Лаборатория химии протеолитических ферментов

Отдел пептидно-белковых технологий

Руководитель: Смирнов Иван Витальевич, д. х. н.
ivansmr@inbox.ru+7(926)7397865

enz.siobc.ras.ru/

протеолиз, активные центры, механизм действия, пространственная структура, ААА+-белки, биотехнология

Лаборатория химии протеолитических ферментов, возглавлявшаяся чл.-корр. РАН В. К. Антоновым, была образована в 1967 году, выделившись из Лаборатории химии антибиотиков, возглавлявшейся академиком М. М. Шемякиным. С 1992 года лабораторией заведует проф. Л. Д. Румш.

В настоящее время лаборатория занимается исследованием структурно-функциональных особенностей функционирования Lon-протеиназы, исследованием регуляторных функций энтеропептидазы и дуоденазы в отношении рецепторов, активируемых протеиназами (PAR), а также выделением и исследованием протеиназ экстремофильных организмов.

Лаборатория активно участвует в научной и педагогической деятельности — подготовлено и защищено три докторских и более 50 кандидатских диссертаций, под руководством сотрудников лаборатории выполнено большое количество студенческих дипломных работ. Лаборатория является организатором постоянно действующего межинститутского семинара «Проблемы и перспективы исследования протеолитических ферментов», а также регулярно организует проведение Всероссийских симпозиумов «Химия протеолитических ферментов».

Основным направлением работ лаборатории является исследование протеиназ, выполняющих регуляторные функции в системах внутриклеточного протеолиза (АТР-зависимые Lon-протеиназы) и процессинга белков (энтеропептидаза, дуоденаза). Кроме того, объектами изучения служат экстремофильные протеиназы, а также протеиназы, являющиеся ключевыми при развитии особо опасных и социально значимых инфекций, вызываемых такими патогенами как Plasmodium falciparum и ВИЧ. Научная деятельность лаборатории направлена не только на решение фундаментальных проблем современной энзимологии (выяснение природы избирательности протеиназ в процессе узнавания белков-мишеней и путей реализации их специфичности, установление механизма функционирования некоторых протеиназ), но и на решение прикладных задач (выделение и изучение протеиназ, применяющихся в биотехнологии и в медицине, поиск ингибиторов ряда протеиназ).

Для изучения механизма каталитического акта при функционировании протеолитических ферментов используется метод теоретического конформационного анализа. В лаборатории разработан подход, позволяющий различать механизмы действия пептидгидролаз – общий основной и ковалентный катализ – путем использования тяжелокислородной воды как среды реакции и предложена классификация пептидгидролаз, основанная на различиях в механизмах их действия.

Проводится исследование АТР-зависимых Lon-протеиназ, относящихся к суперсемейству ААА+-белков и играющих ключевую роль в обеспечении сохранности клеточного протеома.

Установлено, что протеолитические активные центры Lon-протеиназ представлены каталитической диадой Ser-Lys, при этом семейство Lon состоит из двух подсемейств (А и В), различающихся окружением каталитических остатков активных центров, структурной организацией АТР-азных доменов и общей архитектурой молекулы. Сравнительное исследование протеиназ LonA из Escherichia coli (ЕcLonА) и LonB из Archaeoglobus fulgidus (AfLonВ) выявило важность четвертичной структуры для реализации процессивного механизма протеолиза.

Рентгеноструктурным анализом показано, что протеолитические домены ЕcLonА и AfLonВ обладают уникальным типом пространственной структуры и образуют в кристалле циклические гексамеры. Мономерный N-концевой субдомен ЕcLonА также имеет уникальную укладку, в то время как структура альфа-спирализованного домена фермента типична для ААА+-белков. Полученные результаты послужили основанием для выведения семейства Lon-протеиназ в индивидуальный клан SJ в базе данных пептидгидролаз MEROPS.

Рис. 1. Пространственные структуры фрагментов LonA-протеиназы из E. coli. А — N-концевой субдомен (остатки (1—119));B — α-спирализованный домен (остатки (491—584));C — протеолитический домен (остатки (585—784)).

В процессе исследования сериновых протеиназ желудочно-кишечного тракта выделен и охарактеризован новый фермент — дуоденаза. Установлена первичная и пространственная структура дуоденазы; обнаружена двойственная (трипсино- и химотрипсиноподобная) специфичность фермента. Показано, что уникальные свойства энтеропептидазы тонкого кишечника, обладающей абсолютной специфичностью, обусловлены сложной доменной организацией при наличии строгой иерархии первичного и двух вторичных субстрат-связывающих центров, один из которых обеспечивает высокую специфичность, а другой — высокую эффективность катализа.

Получены данные, свидетельствующие в пользу того, что дуоденаза может являться специфическим активатором проэнтеропептидазы, т. е. играть ключевую роль в инициации каскада активации протеолитических ферментов пищеварительного тракта. Кроме того, обнаружено, что энтеропептидаза и дуоденаза обладают также регуляторной функцией по отношению к рецепторам семейства PAR.

