Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов

Отдел молекулярной нейробиологии

Руководитель: Козлов Сергей Александрович, д. х. н.
serg@ibch.ru+7(495)336 4022

Токсинология, нейротоксины, ионотропные рецепторы, структура белков, рекомбинантные полипептиды, биологически активные соединения для медицины

Лаборатория проводит исследования биологически активных компонентов из природных источников, взаимодействующих с различными мишенями в клеточной мембране, а также разрабатывает общие подходы для их идентификации, выделения, структурно-функционального анализа и использования в качестве тонких инструментов модуляции активности мембранных рецепторов нервной клетки. Исследования Лаборатории позволяют приблизиться к пониманию молекулярных механизмов специфичности действия природных лигандов и закладывают основу для разработки принципиально новых высокоспецифичных лекарственных средств и инсектицидов.

Лаборатория сотрудничает с Институтом эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН (член-корр. РАН Л. Г. Магазанник), Федеральным научно-клиническим центром физико-химической медицины (академик В.М. Говорун), Институтом биоорганической химии им. Садыкова АН республики Узбекистан (академик Ш. И. Салихов), Институтом общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН (в.н.с. Т.И. Одинцова), Всероссийским научно-исследовательским институтом сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН (проф. А.В. Бабаков), Католическим университетом г. Левен, Бельгия (проф. Я. Титгат) и др.

В лаборатории проводились совместные научные исследования с компаниями Monsanto, Bayer, Zeneka, DuPont и др. Многие приоритетные результаты защищены международными и российскими патентами. В лаборатории получены гранты по программе Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Роснауки, Роспрома, программе «Научная школа», РФФИ и др.

Лаборатория постоянно ведет работу с молодежью, за время существования по тематике исследования были защищены 23 кандидатских диссертации. Хорошее материально-техническое обеспечение, использование передовых методов исследования, постоянное совершенствование практических навыков сотрудников, открытость для дискуссий, большие творческие планы и активное участие сотрудников в общественной жизни Института – это то, что характеризует Лабораторию нейрорецепторов и нейрорегуляторов сегодня.

Лаборатория была основана в 1987 году академиком РАН, профессором Евгением Васильевичем Гришиным, под руководством которого она стала ведущим научным подразделением нашей страны и мира в области изучения природных нейротоксинов и их нейрональных рецепторов.

  • Поиск и исследование полипептидных токсинов и низкомолекулярных соединений, модулирующих активность мембранных рецепторов, участвующих в процессе генерации и передачи болевых ощущений (Юлия Владимировна Королькова, Ярослав Алексеевич Андреев, Сергей Геннадьевич Кошелев, Дмитрий Игоревич Осмаков)
  • Изучение антимикробных пептидов членистоногих и защитных пептидов растений (Евгений Александрович Рогожин)
  • Разработка методов защиты сельскохозяйственных растений для повышения урожая (Евгений Александрович Рогожин)
  • Разработка методов получения рекомбинантных полипептидных токсинов в различных системах гетерологической экспрессии (Ярослав Алексеевич Андреев, Екатерина Евгеньевна Малеева)
  • Внедрение омиксных технологий в поиск и структурную идентификацию биологически активных соединений сложных многокомпонентных смесей (Александр Николаевич Миков)
  • Создание клеточных линий для анализа лиганд-рецепторных взаимодействий (Юлия Владимировна Королькова, Ярослав Алексеевич Андреев)
  • Изучение наноструктуры комплексов ДНК (Василий Николаевич Данилевич)
  • Сотрудники Лаборатории провели систематические исследования яда пауков, скорпионов, муравьев и змей (всего более 50 видов ядовитых животных) и экстрактов лекарственных растений, в которых было идентифицировано более 150 различных токсинов, из них 136 выделено и охарактеризовано впервые. В процессе этой работы были открыты:
  • новый класс токсинов пауков типа аргиопина – полиаминных блокаторов глутаматных рецепторов
  • семейство высокомолекулярных селективных нейротоксинов из яда каракурта («черной вдовы») – латротоксинов
  • мембраноактивные пептиды из яда муравьев и пауков
  • полипептидные токсины, специфичные для натриевых, калиевых, кальциевых, протончувствительных, TRPV1, TRPA1каналов.
  • низкомолекулярные биологически активные соединения из лекарственных растений с анальгетическим действием.
  • При изучении нейрональных рецепторов впервые выделены и охарактеризованы все индивидуальные компоненты натриевого канала электровозбудимых мембран млекопитающих.
  • Проведено детальное исследование рецепторов латротоксина и рецепторов аргиопина.
  • Открыт новый тип ионотропных глутаматных рецепторов.
  • Установлено существование в пресинаптической мембране нервной клетки функционального комплекса – синаптосекретосомы и нового рецептора – латрофилина, обуславливающих процесс секреции нейромедиатора.
  • Успешно завершены доклинические испытания двух потенциальных анальгетических препаратов.
Ф.И.О.ДолжностьКонтакты
Славохотова Анна Александровна
Козлов Сергей Александрович, д. х. н.рук. подр.serg@ibch.ru+7(495)336 4022
Андреев Ярослав Алексеевич, к. б. н.с.н.с.ay@land.ru+7(495)336-40-20
Василевский Александр Александрович, к. х. н.с.н.с.avas@ibch.ru+7(495)336-65-40, +7(495)336-40-22
Данилевич Василий Николаевич, к. б. н.с.н.с.dan@mx.ibch.ru+7(495)336-40-22
Елякова Елена Георгиевна, к. х. н.с.н.с.elyakova@yandex.ru+7(495)429-87-20
Королькова Юлия Владимировна, к. х. н.с.н.с.july@ibch.ru+7(495)3366540
Кошелев Сергей Геннадьевич, к. б. н.с.н.с.sknew@yandex.ru+7(495)3306683
Рогожин Евгений Александровичн.с.rea21@list.ru+7(495)336-40-22
Осмаков Дмитрий Игоревичн.с.
Миков Александр Николаевичм.н.с.mikov.alexander@gmail.com+7(495)3366540
Малеева Екатерина Евгеньевнам.н.с.+7()3364022
Мошарова Ирина Владимировнам.н.с.+7()3306683
Логашина Юлия Александровнам.н.с.julek022@rambler.ru
Александрова Людмила Александровнаинженер+7(495)336-40-22
Лубова Ксения Игоревнаинженер
Емельянова Анна Андреевнаинж.-иссл.annaemelyan@gmail.com

Ранее здесь работали:

