Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов

Отдел молекулярной нейробиологии

Руководитель: Козлов Сергей Александрович, д. х. н.
+7 (495) 336 4022 · serg@ibch.ru

Токсинология, нейротоксины, ионотропные рецепторы, структура белков, рекомбинантные полипептиды, биологически активные соединения для медицины

Лаборатория проводит исследования биологически активных компонентов из природных источников, взаимодействующих с различными мишенями в клеточной мембране, а также разрабатывает общие подходы для их идентификации, выделения, структурно-функционального анализа и использования в качестве тонких инструментов модуляции активности мембранных рецепторов нервной клетки. Исследования Лаборатории позволяют приблизиться к пониманию молекулярных механизмов специфичности действия природных лигандов и закладывают основу для разработки принципиально новых высокоспецифичных лекарственных средств и инсектицидов.

Лаборатория сотрудничает с Институтом эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН (член-корр. РАН Л. Г. Магазанник), Федеральным научно-клиническим центром физико-химической медицины (академик В.М. Говорун), Институтом биоорганической химии им. Садыкова АН республики Узбекистан (академик Ш. И. Салихов), Институтом общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН (в.н.с. Т.И. Одинцова), Всероссийским научно-исследовательским институтом сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН (проф. А.В. Бабаков), Католическим университетом г. Левен, Бельгия (проф. Я. Титгат) и др.

В лаборатории проводились совместные научные исследования с компаниями Monsanto, Bayer, Zeneka, DuPont и др. Многие приоритетные результаты защищены международными и российскими патентами. В лаборатории получены гранты по программе Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Роснауки, Роспрома, программе «Научная школа», РФФИ и др.

Лаборатория постоянно ведет работу с молодежью, за время существования по тематике исследования были защищены 23 кандидатских диссертации. Хорошее материально-техническое обеспечение, использование передовых методов исследования, постоянное совершенствование практических навыков сотрудников, открытость для дискуссий, большие творческие планы и активное участие сотрудников в общественной жизни Института – это то, что характеризует Лабораторию нейрорецепторов и нейрорегуляторов сегодня.

Лаборатория была основана в 1987 году академиком РАН, профессором Евгением Васильевичем Гришиным, под руководством которого она стала ведущим научным подразделением нашей страны и мира в области изучения природных нейротоксинов и их нейрональных рецепторов.

Направления исследований

  • Поиск и исследование полипептидных токсинов и низкомолекулярных соединений, модулирующих активность мембранных рецепторов, участвующих в процессе генерации и передачи болевых ощущений (Юлия Владимировна Королькова, Ярослав Алексеевич Андреев, Сергей Геннадьевич Кошелев, Дмитрий Игоревич Осмаков)
  • Изучение антимикробных пептидов членистоногих и защитных пептидов растений (Евгений Александрович Рогожин)
  • Разработка методов защиты сельскохозяйственных растений для повышения урожая (Евгений Александрович Рогожин)
  • Разработка методов получения рекомбинантных полипептидных токсинов в различных системах гетерологической экспрессии (Ярослав Алексеевич Андреев, Екатерина Евгеньевна Малеева)
  • Внедрение омиксных технологий в поиск и структурную идентификацию биологически активных соединений сложных многокомпонентных смесей (Александр Николаевич Миков)
  • Создание клеточных линий для анализа лиганд-рецепторных взаимодействий (Юлия Владимировна Королькова, Ярослав Алексеевич Андреев)
  • Изучение наноструктуры комплексов ДНК (Василий Николаевич Данилевич)

