Лаборатория химии протеолитических ферментов

Руководитель: Румш Лев Давыдович, д. х. н., профессор
+7 (495) 336-28-11 · lev.rumsh@ibch.ru

enz.siobc.ras.ru/

протеолиз, активные центры, механизм действия, пространственная структура, ААА+-белки, биотехнология

Лаборатория химии протеолитических ферментов, возглавлявшаяся чл.-корр. РАН В. К. Антоновым, была образована в 1967 году, выделившись из Лаборатории химии антибиотиков, возглавлявшейся академиком М. М. Шемякиным. С 1992 года лабораторией заведует проф. Л. Д. Румш.

В настоящее время лаборатория занимается исследованием структурно-функциональных особенностей функционирования Lon-протеиназы, исследованием регуляторных функций энтеропептидазы и дуоденазы в отношении рецепторов, активируемых протеиназами (PAR), а также выделением и исследованием протеиназ экстремофильных организмов.

Лаборатория активно участвует в научной и педагогической деятельности — подготовлено и защищено три докторских и более 50 кандидатских диссертаций, под руководством сотрудников лаборатории выполнено большое количество студенческих дипломных работ. Лаборатория является организатором постоянно действующего межинститутского семинара «Проблемы и перспективы исследования протеолитических ферментов», а также регулярно организует проведение Всероссийских симпозиумов «Химия протеолитических ферментов».

Направления исследований

Основным направлением работ лаборатории является исследование протеиназ, выполняющих регуляторные функции в системах внутриклеточного протеолиза (АТР-зависимые Lon-протеиназы) и процессинга белков (энтеропептидаза, дуоденаза). Кроме того, объектами изучения служат экстремофильные протеиназы, а также протеиназы, являющиеся ключевыми при развитии особо опасных и социально значимых инфекций, вызываемых такими патогенами как Plasmodium falciparum и ВИЧ. Научная деятельность лаборатории направлена не только на решение фундаментальных проблем современной энзимологии (выяснение природы избирательности протеиназ в процессе узнавания белков-мишеней и путей реализации их специфичности, установление механизма функционирования некоторых протеиназ), но и на решение прикладных задач (выделение и изучение протеиназ, применяющихся в биотехнологии и в медицине, поиск ингибиторов ряда протеиназ).

Для изучения механизма каталитического акта при функционировании протеолитических ферментов используется метод теоретического конформационного анализа. В лаборатории разработан подход, позволяющий различать механизмы действия пептидгидролаз – общий основной и ковалентный катализ – путем использования тяжелокислородной воды как среды реакции и предложена классификация пептидгидролаз, основанная на различиях в механизмах их действия.

Проводится исследование АТР-зависимых Lon-протеиназ, относящихся к суперсемейству ААА+-белков и играющих ключевую роль в обеспечении сохранности клеточного протеома.

Основные достижения

Установлено, что протеолитические активные центры Lon-протеиназ представлены каталитической диадой Ser-Lys, при этом семейство Lon состоит из двух подсемейств (А и В), различающихся окружением каталитических остатков активных центров, структурной организацией АТР-азных доменов и общей архитектурой молекулы. Сравнительное исследование протеиназ LonA из Escherichia coli (ЕcLonА) и LonB из Archaeoglobus fulgidus (AfLonВ) выявило важность четвертичной структуры для реализации процессивного механизма протеолиза.

Рентгеноструктурным анализом показано, что протеолитические домены ЕcLonА и AfLonВ обладают уникальным типом пространственной структуры и образуют в кристалле циклические гексамеры. Мономерный N-концевой субдомен ЕcLonА также имеет уникальную укладку, в то время как структура альфа-спирализованного домена фермента типична для ААА+-белков. Полученные результаты послужили основанием для выведения семейства Lon-протеиназ в индивидуальный клан SJ в базе данных пептидгидролаз MEROPS.

Рис. 1. Пространственные структуры фрагментов LonA-протеиназы из E. coli. А — N-концевой субдомен (остатки (1—119)); B — α-спирализованный домен (остатки (491—584)); C — протеолитический домен (остатки (585—784)).

В процессе исследования сериновых протеиназ желудочно-кишечного тракта выделен и охарактеризован новый фермент — дуоденаза. Установлена первичная и пространственная структура дуоденазы; обнаружена двойственная (трипсино- и химотрипсиноподобная) специфичность фермента. Показано, что уникальные свойства энтеропептидазы тонкого кишечника, обладающей абсолютной специфичностью, обусловлены сложной доменной организацией при наличии строгой иерархии первичного и двух вторичных субстрат-связывающих центров, один из которых обеспечивает высокую специфичность, а другой — высокую эффективность катализа.

Получены данные, свидетельствующие в пользу того, что дуоденаза может являться специфическим активатором проэнтеропептидазы, т. е. играть ключевую роль в инициации каскада активации протеолитических ферментов пищеварительного тракта. Кроме того, обнаружено, что энтеропептидаза и дуоденаза обладают также регуляторной функцией по отношению к рецепторам семейства PAR.