Егоров Цезий Алексеевич, д. х. н.в.н.с.ego@ibch.ru
Валякина Татьяна Ивановна, к. б. н.с.н.с.valyakina@ibch.ru
Плужников Кирилл Андреевич, к. х. н.с.н.с.
Симонова Мария Александровна, к. х. н.н.с.simonova@ibch.ru
Комалева Равиля Люкмановнан.с.
Лахтина Ольга Евгеньевнан.с.
Петрова Елена Эдуардовна, к. б. н.н.с.petrova@ibch.ru
Мусолямов Александр Хусаиновичм.н.с.musolyamov@ibch.ru
Самохвалова Лариса Вадимовнам.н.с.
Астафьева А Ам.н.с.a_sanya@mail.ru
Сачкова Мария Юрьевна, к. х. н.асп.sachkovamasha@mail.ru
Арзамасов Александр Алексеевичстуд.Alex_arzamasov@hotmail.com
Каневская Жанна Олеговналаб.zh-kanewskaya@yandex.ru
Гришин Евгений Васильевич, академикЗав. отделом

Избранные публикации

  1. Babenko V.V., Mikov A.N., Manuvera V.A., Anikanov N.A., Kovalchuk S.I., Andreev Y.A., Logashina Y.A., Kornilov D.A., Manolov A.I., Sanamyan N.P., Sanamyan K.E., Kostryukova E.S., Kozlov S.A., Grishin E.V., Govorun V.M., Lazarev V.N. (2017). Identification of unusual peptides with new Cys frameworks in the venom of the cold-water sea anemone Cnidopus japonicus. Sci Rep 7 (1), 14534 [+]

    Sea anemones (Actiniaria) are intensely popular objects of study in venomics. Order Actiniaria includes more than 1,000 species, thus presenting almost unlimited opportunities for the discovery of novel biologically active molecules. The venoms of cold-water sea anemones are studied far less than the venoms of tropical sea anemones. In this work, we analysed the molecular venom composition of the cold-water sea anemone Cnidopus japonicus. Two sets of NGS data from two species revealed molecules belonging to a variety of structural classes, including neurotoxins, toxin-like molecules, linear polypeptides (Cys-free), enzymes, and cytolytics. High-throughput proteomic analyses identified 27 compounds that were present in the venoms. Some of the toxin-like polypeptides exhibited novel Cys frameworks. To characterise their function in the venom, we heterologously expressed 3 polypeptides with unusual Cys frameworks (designated CjTL7, CjTL8, and AnmTx Cj 1c-1) in E. coli. Toxicity tests revealed that the CjTL8 polypeptide displays strong crustacean-specific toxicity, while AnmTx Cj 1c-1 is toxic to both crustaceans and insects. Thus, an improved NGS data analysis algorithm assisted in the identification of toxins with unusual Cys frameworks showing no homology according to BLAST. Our study shows the advantage of combining omics analysis with functional tests for active polypeptide discovery.

    ID:1908
  2. Kozlov S. (2017). Animal toxins for channelopathy treatment. Neuropharmacology , [+]

    Ion channels are transmembrane proteins that allow passive flow of ions inside and/or outside of cells or cell organelles. Except mutations lead to nonfunctional protein production or abolished receptor entrance on the membrane surface an altered channel may have two principal conditions that can be corrected. The channel may conduct fewer ions through (loss-of-function mutations) or too many ions (gain-of-function mutations) compared to a normal channel. Toxins from animal venoms are specialised molecules that are generally oriented toward interactions with ion channels. This is a result of long coevolution between predators and their prey. On the molecular level, toxins activate or inhibit ion channels, so they are ideal molecules for restoring conductance in mutated channels. Another aspect of this long coevolution is that a broad variety of toxins have been fine tuned to recognize the channels of different species, keeping many amino acids substitution among sequences. Many peptide ligands with high selectivity to specific receptor subtypes have been isolated from animal venoms, some of which are absolutely non-toxic to humans and mammalians. It is expected that molecules that are selective to each known receptor can be found in animal venoms, but the pool of toxins currently does not override all receptors described as being involved in channelopathies. Modern investigating methods have enhanced the search process for selective ligands. One prominent method is a site-directed mutagenesis of existing toxins to change the selectivity or/and affinity to the selected receptor, which has shown positive results.

    ID:1927
  3. Logashina Y.A., Solstad R.G., Mineev K.S., Korolkova Y.V., Mosharova I.V., Dyachenko I.A., Palikov V.A., Palikova Y.A., Murashev A.N., Arseniev A.S., Kozlov S.A., Stensvåg K., Haug T., Andreev Y.A. (2017). New Disulfide-Stabilized Fold Provides Sea Anemone Peptide to Exhibit Both Antimicrobial and TRPA1 Potentiating Properties. Toxins (Basel) 9 (5), [+]

    A novel bioactive peptide named τ-AnmTx Ueq 12-1 (short name Ueq 12-1) was isolated and characterized from the sea anemone Urticina eques. Ueq 12-1 is unique among the variety of known sea anemone peptides in terms of its primary and spatial structure. It consists of 45 amino acids including 10 cysteine residues with an unusual distribution and represents a new group of sea anemone peptides. The 3D structure of Ueq 12-1, determined by NMR spectroscopy, represents a new disulfide-stabilized fold partly similar to the defensin-like fold. Ueq 12-1 showed the dual activity of both a moderate antibacterial activity against Gram-positive bacteria and a potentiating activity on the transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1). Ueq 12-1 is a unique peptide potentiator of the TRPA1 receptor that produces analgesic and anti-inflammatory effects in vivo. The antinociceptive properties allow us to consider Ueq 12-1 as a potential analgesic drug lead with antibacterial properties.

    ID:1914
  4. Korolkova Y., Makarieva T., Tabakmakher K., Shubina L., Kudryashova E., Andreev Y., Mosharova I., Lee H.S., Lee Y.J., Kozlov S. (2017). Marine Cyclic Guanidine Alkaloids Monanchomycalin B and Urupocidin A Act as Inhibitors of TRPV1, TRPV2 and TRPV3, but not TRPA1 Receptors. Mar Drugs 15 (4), [+]

    Marine sponges contain a variety of low-molecular-weight compounds including guanidine alkaloids possessing different biological activities. Monanchomycalin B and urupocidin A were isolated from the marine sponge Monanchora pulchra. We found that they act as inhibitors of the TRPV1, TRPV2, and TRPV3 channels, but are inactive against the TRPA1 receptor. Monanchomycalin B is the most active among all published marine alkaloids (EC50 6.02, 2.84, and 3.25 μM for TRPV1, TRPV2, and TRPV3, correspondingly). Moreover, monanchomycalin B and urupocidin A are the first samples of marine alkaloids affecting the TRPV2 receptor. Two semi-synthetic urupocidin A derivatives were also obtained and tested against TRP (Transient Receptor Potential) receptors that allowed us to collect some data concerning the structure-activity relationship in this series of compounds. We showed that the removal of one of three side chains or double bonds in the other side chains in urupocidin A led to a decrease of the inhibitory activities. New ligands specific to the TRPV subfamily may be useful for the design of medicines as in the study of TRP channels biology.