Основные достижения

  • Сотрудники Лаборатории провели систематические исследования яда пауков, скорпионов, муравьев и змей (всего более 50 видов ядовитых животных) и экстрактов лекарственных растений, в которых было идентифицировано более 150 различных токсинов, из них 136 выделено и охарактеризовано впервые. В процессе этой работы были открыты:
  • новый класс токсинов пауков типа аргиопина – полиаминных блокаторов глутаматных рецепторов
  • семейство высокомолекулярных селективных нейротоксинов из яда каракурта («черной вдовы») – латротоксинов
  • мембраноактивные пептиды из яда муравьев и пауков
  • полипептидные токсины, специфичные для натриевых, калиевых, кальциевых, протончувствительных, TRPV1, TRPA1каналов.
  • низкомолекулярные биологически активные соединения из лекарственных растений с анальгетическим действием.
  • При изучении нейрональных рецепторов впервые выделены и охарактеризованы все индивидуальные компоненты натриевого канала электровозбудимых мембран млекопитающих.
  • Проведено детальное исследование рецепторов латротоксина и рецепторов аргиопина.
  • Открыт новый тип ионотропных глутаматных рецепторов.
  • Установлено существование в пресинаптической мембране нервной клетки функционального комплекса – синаптосекретосомы и нового рецептора – латрофилина, обуславливающих процесс секреции нейромедиатора.
  • Успешно завершены доклинические испытания двух потенциальных анальгетических препаратов.
Ф.И.О.ДолжностьЭл. почта
Александрова Людмила Александровнаинженер
Андреев Ярослав Алексеевич, к. б. н.с.н.с.
Василевский Александр Александрович, к. х. н.с.н.с.
Данилевич Василий Николаевич, к. б. н.с.н.с.
Елякова Елена Георгиевна, к. х. н.с.н.с.
Королькова Юлия Владимировна, к. х. н.с.н.с.
Кошелев Сергей Геннадьевич, к. б. н.с.н.с.
Малеева Екатерина Евгеньевнам.н.с.
Миков Александр Николаевичасп.
Мошарова Ирина Владимировнам.н.с.
Мусолямов Александр Хусаиновичм.н.с.
Рогожин Евгений Александровичм.н.с.

Избранные публикации

  1. Osmakov D.I., Koshelev S.G., Andreev Y.A., Dyachenko I.A., Bondarenko D.A., Murashev A.N., Grishin E.V., Kozlov S.A. (2015). Conversed mutagenesis of an inactive peptide to ASIC3 inhibitor for active sites determination. Toxicon , [+]

    Peptide Ugr9-1 from the venom of sea anemone Urticina grebelnyi selectively inhibits the ASIC3 channel and significantly reverses inflammatory and acid-induced pain in vivo. A close homolog peptide Ugr 9-2 does not have these features. To find the pharmacophore residues and explore structure-activity relationships of Ugr 9-1, we performed site-directed mutagenesis of Ugr 9-2 and replaced several positions by the corresponding residues from Ugr 9-1. Mutant peptides Ugr 9-2 T9F and Ugr 9-2 Y12H were able to inhibit currents of the ASIC3 channels 2.2 times and 1.3 times weaker than Ugr 9-1, respectively. Detailed analysis of the spatial models of Ugr 9-1, Ugr 9-2 and both mutant peptides revealed the presence of the basic-aromatic clusters on opposite sides of the molecule, each of which is responsible for the activity. Additionally, Ugr9-1 mutant with truncated N- and C-termini retained similar with the Ugr9-1 action in vitro and was equally potent in vivo model of thermal hypersensitivity. All together, these results are important for studying the structure-activity relationships of ligand-receptor interaction and for the future development of peptide drugs from animal toxins.

    ID:1472
  2. Dubovskii P.V., Vassilevski A.A., Kozlov S.A., Feofanov A.V., Grishin E.V., Efremov R.G. (2015). Latarcins: versatile spider venom peptides. Cell. Mol. Life Sci. 72 (23), 4501–22 [+]

    Arthropod venoms feature the presence of cytolytic peptides believed to act synergetically with neurotoxins to paralyze prey or deter aggressors. Many of them are linear, i.e., lack disulfide bonds. When isolated from the venom, or obtained by other means, these peptides exhibit common properties. They are cationic; being mostly disordered in aqueous solution, assume amphiphilic α-helical structure in contact with lipid membranes; and exhibit general cytotoxicity, including antifungal, antimicrobial, hemolytic, and anticancer activities. To suit the pharmacological needs, the activity spectrum of these peptides should be modified by rational engineering. As an example, we provide a detailed review on latarcins (Ltc), linear cytolytic peptides from Lachesana tarabaevi spider venom. Diverse experimental and computational techniques were used to investigate the spatial structure of Ltc in membrane-mimicking environments and their effects on model lipid bilayers. The antibacterial activity of Ltc was studied against a panel of Gram-negative and Gram-positive bacteria. In addition, the action of Ltc on erythrocytes and cancer cells was investigated in detail with confocal laser scanning microscopy. In the present review, we give a critical account of the progress in the research of Ltc. We explore the relationship between Ltc structure and their biological activity and derive molecular characteristics, which can be used for optimization of other linear peptides. Current applications of Ltc and prospective use of similar membrane-active peptides are outlined.

