells. Biochemistry (Moscow), 2015, 80: 1080–1091.

Bychkov M.L., Gasparian, M.E., Dolgikh, D.A., Kirpichnikov, M.P. Combination of TRAIL with bortezomib shifted apoptotic signaling from DR4 to DR5 death receptor by selective internalization and degradation of DR4. PLoS One, 2014, 9, e109756.