    ID:1929
  5. Logashina Y.A., Mosharova I.V., Korolkova Y.V., Shelukhina I.V., Dyachenko I.A., Palikov V.A., Palikova Y.A., Murashev A.N., Kozlov S.A., Stensvåg K., Andreev Y.A. (2017). Peptide from Sea Anemone Metridium senile Affects Transient Receptor Potential Ankyrin-repeat 1 (TRPA1) Function and Produces Analgesic Effect. J. Biol. Chem. 292 (7), 2992–3004 [+]

    The transient receptor potential ankyrin-repeat 1 (TRPA1) is an important player in pain and inflammatory pathways. It is a promising target for novel drug development for the treatment of a number of pathological states. A novel peptide producing a significant potentiating effect on allyl isothiocyanate- and diclofenac-induced currents of TRPA1 was isolated from the venom of sea anemone Metridium senile. It is a 35-amino acid peptide cross-linked by two disulfide bridges named τ-AnmTX Ms 9a-1 (short name Ms 9a-1) according to a structure similar to other sea anemone peptides belonging to structural group 9a. The structures of the two genes encoding the different precursor proteins of Ms 9a-1 were determined. Peptide Ms 9a-1 acted as a positive modulator of TRPA1 in vitro but did not cause pain or thermal hyperalgesia when injected into the hind paw of mice. Intravenous injection of Ms 9a-1 (0.3 mg/kg) produced a significant decrease in the nociceptive and inflammatory response to allyl isothiocyanate (the agonist of TRPA1) and reversed CFA (Complete Freund's Adjuvant)-induced inflammation and thermal hyperalgesia. Taken together these data support the hypothesis that Ms 9a-1 potentiates the response of TRPA1 to endogenous agonists followed by persistent functional loss of TRPA1-expressing neurons. We can conclude that TRPA1 potentiating may be useful as a therapeutic approach as Ms 9a-1 produces significant analgesic and anti-inflammatory effects in mice models of pain.

    ID:1928
  6. Nikolaev M.V., Dorofeeva N.A., Komarova M.S., Korolkova Y.V., Andreev Y.A., Mosharova I.V., Grishin E.V., Tikhonov D.B., Kozlov S.A. (2017). TRPV1 activation power can switch an action mode for its polypeptide ligands. PLoS ONE 12 (5), e0177077 [+]

    TRPV1 (vanilloid) receptors are activated by different types of stimuli including capsaicin, acidification and heat. Various ligands demonstrate stimulus-dependent action on TRPV1. In the present work we studied the action of polypeptides isolated from sea anemone Heteractis crispa (APHC1, APHC2 and APHC3) on rat TRPV1 receptors stably expressed in CHO cells using electrophysiological recordings, fluorescent Ca2+ measurements and molecular modeling. The APHCs potentiated TRPV1 responses to low (3-300 nM) concentrations of capsaicin but inhibited responses to high (>3.0 μM) concentrations. The activity-dependent action was also found for TRPV1 responses to 2APB and acidification. Thus the action mode of APHCs is bimodal and depended on the activation stimuli strength-potentiation of low-amplitude responses and no effect/inhibition of high-amplitude responses. The double-gate model of TRPV1 activation suggests that APHC-polypeptides may stabilize an intermediate state during the receptor activation. Molecular modeling revealed putative binding site at the outer loops of TRPV1. Binding to this site can directly affect activation by protons and can be allosterically coupled with capsaicin site. The results are important for further investigations of both TRPV1 and its ligands for potential therapeutic use.

    ID:1930
  7. Osmakov D.I., Koshelev S.G., Andreev Y.A., Kozlov S.A. (2017). Endogenous Isoquinoline Alkaloids Agonists of Acid-Sensing Ion Channel Type 3. Front Mol Neurosci 10, 282 [+]

    Acid-sensing ion channels (ASICs) ASIC3 expressed mainly in peripheral sensory neurons play an important role in pain perception and inflammation development. In response to acidic stimuli, they can generate a unique biphasic current. At physiological pH 7.4, human ASIC3 isoform (hASIC3) is desensitized and able to generate only a sustained current. We found endogenous isoquinoline alkaloids (EIAs), which restore hASIC3 from desensitization and recover the transient component of the current. Similarly, rat ASIC3 isoform (rASIC3) can also be restored from desensitization (at pH < 7.0) by EIAs with the same potency. At physiological pH and above, EIAs at high concentrations were able to effectively activate hASIC3 and rASIC3. Thus, we found first endogenous agonists of ASIC3 channels that could both activate and prevent or reverse desensitization of the channel. The decrease of EIA levels could be suggested as a novel therapeutic strategy for treatment of pain and inflammation.

    ID:1932
  8. Nekrasova O.V., Volyntseva A.D., Kudryashova K.S., Novoseletsky V.N., Lyapina E.A., Illarionova A.V., Yakimov S.A., Korolkova Y.V., Shaitan K.V., Kirpichnikov M.P., Feofanov A.V. (2016). Complexes of Peptide Blockers with Kv1.6 Pore Domain: Molecular Modeling and Studies with KcsA-Kv1.6 Channel. J Neuroimmune Pharmacol , [+]

    Разработан комплексный подход к поиску, исследованию и конструированию  пептидных блокаторов калиевого канала Kv1.6. Подход основан на применении разработанной нами биоинженерной аналитической системы для изучения связывания блокаторов с гибридным каналом KcsA-Kv1.6 методом конфокальной микроскопии и молекулярного моделирования комплексов пептидных блокаторов с каналом Kv1.6. Используя разработанный подход, охарактеризована аффинность ряда пептидных блокаторов к каналу Kv1.6, построены молекулярные модели их комплексов, описан интерфейс взаимодействия и аминокислотные остатки, влияющие на селективность  взаимодействия блокаторов с каналом Kv1.6.

    ID:1611
  9. Osmakov D.I., Koshelev S.G., Andreev Y.A., Dyachenko I.A., Bondarenko D.A., Murashev A.N., Grishin E.V., Kozlov S.A. (2015). Conversed mutagenesis of an inactive peptide to ASIC3 inhibitor for active sites determination. Toxicon , [+]

    Peptide Ugr9-1 from the venom of sea anemone Urticina grebelnyi selectively inhibits the ASIC3 channel and significantly reverses inflammatory and acid-induced pain in vivo. A close homolog peptide Ugr 9-2 does not have these features. To find the pharmacophore residues and explore structure-activity relationships of Ugr 9-1, we performed site-directed mutagenesis of Ugr 9-2 and replaced several positions by the corresponding residues from Ugr 9-1. Mutant peptides Ugr 9-2 T9F and Ugr 9-2 Y12H were able to inhibit currents of the ASIC3 channels 2.2 times and 1.3 times weaker than Ugr 9-1, respectively. Detailed analysis of the spatial models of Ugr 9-1, Ugr 9-2 and both mutant peptides revealed the presence of the basic-aromatic clusters on opposite sides of the molecule, each of which is responsible for the activity. Additionally, Ugr9-1 mutant with truncated N- and C-termini retained similar with the Ugr9-1 action in vitro and was equally potent in vivo model of thermal hypersensitivity. All together, these results are important for studying the structure-activity relationships of ligand-receptor interaction and for the future development of peptide drugs from animal toxins.