    ID:1395
  3. Astafieva A.A., Enyenihi A.A., Rogozhin E.A., Kozlov S.A., Grishin E.V., Odintsova T.I., Zubarev R.A., Egorov T.A. (2015). Novel proline-hydroxyproline glycopeptides from the dandelion (Taraxacum officinale Wigg.) flowers: de novo sequencing and biological activity. Plant Sci. 238, 323–9 [+]

    Two novel homologous peptides named ToHyp1 and ToHyp2 that show no similarity to any known proteins were isolated from Taraxacum officinale Wigg. flowers by multidimensional liquid chromatography. Amino acid and mass spectrometry analyses demonstrated that the peptides have unusual structure: they are cysteine-free, proline-hydroxyproline-rich and post-translationally glycosylated by pentoses, with 5 carbohydrates in ToHyp2 and 10 in ToHyp1. The ToHyp2 peptide with a monoisotopic molecular mass of 4350.3Da was completely sequenced by a combination of Edman degradation and de novo sequencing via top down multistage collision induced dissociation (CID) and higher energy dissociation (HCD) tandem mass spectrometry (MS(n)). ToHyp2 consists of 35 amino acids, contains eighteen proline residues, of which 8 prolines are hydroxylated. The peptide displays antifungal activity and inhibits growth of Gram-positive and Gram-negative bacteria. We further showed that carbohydrate moieties have no significant impact on the peptide structure, but are important for antifungal activity although not absolutely necessary. The deglycosylated ToHyp2 peptide was less active against the susceptible fungus Bipolaris sorokiniana than the native peptide. Unique structural features of the ToHyp2 peptide place it into a new family of plant defense peptides. The discovery of ToHyp peptides in T. officinale flowers expands the repertoire of molecules of plant origin with practical applications.

    ID:1474
  4. Mikov A.N., Fedorova I.M., Potapieva N.N., Maleeva E.E., Andreev Y.A., Zaitsev A.V., Kim K.K., Bocharov E.V., Bozin T.N., Altukhov D.A., Lipkin A.V., Kozlov S.A., Tikhonov D.B., Grishin E.V. (2015). ω-Tbo-IT1-New Inhibitor of Insect Calcium Channels Isolated from Spider Venom. Sci Rep 5, 17232 [+]

    Novel disulfide-containing polypeptide toxin was discovered in the venom of the Tibellus oblongus spider. We report on isolation, spatial structure determination and electrophysiological characterization of this 41-residue toxin, called ω-Tbo-IT1. It has an insect-toxic effect with LD50 19 μg/g in experiments on house fly Musca domestica larvae and with LD50 20 μg/g on juvenile Gromphadorhina portentosa cockroaches. Electrophysiological experiments revealed a reversible inhibition of evoked excitatory postsynaptic currents in blow fly Calliphora vicina neuromuscular junctions, while parameters of spontaneous ones were not affected. The inhibition was concentration dependent, with IC50 value 40 ± 10 nM and Hill coefficient 3.4 ± 0.3. The toxin did not affect frog neuromuscular junctions or glutamatergic and GABAergic transmission in rat brains. Ca(2+) currents in Calliphora vicina muscle were not inhibited, whereas in Periplaneta americana cockroach neurons at least one type of voltage gated Ca(2+) current was inhibited by ω-Tbo-IT1. Thus, the toxin apparently acts as an inhibitor of presynaptic insect Ca(2+) channels. Spatial structure analysis of the recombinant ω-Tbo-IT1 by NMR spectroscopy in aqueous solution revealed that the toxin comprises the conventional ICK fold containing an extended β-hairpin loop and short β-hairpin loop which are capable of making "scissors-like mutual motions".