Впервые получена протеиназа Ulysses (гомологичная протеиназе HIV—1), ген которой был обнаружен в мобильном генетическом элементе Drosophila virilis. Исследованы энзимологические свойства и подтверждена функциональная активность фермента. Методом гомологичного моделирования и молекулярной динамики построена пространственная модель протеиназы Ulysses.

Рис. 2. Пространственная структура дуоденазы.

Для аспартатной протеиназы плазмепсин II из малярийного паразита Plasmodium falciparum получены высокоаффинные и специфические ингибиторы.

Ф.И.О.ДолжностьЭл. почта
Андрианова Анна Говардовна, к. х. н.н.с.
Дергоусова Наталья Ивановна, к. х. н.н.с.
Замолодчикова Татьяна Степановна, к. х. н.с.н.с.
Калиберда Елена Николаевна, к. х. н.н.с.
Михайлова Анна Григорьевна, к. х. н.с.н.с.
Попов Михаил Евгеньевич, к. х. н.с.н.с.
Ротанова Татьяна Васильевна, д. х. н.в.н.с.
Степнов Антон Андреевичм.н.с.
Хайруллин Рафиль , к. х. н.м.н.с.

Избранные публикации

  1. Ягудаева Е.Ю., Жигис Л.С., Разгуляева О.А., Зуева В.С., Мельников Э.Э., Зубов В.П., Козлов Л.В., Бичучер А.М., Котельникова О.В., Аллилуев А.П., Аваков А.Э., Румш Л.Д. (2010). Выделение и определение активности IGA1-протеиназы из культуры Neisseria meningitidis. Биоорг. хим. 36 (1), 96–105 [+]

    Разработана методика получения очищенного препарата IgA1-протеиназы из культуры Neisseria meningitidis серогруппы А из трех инактивированных промежуточных продуктов производства вакцины против менингококковой инфекции: культуральной жидкости, а также супернатанта и осадка, полученных при осаждении бактериальных клеток цетавлоном. Показана способность IgA1-протеиназы, выделенной из менингококка серогруппы А, защищать экспериментальных животных (мышей) при инфицировании менингококком серогруппы В.

  2. Румш Л.Д., Михайлова А.Г., Михура И.В., Прудченко И.А., Чикин Л.Д., Михалева И.И., Калиберда Е.Н., Дергоусова Н.И., Мельников Э.Э., Формановский А.А. (2008). Селективные ингибиторы плазмепсина II Plasmodium falciparum на основе пепстатина. Биоорг. хим. 34 (6), 739–746
  3. Botos I., Melnikov E.E., Cherry S., Tropea J.E., Khalatova A.G., Rasulova F., Dauter Z., Maurizi M.R., Rotanova T.V., Wlodawer A., Gustchina A. (2004). The catalytic domain of Escherichia coli Lon protease has a unique fold and a Ser-Lys dyad in the active site. J. Biol. Chem. 279 (9), 8140–8 [+]

    ATP-dependent Lon protease degrades specific short-lived regulatory proteins as well as defective and abnormal proteins in the cell. The crystal structure of the proteolytic domain (P domain) of the Escherichia coli Lon has been solved by single-wavelength anomalous dispersion and refined at 1.75-A resolution. The P domain was obtained by chymotrypsin digestion of the full-length, proteolytically inactive Lon mutant (S679A) or by expression of a recombinant construct encoding only this domain. The P domain has a unique fold and assembles into hexameric rings that likely mimic the oligomerization state of the holoenzyme. The hexamer is dome-shaped, with the six N termini oriented toward the narrower ring surface, which is thus identified as the interface with the ATPase domain in full-length Lon. The catalytic sites lie in a shallow concavity on the wider distal surface of the hexameric ring and are connected to the proximal surface by a narrow axial channel with a diameter of approximately 18 A. Within the active site, the proximity of Lys(722) to the side chain of the mutated Ala(679) and the absence of other potential catalytic side chains establish that Lon employs a Ser(679)-Lys(722) dyad for catalysis. Alignment of the P domain catalytic pocket with those of several Ser-Lys dyad peptide hydrolases provides a model of substrate binding, suggesting that polypeptides are oriented in the Lon active site to allow nucleophilic attack by the serine hydroxyl on the si-face of the peptide bond.

  4. Антонов В.К., Воротынцева Т.И., Замолодчикова Т.С. (1992). Дуоденаза – новая сериновая протеиназа с необычной специфичностью. Доклады РАН 324 (6), 1318–1322
  5. Антонов В.К., Гинодман Л.М., Румш Л.Д. (1984). Механизмы протеолиза. Биоорг. хим. 10 (8), 1044–1058
  6. Антонов В.К., Иванина (Ротанова) Т.В., Березин И.В., Мартинек К. (1968). Бифункциональные обратимые ингибиторы протеолитических ферментов. Взаимодействие с α-химотрипсина с гексилборной кислотой. Доклады АН СССР 183 (6), 1435–1438

Руководитель подразделения

Румш Лев Давыдович

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 34, комн. 235
  • Тел.: +7 (495) 336-28-11
  • Эл. почта: lev.rumsh@ibch.ru