    ID:1472
  10. Dubovskii P.V., Vassilevski A.A., Kozlov S.A., Feofanov A.V., Grishin E.V., Efremov R.G. (2015). Latarcins: versatile spider venom peptides. Cell. Mol. Life Sci. 72 (23), 4501–22 [+]

    Arthropod venoms feature the presence of cytolytic peptides believed to act synergetically with neurotoxins to paralyze prey or deter aggressors. Many of them are linear, i.e., lack disulfide bonds. When isolated from the venom, or obtained by other means, these peptides exhibit common properties. They are cationic; being mostly disordered in aqueous solution, assume amphiphilic α-helical structure in contact with lipid membranes; and exhibit general cytotoxicity, including antifungal, antimicrobial, hemolytic, and anticancer activities. To suit the pharmacological needs, the activity spectrum of these peptides should be modified by rational engineering. As an example, we provide a detailed review on latarcins (Ltc), linear cytolytic peptides from Lachesana tarabaevi spider venom. Diverse experimental and computational techniques were used to investigate the spatial structure of Ltc in membrane-mimicking environments and their effects on model lipid bilayers. The antibacterial activity of Ltc was studied against a panel of Gram-negative and Gram-positive bacteria. In addition, the action of Ltc on erythrocytes and cancer cells was investigated in detail with confocal laser scanning microscopy. In the present review, we give a critical account of the progress in the research of Ltc. We explore the relationship between Ltc structure and their biological activity and derive molecular characteristics, which can be used for optimization of other linear peptides. Current applications of Ltc and prospective use of similar membrane-active peptides are outlined.

    ID:1395
  11. Astafieva A.A., Enyenihi A.A., Rogozhin E.A., Kozlov S.A., Grishin E.V., Odintsova T.I., Zubarev R.A., Egorov T.A. (2015). Novel proline-hydroxyproline glycopeptides from the dandelion (Taraxacum officinale Wigg.) flowers: de novo sequencing and biological activity. Plant Sci. 238, 323–9 [+]

    Two novel homologous peptides named ToHyp1 and ToHyp2 that show no similarity to any known proteins were isolated from Taraxacum officinale Wigg. flowers by multidimensional liquid chromatography. Amino acid and mass spectrometry analyses demonstrated that the peptides have unusual structure: they are cysteine-free, proline-hydroxyproline-rich and post-translationally glycosylated by pentoses, with 5 carbohydrates in ToHyp2 and 10 in ToHyp1. The ToHyp2 peptide with a monoisotopic molecular mass of 4350.3Da was completely sequenced by a combination of Edman degradation and de novo sequencing via top down multistage collision induced dissociation (CID) and higher energy dissociation (HCD) tandem mass spectrometry (MS(n)). ToHyp2 consists of 35 amino acids, contains eighteen proline residues, of which 8 prolines are hydroxylated. The peptide displays antifungal activity and inhibits growth of Gram-positive and Gram-negative bacteria. We further showed that carbohydrate moieties have no significant impact on the peptide structure, but are important for antifungal activity although not absolutely necessary. The deglycosylated ToHyp2 peptide was less active against the susceptible fungus Bipolaris sorokiniana than the native peptide. Unique structural features of the ToHyp2 peptide place it into a new family of plant defense peptides. The discovery of ToHyp peptides in T. officinale flowers expands the repertoire of molecules of plant origin with practical applications.

    ID:1474
  12. Mikov A.N., Fedorova I.M., Potapieva N.N., Maleeva E.E., Andreev Y.A., Zaitsev A.V., Kim K.K., Bocharov E.V., Bozin T.N., Altukhov D.A., Lipkin A.V., Kozlov S.A., Tikhonov D.B., Grishin E.V. (2015). ω-Tbo-IT1-New Inhibitor of Insect Calcium Channels Isolated from Spider Venom. Sci Rep 5, 17232 [+]

    Novel disulfide-containing polypeptide toxin was discovered in the venom of the Tibellus oblongus spider. We report on isolation, spatial structure determination and electrophysiological characterization of this 41-residue toxin, called ω-Tbo-IT1. It has an insect-toxic effect with LD50 19 μg/g in experiments on house fly Musca domestica larvae and with LD50 20 μg/g on juvenile Gromphadorhina portentosa cockroaches. Electrophysiological experiments revealed a reversible inhibition of evoked excitatory postsynaptic currents in blow fly Calliphora vicina neuromuscular junctions, while parameters of spontaneous ones were not affected. The inhibition was concentration dependent, with IC50 value 40 ± 10 nM and Hill coefficient 3.4 ± 0.3. The toxin did not affect frog neuromuscular junctions or glutamatergic and GABAergic transmission in rat brains. Ca(2+) currents in Calliphora vicina muscle were not inhibited, whereas in Periplaneta americana cockroach neurons at least one type of voltage gated Ca(2+) current was inhibited by ω-Tbo-IT1. Thus, the toxin apparently acts as an inhibitor of presynaptic insect Ca(2+) channels. Spatial structure analysis of the recombinant ω-Tbo-IT1 by NMR spectroscopy in aqueous solution revealed that the toxin comprises the conventional ICK fold containing an extended β-hairpin loop and short β-hairpin loop which are capable of making "scissors-like mutual motions".

    ID:1341
  13. Pluzhnikov K.A., Kozlov S.A., Vassilevski A.A., Vorontsova O.V., Feofanov A.V., Grishin E.V. (2014). Linear antimicrobial peptides from Ectatomma quadridens ant venom. Biochimie 107 Pt B, 211–5 [+]

    Venoms from three poneromorph ant species (Paraponera clavata, Ectatomma quadridens and Ectatomma tuberculatum) were investigated for the growth inhibition of Gram-positive and Gram-negative bacteria. It was shown that the venom of E. quadridens and its peptide fraction in particular possess marked antibacterial action. Three linear antimicrobial peptides sharing low similarity to the well-known ponericin peptides were isolated from this ant venom by means of size-exclusion and reversed-phase chromatography. The peptides showed antimicrobial activity at low micromolar concentrations. Their primary structure was established by direct Edman sequencing in combination with mass spectrometry. The most active peptide designated ponericin-Q42 was chemically synthesized. Its secondary structure was investigated in aqueous and membrane-mimicking environment, and the peptide was shown to be partially helical already in water, which is unusual for short linear peptides. Analysis of its activity on different bacterial strains, human erythrocytes and chronic myelogenous leukemia K562 cells revealed that the peptide shows broad spectrum cytolytic activity at micromolar and submicromolar concentrations. Ponericin-Q42 also possesses weak toxic activity on flesh fly larvae with LD50 of ∼105 μg/g.