    ID:1341
  5. Pluzhnikov K.A., Kozlov S.A., Vassilevski A.A., Vorontsova O.V., Feofanov A.V., Grishin E.V. (2014). Linear antimicrobial peptides from Ectatomma quadridens ant venom. Biochimie 107 Pt B, 211–5 [+]

    Venoms from three poneromorph ant species (Paraponera clavata, Ectatomma quadridens and Ectatomma tuberculatum) were investigated for the growth inhibition of Gram-positive and Gram-negative bacteria. It was shown that the venom of E. quadridens and its peptide fraction in particular possess marked antibacterial action. Three linear antimicrobial peptides sharing low similarity to the well-known ponericin peptides were isolated from this ant venom by means of size-exclusion and reversed-phase chromatography. The peptides showed antimicrobial activity at low micromolar concentrations. Their primary structure was established by direct Edman sequencing in combination with mass spectrometry. The most active peptide designated ponericin-Q42 was chemically synthesized. Its secondary structure was investigated in aqueous and membrane-mimicking environment, and the peptide was shown to be partially helical already in water, which is unusual for short linear peptides. Analysis of its activity on different bacterial strains, human erythrocytes and chronic myelogenous leukemia K562 cells revealed that the peptide shows broad spectrum cytolytic activity at micromolar and submicromolar concentrations. Ponericin-Q42 also possesses weak toxic activity on flesh fly larvae with LD50 of ∼105 μg/g.

    ID:1150
  6. Osmakov D.I., Kozlov S.A., Andreev Y.A., Koshelev S.G., Sanamyan N.P., Sanamyan K.E., Dyachenko I.A., Bondarenko D.A., Murashev A.N., Mineev K.S., Arseniev A.S., Grishin E.V. (2013). Sea Anemone Peptide with Uncommon β-Hairpin Structure Inhibits Acid-sensing Ion Channel 3 (ASIC3) and Reveals Analgesic Activity. J. Biol. Chem. 288 (32), 23116–27 [+]

    Three novel peptides were isolated from the venom of the sea anemone Urticina grebelnyi. All of them are 29 amino acid peptides cross-linked by two disulfide bridges, with a primary structure similar to other sea anemone peptides belonging to structural group 9a. The structure of the gene encoding the shared precursor protein of the identified peptides was determined. One peptide, π-AnmTX Ugr 9a-1 (short name Ugr 9-1), produced a reversible inhibition effect on both the transient and the sustained current of human ASIC3 channels expressed in Xenopus laevis oocytes. It completely blocked the transient component (IC50 10 ± 0.6 μm) and partially (48 ± 2%) inhibited the amplitude of the sustained component (IC50 1.44 ± 0.19 μm). Using in vivo tests in mice, Ugr 9-1 significantly reversed inflammatory and acid-induced pain. The other two novel peptides, AnmTX Ugr 9a-2 (Ugr 9-2) and AnmTX Ugr 9a-3 (Ugr 9-3), did not inhibit the ASIC3 current. NMR spectroscopy revealed that Ugr 9-1 has an uncommon spatial structure, stabilized by two S-S bridges, with three classical β-turns and twisted β-hairpin without interstrand disulfide bonds. This is a novel peptide spatial structure that we propose to name boundless β-hairpin.

    ID:864
  7. Kabanova N.V., Vassilevski A.A., Rogachevskaja O.A., Bystrova M.F., Korolkova Y.V., Pluzhnikov K.A., Romanov R.A., Grishin E.V., Kolesnikov S.S. (2012). Modulation of P2X3 receptors by spider toxins. Biochim. Biophys. Acta 1818 (11), 2868–2875 [+]

    Recently, the novel peptide named purotoxin-1 (PT1) has been identified in the venom of the spider Geolycosa sp. and shown to exert marked modulatory effects on P2X3 receptors in rat sensory neurons. Here we studied another polypeptide from the same spider venom, purotoxin-2 (PT2), and demonstrated that it also affected activity of mammalian P2X3 receptors. The murine and human P2X3 receptors were heterologously expressed in cells of the CHO line, and nucleotide-gated currents were stimulated by CTP and ATP, respectively. Both PT1 and PT2 negligibly affected P2X3-mediated currents elicited by brief pulses of the particular nucleotide. When subthreshold CTP or ATP was added to the bath to exert the high-affinity desensitization of P2X3 receptors, both spider toxins strongly enhanced the desensitizing action of the ambient nucleotides. At the concentration of 50nM, PT1 and PT2 elicited 3-4-fold decrease in the IC(50) dose of ambient CTP or ATP. In contrast, 100nM PT1 and PT2 negligibly affected nucleotide-gated currents mediated by mP2X2 receptors or mP2X2/mP2X3 heteromers. Altogether, our data point out that the PT1 and PT2 toxins specifically target the fast-desensitizing P2X3 receptor, thus representing a unique tool to manipulate its activity.