Впервые получена протеиназа Ulysses (гомологичная протеиназе HIV—1), ген которой был обнаружен в мобильном генетическом элементе Drosophila virilis. Исследованы энзимологические свойства и подтверждена функциональная активность фермента. Методом гомологичного моделирования и молекулярной динамики построена пространственная модель протеиназы Ulysses.

Рис. 2. Пространственная структура дуоденазы.

Для аспартатной протеиназы плазмепсин II из малярийного паразита Plasmodium falciparum получены высокоаффинные и специфические ингибиторы.

Ф.И.О.ДолжностьКонтакты
Смирнов Иван Витальевич, д. х. н.рук. подр.ivansmr@inbox.ru+7(926)7397865
Румш Лев Давыдович, д. х. н., профессорг.н.с.lev.rumsh@ibch.ru+7(495)336-28-11
Ротанова Татьяна Васильевна, д. х. н.в.н.с.tatyana.rotanova@ibch.ru+7(495)335-42-22
Замолодчикова Татьяна Степановна, к. х. н.с.н.с.tatyanazam@yandex.ru+7(495)335-42-22
Михайлова Анна Григорьевна, к. х. н.с.н.с.anna.mikhailova@ibch.ru+7(495)335-42-22
Котельникова Ольга Викторовна, к. б. н.с.н.с.+7(495)3353322
Андрианова Анна Говардовна, к. х. н.н.с.govardovna@mail.ru+7(495)330-63-74
Дергоусова Наталья Ивановна, к. х. н.н.с.natd2002@mail.ru+7(495)330-63-74
Калиберда Елена Николаевна, к. х. н.н.с.elena.kaliberda@ibch.ru+7(495)330-63-74
Карлинский Давид Михайлович, к. х. н.н.с.karlinskyd@gmail.com
Хайруллин Рафиль , к. х. н.м.н.с.rfkhairullin@yahoo.com
Степнов Антон Андреевичм.н.с.
Овчинникова Марина Владимировнам.н.с.
Куджаев Арсен Мизамудиновичасп.kudzhaev_arsen@mail.ru+7(926)7117732
Данилов Дмитрий Викторовичинженерdenycore@ibch.ru+7(999)7107739
Залевский Артур Олеговичинженерaozalevsky@gmail.com
Пипия София Онисеевнаинженерpipiyasofiya@ibch.ru
Попов Михаил Евгеньевич, к. х. н.ст. инж.popovm@gmail.com+7(495)336-28-11

Ранее здесь работали:

Антонов Владимир Константинович, чл.-корр. РАНрук. подр.
Мельников Эдвард Эдуардович, к. х. н.с.н.с.
Волков Денис Александрович, к. х. н.м.н.с.volkov.den@gmail.com

Избранные публикации (показать все)

Загружаются...

Смирнов Иван Витальевич

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 31, комн. 607
  • Тел.: +7(926)7397865
  • Эл. почта: ivansmr@inbox.ru

Достижения лаборатории химии протеолитических ферментов за 2015 год (2016-03-29)

Сравнительный анализ первичных и вторичных структур N-концевых областей АТР-зависимых Lon-протеаз, молекулярных шаперонов ClpC и ClpE, а также АТР-независимых протеаз LonC позволил охарактеризовать положение подсемейства LonA в классификации ферментов системы контроля качества клеточных белков.

 

На основании 3D-структур протозойных олигопептидаз В (ОрdB) из Leischmania major и Trypanosoma bruceiвыполнено моделирование трехмерной структуры олигопептидазы В. Предположен механизм переходабактериальных ОрdB из неактивной - открытой конформации в активную – закрытую.


Рекомбинантный катепсин L с 3 Flag и С-myc эпитопами на С-конце белка (rec-С-Cat L) получен в клетках E. coliRosetta гл. образом в виде телец включения. Белок проявляет протеолитическую (желатин) и пептидолитическую (хромогенный субстрат Z-Ala-Phe-Arg-pNa) активности.

 

Роль IgA1 протеаз в пневмококковой инфекции

Анализ аминокислотной последовательности IgA1 протеаз некоторых штаммов пневмококкока (Streptococcus pneumoniaeи IgA1 протеазы менингококка (N. meningitidis ) показал их высокую идентичность.

В эксперименте кроликов линии Шиншилла инфицировали сублетальной дозой пневмококков различных штаммов (3, 14, 6А, 19А, 19F, 23F, 18C, 9N, 6В, 9V, 15B, 7F). Титрование сывороток иммунизированных кроликов методом ИФА показало в большинстве из них наличие суммарных антител к IgA1 протеазе менингококка с величиной титра от 1:3000 до 1:50000. Полученные данные дают основание предположить возможность использования последней в качестве препарата для защиты от пневмококковой инфекции.