    ID:1150
  14. Osmakov D.I., Kozlov S.A., Andreev Y.A., Koshelev S.G., Sanamyan N.P., Sanamyan K.E., Dyachenko I.A., Bondarenko D.A., Murashev A.N., Mineev K.S., Arseniev A.S., Grishin E.V. (2013). Sea Anemone Peptide with Uncommon β-Hairpin Structure Inhibits Acid-sensing Ion Channel 3 (ASIC3) and Reveals Analgesic Activity. J. Biol. Chem. 288 (32), 23116–27 [+]

    Three novel peptides were isolated from the venom of the sea anemone Urticina grebelnyi. All of them are 29 amino acid peptides cross-linked by two disulfide bridges, with a primary structure similar to other sea anemone peptides belonging to structural group 9a. The structure of the gene encoding the shared precursor protein of the identified peptides was determined. One peptide, π-AnmTX Ugr 9a-1 (short name Ugr 9-1), produced a reversible inhibition effect on both the transient and the sustained current of human ASIC3 channels expressed in Xenopus laevis oocytes. It completely blocked the transient component (IC50 10 ± 0.6 μm) and partially (48 ± 2%) inhibited the amplitude of the sustained component (IC50 1.44 ± 0.19 μm). Using in vivo tests in mice, Ugr 9-1 significantly reversed inflammatory and acid-induced pain. The other two novel peptides, AnmTX Ugr 9a-2 (Ugr 9-2) and AnmTX Ugr 9a-3 (Ugr 9-3), did not inhibit the ASIC3 current. NMR spectroscopy revealed that Ugr 9-1 has an uncommon spatial structure, stabilized by two S-S bridges, with three classical β-turns and twisted β-hairpin without interstrand disulfide bonds. This is a novel peptide spatial structure that we propose to name boundless β-hairpin.

    ID:864
  15. Kabanova N.V., Vassilevski A.A., Rogachevskaja O.A., Bystrova M.F., Korolkova Y.V., Pluzhnikov K.A., Romanov R.A., Grishin E.V., Kolesnikov S.S. (2012). Modulation of P2X3 receptors by spider toxins. Biochim. Biophys. Acta 1818 (11), 2868–2875 [+]

    Recently, the novel peptide named purotoxin-1 (PT1) has been identified in the venom of the spider Geolycosa sp. and shown to exert marked modulatory effects on P2X3 receptors in rat sensory neurons. Here we studied another polypeptide from the same spider venom, purotoxin-2 (PT2), and demonstrated that it also affected activity of mammalian P2X3 receptors. The murine and human P2X3 receptors were heterologously expressed in cells of the CHO line, and nucleotide-gated currents were stimulated by CTP and ATP, respectively. Both PT1 and PT2 negligibly affected P2X3-mediated currents elicited by brief pulses of the particular nucleotide. When subthreshold CTP or ATP was added to the bath to exert the high-affinity desensitization of P2X3 receptors, both spider toxins strongly enhanced the desensitizing action of the ambient nucleotides. At the concentration of 50nM, PT1 and PT2 elicited 3-4-fold decrease in the IC(50) dose of ambient CTP or ATP. In contrast, 100nM PT1 and PT2 negligibly affected nucleotide-gated currents mediated by mP2X2 receptors or mP2X2/mP2X3 heteromers. Altogether, our data point out that the PT1 and PT2 toxins specifically target the fast-desensitizing P2X3 receptor, thus representing a unique tool to manipulate its activity.

    ID:730
  16. Andreev Y.A., Kozlov S.A., Koshelev S.G., Ivanova E.A., Monastyrnaya M.M., Kozlovskaya E.P., Grishin E.V. (2008). Analgesic compound from sea anemone Heteractis crispa is the first polypeptide inhibitor of vanilloid receptor 1 (TRPV1). J. Biol. Chem. 283 (35), 23914–21 [+]

    Первый ингибитор термочувствительных рецепторов TRPV1, активно принимающих участие в механизмах воспаления и передачи болевых ощущений, был выделен из экстракта нематоцистов морской анемоны Heteractis crispa. В экспериментах in vivo на мышах рекомбинантный аналог природного полипептида, названного АРНС1, проявил значимую анальгетическую активность, сопоставимую с действием опиоидов. В отличие от опиоидов, действие АРНС1 не приводит к наркотическому эффекту; поэтому обнаруженный полипептид имеет огромное практическое значение для разработки новых обезболивающих и противовоспалительных средств.

    ID:87
  17. Kozlov S.A., Vassilevski A.A., Feofanov A.V., Surovoy A.Y., Karpunin D.V., Grishin E.V. (2006). Latarcins, antimicrobial and cytolytic peptides from the venom of the spider Lachesana tarabaevi (Zodariidae) that exemplify biomolecular diversity. J. Biol. Chem. 281 (30), 20983–92 [+]

    Семейство коротких линейных полипептидных молекул — латарцинов — было найдено в яде паука Lachesana tarabaevi, часть из них была получена химическим синтезом и исследована на антибактериальное действие. Бактерицидная активность латарцинов соответствовала лучшим антимикробным пептидам, обнаруженным у различных видов животных. Большой терапевтический потенциал этих простых по структуре полипептидных молекул будет реализован, с большой долей вероятности, в самое ближайшее время.

    ID:86
  18. Kozlov S., Malyavka A., McCutchen B., Lu A., Schepers E., Herrmann R., Grishin E. (2005). A novel strategy for the identification of toxinlike structures in spider venom. Proteins 59 (1), 131–40 [+]

    We compared two different approaches to sequence information analysis from the expressed sequence tag (EST) library constructed for the venom glands of the spider Agelena orientalis. Some results were more illustrative and reliable by the contig analysis technique, whereas our novel method, with specific structural markers introduced for protein structure detection, allowed us to overcome some limitations of the contig analysis. A novel technique was suggested for the identification in data banks of the spider's ion channel inhibitor toxins using primary structure features common to all spiders. Analysis of about 150 polypeptides made it possible to introduce 3 primary structure motifs for spider toxins: the Principal Structural Motif (PSM), which postulates the existence of 6 amino acid residues between the first and second cysteine residue and the Cys-Cys sequence at a distance of 5-10 amino acid residues from the second cysteine; the Extra Structural Motif (ESM), which postulates the existence of a pair of CXC fragments in the C-region; and the Processing Quadruplet Motif (PQM), which specifies the Arg residue at position -1 and Glu residues at positions -2, -3, and/or -4 in the precursor sequences just before the postprocessing site. In the processed data bank we found 48 toxinlike structures with ion channel inhibitor motifs. These include agelenin earlier isolated from Agelena opulenta and 25 more homologous sequences, 15 homologs of mu-agatoxin 2 from the spider Agelenopsis aperta, 3 structures with low homology to omega-agatoxin-IIIA, and 4 new structures. Also we showed that toxinlike structures exceed two thirds of the overall database sequences.