    ID:730
  8. Andreev Y.A., Kozlov S.A., Koshelev S.G., Ivanova E.A., Monastyrnaya M.M., Kozlovskaya E.P., Grishin E.V. (2008). Analgesic compound from sea anemone Heteractis crispa is the first polypeptide inhibitor of vanilloid receptor 1 (TRPV1). J. Biol. Chem. 283 (35), 23914–21 [+]

    Первый ингибитор термочувствительных рецепторов TRPV1, активно принимающих участие в механизмах воспаления и передачи болевых ощущений, был выделен из экстракта нематоцистов морской анемоны Heteractis crispa. В экспериментах in vivo на мышах рекомбинантный аналог природного полипептида, названного АРНС1, проявил значимую анальгетическую активность, сопоставимую с действием опиоидов. В отличие от опиоидов, действие АРНС1 не приводит к наркотическому эффекту; поэтому обнаруженный полипептид имеет огромное практическое значение для разработки новых обезболивающих и противовоспалительных средств.

    ID:87
  9. Kozlov S.A., Vassilevski A.A., Feofanov A.V., Surovoy A.Y., Karpunin D.V., Grishin E.V. (2006). Latarcins, antimicrobial and cytolytic peptides from the venom of the spider Lachesana tarabaevi (Zodariidae) that exemplify biomolecular diversity. J. Biol. Chem. 281 (30), 20983–92 [+]

    Семейство коротких линейных полипептидных молекул — латарцинов — было найдено в яде паука Lachesana tarabaevi, часть из них была получена химическим синтезом и исследована на антибактериальное действие. Бактерицидная активность латарцинов соответствовала лучшим антимикробным пептидам, обнаруженным у различных видов животных. Большой терапевтический потенциал этих простых по структуре полипептидных молекул будет реализован, с большой долей вероятности, в самое ближайшее время.

    ID:86
  10. Kozlov S., Malyavka A., McCutchen B., Lu A., Schepers E., Herrmann R., Grishin E. (2005). A novel strategy for the identification of toxinlike structures in spider venom. Proteins 59 (1), 131–40 [+]

    We compared two different approaches to sequence information analysis from the expressed sequence tag (EST) library constructed for the venom glands of the spider Agelena orientalis. Some results were more illustrative and reliable by the contig analysis technique, whereas our novel method, with specific structural markers introduced for protein structure detection, allowed us to overcome some limitations of the contig analysis. A novel technique was suggested for the identification in data banks of the spider's ion channel inhibitor toxins using primary structure features common to all spiders. Analysis of about 150 polypeptides made it possible to introduce 3 primary structure motifs for spider toxins: the Principal Structural Motif (PSM), which postulates the existence of 6 amino acid residues between the first and second cysteine residue and the Cys-Cys sequence at a distance of 5-10 amino acid residues from the second cysteine; the Extra Structural Motif (ESM), which postulates the existence of a pair of CXC fragments in the C-region; and the Processing Quadruplet Motif (PQM), which specifies the Arg residue at position -1 and Glu residues at positions -2, -3, and/or -4 in the precursor sequences just before the postprocessing site. In the processed data bank we found 48 toxinlike structures with ion channel inhibitor motifs. These include agelenin earlier isolated from Agelena opulenta and 25 more homologous sequences, 15 homologs of mu-agatoxin 2 from the spider Agelenopsis aperta, 3 structures with low homology to omega-agatoxin-IIIA, and 4 new structures. Also we showed that toxinlike structures exceed two thirds of the overall database sequences.