    ID:194
  19. Korolkova Y.V., Bocharov E.V., Angelo K., Maslennikov I.V., Grinenko O.V., Lipkin A.V., Nosyreva E.D., Pluzhnikov K.A., Olesen S.P., Arseniev A.S., Grishin E.V. (2002). New binding site on common molecular scaffold provides HERG channel specificity of scorpion toxin BeKm-1. J. Biol. Chem. 277 (45), 43104–9 [+]

    The scorpion toxin BeKm-1 is unique among a variety of known short scorpion toxins affecting potassium channels in its selective action on ether-a-go-go-related gene (ERG)-type channels. BeKm-1 shares the common molecular scaffold with other short scorpion toxins. The toxin spatial structure resolved by NMR consists of a short alpha-helix and a triple-stranded antiparallel beta-sheet. By toxin mutagenesis study we identified the residues that are important for the binding of BeKm-1 to the human ERG K+ (HERG) channel. The most critical residues (Tyr-11, Lys-18, Arg-20, Lys-23) are located in the alpha-helix and following loop whereas the "traditional" functional site of other short scorpion toxins is formed by residues from the beta-sheet. Thus the unique location of the binding site of BeKm-1 provides its specificity toward the HERG channel.

    ID:195
  20. Korolkova Y.V., Kozlov S.A., Lipkin A.V., Pluzhnikov K.A., Hadley J.K., Filippov A.K., Brown D.A., Angelo K., Strøbaek D., Jespersen T., Olesen S.P., Jensen B.S., Grishin E.V. (2001). An ERG channel inhibitor from the scorpion Buthus eupeus. J. Biol. Chem. 276 (13), 9868–76 [+]

    Первый селективный блокатор K+ каналов ERG-типа BeKm, выделенный из яда скорпиона Buthus eupeus, был экспрессирован в гетерологичной системе и его биологические свойства, а также свойства нескольких мутантных аналогов, были изучены на M-токах культуры клеток NG108-15. Анализ активности мутантных форм позволили установить наиболее значимые аминокислотные остатки в структуре токсина, а сам токсин стал первым опубликованным селективным ингибитором hERG каналов, который в настоящий момент продается на рынке биологических препаратов.

    ID:85

Козлов Сергей Александрович

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 51, комн. 363
  • Тел.: +7(495)336 4022
  • Эл. почта: serg@ibch.ru

Открыты первые пептидные лиганды, потенцирующие ответ TRPA1 рецепторов на агонисты, проявляющие обезболивающий и противовоспалительный эффекты. (2017-11-24)

Из морских анемон видов Metridium senile и Urticina eques выделены и охарактеризованы анальгетические пептиды Мs9а-1 и Ueq 12-1. Пептид Мs9а-1 содержит 35 аминокислотных остатков, а его пространственная структура стабилизирована двумя дисульфидными мостиками подобно ранее описанным  пептидам из морских анемон. Ueq 12-1 состоит из 45 аминокислотных остатков, включая 10 остатков цистеина с необычным распределением, образующих 5 дисульфидных связей, и является уникальным среди многообразия известных пептидов морских анемон. Являясь по сути принципиально новой обнаруженной пространственной структурой, пространственная укладка части полипептидной цепи молекулы Ueq 12-1 похожа на альфа дефензины млекопитающих. Возможно, именно поэтому пептид также обладает слабым антимикробным действием на грамм-положительные бактерии. Структурно непохожие друг не друга пептиды Мs9а-1 и Ueq 12-1 имеют схожий механизм действия и одну биологическую мишень. В тестах in vitro на ооцитах лягушки Xenopus laevis и клетках млекопитающих, экспрессирующих рецептор TRPA1, оба пептида усиливали действие прямых агонистов, таких как AITC и диклофенак. В тестах in vivo на мышах введение пептидов внутривенно давало значительный анальгетический и противовоспалительный эффект, при этом сами пептиды при введении не вызывали ни болевых ощущений ни тепловую гиперчувствительность. Обнаруженные эффекты пептидов связаны с тем, что при взаимодействии с TRPA1 пептиды делают рецептор более восприимчивым к распознаванию своих агонистов (потенцирующее действие), таким образом, при появлении эндогенных раздражителей, таких как, например, медиаторы воспаления, происходит десенситизация TRPA1-экспрессирующих нейронов. Способность этих веществ избирательно усиливать активность белка TRPA1 открывает новые возможности фундаментальных исследований и служит основой создания лекарств от боли и воспаления.

Публикации

  1. Logashina Y.A., Solstad R.G., Mineev K.S., Korolkova Y.V., Mosharova I.V., Dyachenko I.A., Palikov V.A., Palikova Y.A., Murashev A.N., Arseniev A.S., Kozlov S.A., Stensvåg K., Haug T., Andreev Y.A. (2017). New Disulfide-Stabilized Fold Provides Sea Anemone Peptide to Exhibit Both Antimicrobial and TRPA1 Potentiating Properties. Toxins (Basel) 9 (5), [+]

    A novel bioactive peptide named τ-AnmTx Ueq 12-1 (short name Ueq 12-1) was isolated and characterized from the sea anemone Urticina eques. Ueq 12-1 is unique among the variety of known sea anemone peptides in terms of its primary and spatial structure. It consists of 45 amino acids including 10 cysteine residues with an unusual distribution and represents a new group of sea anemone peptides. The 3D structure of Ueq 12-1, determined by NMR spectroscopy, represents a new disulfide-stabilized fold partly similar to the defensin-like fold. Ueq 12-1 showed the dual activity of both a moderate antibacterial activity against Gram-positive bacteria and a potentiating activity on the transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1). Ueq 12-1 is a unique peptide potentiator of the TRPA1 receptor that produces analgesic and anti-inflammatory effects in vivo. The antinociceptive properties allow us to consider Ueq 12-1 as a potential analgesic drug lead with antibacterial properties.

    ID:1914
  2. Logashina Y.A., Mosharova I.V., Korolkova Y.V., Shelukhina I.V., Dyachenko I.A., Palikov V.A., Palikova Y.A., Murashev A.N., Kozlov S.A., Stensvåg K., Andreev Y.A. (2017). Peptide from Sea Anemone Metridium senile Affects Transient Receptor Potential Ankyrin-repeat 1 (TRPA1) Function and Produces Analgesic Effect. J. Biol. Chem. 292 (7), 2992–3004 [+]

    The transient receptor potential ankyrin-repeat 1 (TRPA1) is an important player in pain and inflammatory pathways. It is a promising target for novel drug development for the treatment of a number of pathological states. A novel peptide producing a significant potentiating effect on allyl isothiocyanate- and diclofenac-induced currents of TRPA1 was isolated from the venom of sea anemone Metridium senile. It is a 35-amino acid peptide cross-linked by two disulfide bridges named τ-AnmTX Ms 9a-1 (short name Ms 9a-1) according to a structure similar to other sea anemone peptides belonging to structural group 9a. The structures of the two genes encoding the different precursor proteins of Ms 9a-1 were determined. Peptide Ms 9a-1 acted as a positive modulator of TRPA1 in vitro but did not cause pain or thermal hyperalgesia when injected into the hind paw of mice. Intravenous injection of Ms 9a-1 (0.3 mg/kg) produced a significant decrease in the nociceptive and inflammatory response to allyl isothiocyanate (the agonist of TRPA1) and reversed CFA (Complete Freund's Adjuvant)-induced inflammation and thermal hyperalgesia. Taken together these data support the hypothesis that Ms 9a-1 potentiates the response of TRPA1 to endogenous agonists followed by persistent functional loss of TRPA1-expressing neurons. We can conclude that TRPA1 potentiating may be useful as a therapeutic approach as Ms 9a-1 produces significant analgesic and anti-inflammatory effects in mice models of pain.

    ID:1928

Впервые охарактеризованы эндогенные лиганды рецептора ASIC3, способные активировать канал без участия протонов, а также выводить ASIC3 человека из состояния десенситизации при физиологических значениях pH. (2017-11-24)

Найдены первые активаторы кислото-чувствительных каналов ASIC, обладающие уникальным, ранее не описанным механизмом действия. Изохинолиновые алкалоиды (THP, ретикулин), которые синтезируются клетками млекопитающих как промежуточные продукты в цикле синтеза эндогенного морфина из тирозина, в милимолярных концентрациях способны возвращать канал ASIC3 из протон-опосредованной десенсибилизации, и одновременно эффективно активировать hASIC3 и rASIC3 при физиологическом рН 7.4 и слабо щелочных условиях. До настоящего момента был описан очень ограниченный набор активаторов ASICs, при чем описанные агонисты главным образом сдвигают активационную способность каналов в область более высоких значений рН, делая рецепторы более чувствительными к меньшим скачкам рН, при этом вклад протонов в процесс открытия каналов рассматривался как основной. Охарактеризованные и зохинолиновые алкалоиды — первые «непротонные» активаторы ASIC3 рецепторов.

При фармакологической характеристике «непротонных» активаторов на изоформы ASIC3 человека и грызунов было выявлено сильное функциональное различие в действии на каналы крысы (незначительный эффект) и человека (сильная потенциация ответа на закисление), что поставило под вопрос эффективность действия известных лигандов, охарактеризованных на животных моделях, при переносе их в клинические исследования.

Также, был сформулирован новый подход к разработке принципиально новых анальгетиков. Найденные лиганд-опосредованные взаимодействия двух систем: ноцицепции (ASIC3) и анти-ноцицепции (опиоидные рецепторы), по нашему мнению, могут находиться во взаимно сбалансированном состоянии, так что ингибирование или активация ферментов в каскаде биосинтеза эндогенного морфина может сдвигать равновесие в ту или иную сторону, приводя к анальгезии или гиперальгезии.

Каналы ASIC играют важную роль не только в ноцицепции, но и в передаче нервного возбуждения, синаптической пластичности, процессах обучения и гибели нейронов. Открытие эндогенных «непротонных» активаторов доказывает существование нескольких путей регуляции этих каналов. Пока не понятно, который из них может в большей степени быть реализован в ЦНС, не исключено, что закисление внеклеточной среды — неосновной путь регуляции. Ответ на этот вопрос будет получен при изучении найденных нами лигандов в модельных экспериментах.

Публикации

  1. Osmakov D.I., Koshelev S.G., Andreev Y.A., Kozlov S.A. (2017). Endogenous Isoquinoline Alkaloids Agonists of Acid-Sensing Ion Channel Type 3. Front Mol Neurosci 10, 282 [+]

    Acid-sensing ion channels (ASICs) ASIC3 expressed mainly in peripheral sensory neurons play an important role in pain perception and inflammation development. In response to acidic stimuli, they can generate a unique biphasic current. At physiological pH 7.4, human ASIC3 isoform (hASIC3) is desensitized and able to generate only a sustained current. We found endogenous isoquinoline alkaloids (EIAs), which restore hASIC3 from desensitization and recover the transient component of the current. Similarly, rat ASIC3 isoform (rASIC3) can also be restored from desensitization (at pH < 7.0) by EIAs with the same potency. At physiological pH and above, EIAs at high concentrations were able to effectively activate hASIC3 and rASIC3. Thus, we found first endogenous agonists of ASIC3 channels that could both activate and prevent or reverse desensitization of the channel. The decrease of EIA levels could be suggested as a novel therapeutic strategy for treatment of pain and inflammation.

    ID:1932

Установлен разнонаправленный механизм действия пептидных модуляторов TRPV1 рецептора в различных условиях активации рецептора. (2017-11-24)

Изучено действие полипептидов APHC1, APHC2 и APHC3, ранее выделенных из морской анемоны Heteractis crispa, на рецепторы rTRPV1, экспрессированные в клетках CHO, с использованием методов электрофизиологии, флуоресцентной спектроскопии и молекулярного моделирования. Установлено, что APHCs потенцируют ответ TRPV1, вызванный низкими (3-300 нМ) концентрациями специфичного агониcта — капсаицина, и ингибируют ответы при высоких (>3.0 мкМ) концентрациях активатора. Были также найдены зависимости действия пептидов на TRPV1 при варьировании активаторов, таких как: 2APB и протоны, и на комбинированные активационные стимулы. В итоге, был установлен бимодальный механизм действия APHCs, зависящий от силы активируюшего стимула, — потенцирование малоамплитудных ответов рецептора и отсутствие эффекта/ингибирование высокоамплитудных ответов. Предложена двойная «шлюзовая» модель активации TRPV1, которая предполагает, что APHC-полипептиды могут стабилизировать промежуточное состояние во время активации рецептора. Методом молекулярного моделирования установлен предполагаемый сайт связывания пептидов между парами внешних P-петель TRPV1.

Модуляторы с дуалистическим эффектом могут иметь определенное преимущество с точки зрения их практического медицинского применения, такие соединения не тормозят нормальную работу рецептора, однако, в случае патологически сильной активации производят желаемый терапевтический эффект.

Публикации

  1. Nikolaev M.V., Dorofeeva N.A., Komarova M.S., Korolkova Y.V., Andreev Y.A., Mosharova I.V., Grishin E.V., Tikhonov D.B., Kozlov S.A. (2017). TRPV1 activation power can switch an action mode for its polypeptide ligands. PLoS ONE 12 (5), e0177077 [+]

    TRPV1 (vanilloid) receptors are activated by different types of stimuli including capsaicin, acidification and heat. Various ligands demonstrate stimulus-dependent action on TRPV1. In the present work we studied the action of polypeptides isolated from sea anemone Heteractis crispa (APHC1, APHC2 and APHC3) on rat TRPV1 receptors stably expressed in CHO cells using electrophysiological recordings, fluorescent Ca2+ measurements and molecular modeling. The APHCs potentiated TRPV1 responses to low (3-300 nM) concentrations of capsaicin but inhibited responses to high (>3.0 μM) concentrations. The activity-dependent action was also found for TRPV1 responses to 2APB and acidification. Thus the action mode of APHCs is bimodal and depended on the activation stimuli strength-potentiation of low-amplitude responses and no effect/inhibition of high-amplitude responses. The double-gate model of TRPV1 activation suggests that APHC-polypeptides may stabilize an intermediate state during the receptor activation. Molecular modeling revealed putative binding site at the outer loops of TRPV1. Binding to this site can directly affect activation by protons and can be allosterically coupled with capsaicin site. The results are important for further investigations of both TRPV1 and its ligands for potential therapeutic use.