    ID:194
  11. Korolkova Y.V., Bocharov E.V., Angelo K., Maslennikov I.V., Grinenko O.V., Lipkin A.V., Nosyreva E.D., Pluzhnikov K.A., Olesen S.P., Arseniev A.S., Grishin E.V. (2002). New binding site on common molecular scaffold provides HERG channel specificity of scorpion toxin BeKm-1. J. Biol. Chem. 277 (45), 43104–9 [+]

    The scorpion toxin BeKm-1 is unique among a variety of known short scorpion toxins affecting potassium channels in its selective action on ether-a-go-go-related gene (ERG)-type channels. BeKm-1 shares the common molecular scaffold with other short scorpion toxins. The toxin spatial structure resolved by NMR consists of a short alpha-helix and a triple-stranded antiparallel beta-sheet. By toxin mutagenesis study we identified the residues that are important for the binding of BeKm-1 to the human ERG K+ (HERG) channel. The most critical residues (Tyr-11, Lys-18, Arg-20, Lys-23) are located in the alpha-helix and following loop whereas the "traditional" functional site of other short scorpion toxins is formed by residues from the beta-sheet. Thus the unique location of the binding site of BeKm-1 provides its specificity toward the HERG channel.

    ID:195
  12. Korolkova Y.V., Kozlov S.A., Lipkin A.V., Pluzhnikov K.A., Hadley J.K., Filippov A.K., Brown D.A., Angelo K., Strøbaek D., Jespersen T., Olesen S.P., Jensen B.S., Grishin E.V. (2001). An ERG channel inhibitor from the scorpion Buthus eupeus. J. Biol. Chem. 276 (13), 9868–76 [+]

    Первый селективный блокатор K+ каналов ERG-типа BeKm, выделенный из яда скорпиона Buthus eupeus, был экспрессирован в гетерологичной системе и его биологические свойства, а также свойства нескольких мутантных аналогов, были изучены на M-токах культуры клеток NG108-15. Анализ активности мутантных форм позволили установить наиболее значимые аминокислотные остатки в структуре токсина, а сам токсин стал первым опубликованным селективным ингибитором hERG каналов, который в настоящий момент продается на рынке биологических препаратов.

    ID:85

Руководитель подразделения

Козлов Сергей Александрович

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 51, комн. 363
  • Тел.: +7 (495) 336 4022
  • Эл. почта: serg@ibch.ru
Факс: +7 (495) 330 5892

Из яда паука Tibellus oblongus выделен и охарактеризован новый инсекто-специфичный токсин, обладающий «динамическим эпитопом». (2016-03-28)

Новый дисульфид-содержащий полипептидный токсин с мотивом пространственной укладки ICK был обнаружен в яде паука Tibellus oblongus. Методами электрофизиологии для нового полипептида была определена биологическая мишень - пресинаптический Са-канал несекомых. Токсин не действовал на препараты из млекопитающих и позвоночных, поэтому получил название ω-Тbo-IT1. ЛД50  нового инсектотоксина составило 11.7 мкг/г на личинках домашней мухи Musca domestica и 20 мкг/г на ювенильный особях тараканов Gromphadorhina portentosa. Методами электрофизиологии было показано обратимое концентрационно-зависимое ингибирование ω-Тbo-IT1 вызванных возбуждающих постсинаптических токов в нейромышечных препаратах мясной мухи Calliphora vicina  (IC50=40±10 нм и коэффициентом Хилла 3.4±0.3) и отсутствие эффекта пептида на спонтанные токи. Анализ пространственной структуры рекомбинантного ω-Тbo-IT1 методом ЯМР-спектроскопии в водном растворе показал, что токсин состоит из нескольких β-шпилечных петель. Две такие петли - длинная и короткая - в водном растворе способны совершать взаимные колебания, которые мы назвали “scissors-like mutual motions”. Такая обнаруженная пластичность молекулы («динамический эпитоп») может играть решающую роль в связывании/распознавании рецептора.

Публикации

  1. Mikov A.N., Fedorova I.M., Potapieva N.N., Maleeva E.E., Andreev Y.A., Zaitsev A.V., Kim K.K., Bocharov E.V., Bozin T.N., Altukhov D.A., Lipkin A.V., Kozlov S.A., Tikhonov D.B., Grishin E.V. (2015). ω-Tbo-IT1-New Inhibitor of Insect Calcium Channels Isolated from Spider Venom. Sci Rep 5, 17232 [+]