    ID:1930

Из яда паука Tibellus oblongus выделен и охарактеризован новый инсекто-специфичный токсин, обладающий «динамическим эпитопом». (2016-03-28)

Новый дисульфид-содержащий полипептидный токсин с мотивом пространственной укладки ICK был обнаружен в яде паука Tibellus oblongus. Методами электрофизиологии для нового полипептида была определена биологическая мишень - пресинаптический Са-канал несекомых. Токсин не действовал на препараты из млекопитающих и позвоночных, поэтому получил название ω-Тbo-IT1. ЛД50  нового инсектотоксина составило 11.7 мкг/г на личинках домашней мухи Musca domestica и 20 мкг/г на ювенильный особях тараканов Gromphadorhina portentosa. Методами электрофизиологии было показано обратимое концентрационно-зависимое ингибирование ω-Тbo-IT1 вызванных возбуждающих постсинаптических токов в нейромышечных препаратах мясной мухи Calliphora vicina  (IC50=40±10 нм и коэффициентом Хилла 3.4±0.3) и отсутствие эффекта пептида на спонтанные токи. Анализ пространственной структуры рекомбинантного ω-Тbo-IT1 методом ЯМР-спектроскопии в водном растворе показал, что токсин состоит из нескольких β-шпилечных петель. Две такие петли - длинная и короткая - в водном растворе способны совершать взаимные колебания, которые мы назвали “scissors-like mutual motions”. Такая обнаруженная пластичность молекулы («динамический эпитоп») может играть решающую роль в связывании/распознавании рецептора.

Публикации

  1. Mikov A.N., Fedorova I.M., Potapieva N.N., Maleeva E.E., Andreev Y.A., Zaitsev A.V., Kim K.K., Bocharov E.V., Bozin T.N., Altukhov D.A., Lipkin A.V., Kozlov S.A., Tikhonov D.B., Grishin E.V. (2015). ω-Tbo-IT1-New Inhibitor of Insect Calcium Channels Isolated from Spider Venom. Sci Rep 5, 17232 [+]

    Novel disulfide-containing polypeptide toxin was discovered in the venom of the Tibellus oblongus spider. We report on isolation, spatial structure determination and electrophysiological characterization of this 41-residue toxin, called ω-Tbo-IT1. It has an insect-toxic effect with LD50 19 μg/g in experiments on house fly Musca domestica larvae and with LD50 20 μg/g on juvenile Gromphadorhina portentosa cockroaches. Electrophysiological experiments revealed a reversible inhibition of evoked excitatory postsynaptic currents in blow fly Calliphora vicina neuromuscular junctions, while parameters of spontaneous ones were not affected. The inhibition was concentration dependent, with IC50 value 40 ± 10 nM and Hill coefficient 3.4 ± 0.3. The toxin did not affect frog neuromuscular junctions or glutamatergic and GABAergic transmission in rat brains. Ca(2+) currents in Calliphora vicina muscle were not inhibited, whereas in Periplaneta americana cockroach neurons at least one type of voltage gated Ca(2+) current was inhibited by ω-Tbo-IT1. Thus, the toxin apparently acts as an inhibitor of presynaptic insect Ca(2+) channels. Spatial structure analysis of the recombinant ω-Tbo-IT1 by NMR spectroscopy in aqueous solution revealed that the toxin comprises the conventional ICK fold containing an extended β-hairpin loop and short β-hairpin loop which are capable of making "scissors-like mutual motions".

    ID:1341

На примере одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg.) впервые показано наличие у растений антимикробного пептида из группы гликопептидов, богатого остатками пролина/гидроксипролина (2016-03-28)

Комбинацией методов автоматического N-концевого секвенирования по Эдману, аминокислотного анализа и нисходящей тандемной масс-спектрометрии определена полная аминокислотная последовательность нового узко специфичного антимикробного пролин/гидроксипролин-богатого, не содержащего остатков цистеина гликопептида, выделенного из цветков одуванчика лекарственного (T. officinale). Установлено наличие гликозилирования данной молекулы пентозами исключительно по остаткам гидроксипролина. Определение спектров кругового дихроизма позволило установить формирование пространственной организации данного гликопептида преимущественно в виде полипролиновой спирали. Высокая специфичность действия нового гликополипептида определяется ингибированием грибов-микромицетов с пигментированной (меланизированной) клеточной стенкой, что может обуславливать механизм его молекулярного действия. При этом экспериментально установлено, что тотальное дегликозилирование не приводит в существенному снижению его антимикробной активности на уровне показателя ИК50. Выделенная молекула является первым примером наличия у растений так называемых потенциальных "гликопептидных антибиотиков" - компонентов врожденной иммунной системы.

Публикации

  1. Astafieva A.A., Enyenihi A.A., Rogozhin E.A., Kozlov S.A., Grishin E.V., Odintsova T.I., Zubarev R.A., Egorov T.A. (2015). Novel proline-hydroxyproline glycopeptides from the dandelion (Taraxacum officinale Wigg.) flowers: de novo sequencing and biological activity. Plant Sci. 238, 323–9 [+]

    Two novel homologous peptides named ToHyp1 and ToHyp2 that show no similarity to any known proteins were isolated from Taraxacum officinale Wigg. flowers by multidimensional liquid chromatography. Amino acid and mass spectrometry analyses demonstrated that the peptides have unusual structure: they are cysteine-free, proline-hydroxyproline-rich and post-translationally glycosylated by pentoses, with 5 carbohydrates in ToHyp2 and 10 in ToHyp1. The ToHyp2 peptide with a monoisotopic molecular mass of 4350.3Da was completely sequenced by a combination of Edman degradation and de novo sequencing via top down multistage collision induced dissociation (CID) and higher energy dissociation (HCD) tandem mass spectrometry (MS(n)). ToHyp2 consists of 35 amino acids, contains eighteen proline residues, of which 8 prolines are hydroxylated. The peptide displays antifungal activity and inhibits growth of Gram-positive and Gram-negative bacteria. We further showed that carbohydrate moieties have no significant impact on the peptide structure, but are important for antifungal activity although not absolutely necessary. The deglycosylated ToHyp2 peptide was less active against the susceptible fungus Bipolaris sorokiniana than the native peptide. Unique structural features of the ToHyp2 peptide place it into a new family of plant defense peptides. The discovery of ToHyp peptides in T. officinale flowers expands the repertoire of molecules of plant origin with practical applications.

    ID:1474