    Novel disulfide-containing polypeptide toxin was discovered in the venom of the Tibellus oblongus spider. We report on isolation, spatial structure determination and electrophysiological characterization of this 41-residue toxin, called ω-Tbo-IT1. It has an insect-toxic effect with LD50 19 μg/g in experiments on house fly Musca domestica larvae and with LD50 20 μg/g on juvenile Gromphadorhina portentosa cockroaches. Electrophysiological experiments revealed a reversible inhibition of evoked excitatory postsynaptic currents in blow fly Calliphora vicina neuromuscular junctions, while parameters of spontaneous ones were not affected. The inhibition was concentration dependent, with IC50 value 40 ± 10 nM and Hill coefficient 3.4 ± 0.3. The toxin did not affect frog neuromuscular junctions or glutamatergic and GABAergic transmission in rat brains. Ca(2+) currents in Calliphora vicina muscle were not inhibited, whereas in Periplaneta americana cockroach neurons at least one type of voltage gated Ca(2+) current was inhibited by ω-Tbo-IT1. Thus, the toxin apparently acts as an inhibitor of presynaptic insect Ca(2+) channels. Spatial structure analysis of the recombinant ω-Tbo-IT1 by NMR spectroscopy in aqueous solution revealed that the toxin comprises the conventional ICK fold containing an extended β-hairpin loop and short β-hairpin loop which are capable of making "scissors-like mutual motions".

    ID:1341

На примере одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg.) впервые показано наличие у растений антимикробного пептида из группы гликопептидов, богатого остатками пролина/гидроксипролина (2016-03-28)

Комбинацией методов автоматического N-концевого секвенирования по Эдману, аминокислотного анализа и нисходящей тандемной масс-спектрометрии определена полная аминокислотная последовательность нового узко специфичного антимикробного пролин/гидроксипролин-богатого, не содержащего остатков цистеина гликопептида, выделенного из цветков одуванчика лекарственного (T. officinale). Установлено наличие гликозилирования данной молекулы пентозами исключительно по остаткам гидроксипролина. Определение спектров кругового дихроизма позволило установить формирование пространственной организации данного гликопептида преимущественно в виде полипролиновой спирали. Высокая специфичность действия нового гликополипептида определяется ингибированием грибов-микромицетов с пигментированной (меланизированной) клеточной стенкой, что может обуславливать механизм его молекулярного действия. При этом экспериментально установлено, что тотальное дегликозилирование не приводит в существенному снижению его антимикробной активности на уровне показателя ИК50. Выделенная молекула является первым примером наличия у растений так называемых потенциальных "гликопептидных антибиотиков" - компонентов врожденной иммунной системы.

Публикации

  1. Astafieva A.A., Enyenihi A.A., Rogozhin E.A., Kozlov S.A., Grishin E.V., Odintsova T.I., Zubarev R.A., Egorov T.A. (2015). Novel proline-hydroxyproline glycopeptides from the dandelion (Taraxacum officinale Wigg.) flowers: de novo sequencing and biological activity. Plant Sci. 238, 323–9 [+]

    Two novel homologous peptides named ToHyp1 and ToHyp2 that show no similarity to any known proteins were isolated from Taraxacum officinale Wigg. flowers by multidimensional liquid chromatography. Amino acid and mass spectrometry analyses demonstrated that the peptides have unusual structure: they are cysteine-free, proline-hydroxyproline-rich and post-translationally glycosylated by pentoses, with 5 carbohydrates in ToHyp2 and 10 in ToHyp1. The ToHyp2 peptide with a monoisotopic molecular mass of 4350.3Da was completely sequenced by a combination of Edman degradation and de novo sequencing via top down multistage collision induced dissociation (CID) and higher energy dissociation (HCD) tandem mass spectrometry (MS(n)). ToHyp2 consists of 35 amino acids, contains eighteen proline residues, of which 8 prolines are hydroxylated. The peptide displays antifungal activity and inhibits growth of Gram-positive and Gram-negative bacteria. We further showed that carbohydrate moieties have no significant impact on the peptide structure, but are important for antifungal activity although not absolutely necessary. The deglycosylated ToHyp2 peptide was less active against the susceptible fungus Bipolaris sorokiniana than the native peptide. Unique structural features of the ToHyp2 peptide place it into a new family of plant defense peptides. The discovery of ToHyp peptides in T. officinale flowers expands the repertoire of molecules of plant origin with practical applications.

    ID:1474