Лаборатория структурной биохимии

Лаборатория организована в 2001 году для изучения биогенеза рибосом и участия в этом процессе важнейшего компонента ядер  клеток млекопитающих и человека – ядрышек. В настоящее время проводимые в лаборатории исследования направлены на решение фундаментальных вопросов, связанных с выяснением роли ядрышек в образовании рибосом, а также его участии в других жизненно-важных процессах, включая регуляцию клеточного цикла и пролиферации.  С практической точки зрения эти исследования способствуют выявлению новых – ядрышковых – маркеров злокачественной трансформации клеток и потенциальных мишеней в генной терапии рака, выяснению механизмов индукции аутоантител ядрышковыми белками, а также разработке неинвазивных подходов для тестирования новых лекарственных препаратов, влияющих на процессы, происходящие с участием ядрышка.

Иммуноцитохимическая локализация ключевых ядрышковых белков: UBF (специфический кофактор РНК полимеразы I; слева), фибрилларина (фактор раннего процессинга рРНК и основная ядрышковая метилтрансферазаж в центре) и B23/NPM1/нуклеофозмина (многофункциональный белок; справа) в опухолевых клетках человека HeLa. Голубым цветом показан хроматин, ЯК – ядрышко.

Лаборатория сотрудничает с другими лабораториями Института, а также с Биологическим факультетом МГУ, Факультетом биоинженерии и биоинформатики МГУ, НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Институтом химической физики им. Н.Н. Семенова РАН,  Институтом биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Институтом молекулярной генетики РАН, Институтом цитологии РАН,  Ягеллонским университетом в Кракове (Польша), Институтом клеточных и молекулярных исследований Бартс-Лондонской школы медицины и стоматологии (Великобритания),  Университетом в г. Павия (Италия), Университетом им. Клода Бернара в г. Лион (Франция) и др.

• Изучение особенностей состояния  и функционирования ядрышковых белков, участвующих в биогенезе рибосом и регуляции пролиферации, в разных типах нормальных и опухолевых клеток человека.

• Выявление наиболее динамичных ядрышковых белков, локализация и свойства которых изменяются в присутствии ингибиторов клеточного метаболизма, включая ингибиторы транскрипции, трансляции и окислительный стресс. Изучение специфичности ядрышкового ответа на разные воздействия методами современной микроскопии.

• Разработка лабораторной модели для изучения механизмов системных аутоиммунных заболеваний человека и роли в этом процессе ядрышковых белков, выступающих в качестве аутоантигенов. Изучение способности анти-ядрышковых аутоиммунных антител проникать внутрь живых клеток разных органов.

• Изучение роли ядрышко-подобных телец, формирующихся в ооцитах и ранних зародышах млекопитающих вместо нормальных ядрышек, в образовании рибосом и их влияния на способность клеток к созреванию и развитию. Выявление маркеров компетентности ооцитов и ранних зародышей млекопитающих к полноценному развитию.

1. Выявлены олигомерные формы многофункционального ядрышкового белка В23/ NPM1/нуклеофозмина, специфические для разных типов опухолевых клеток. Получены антитела к основным изоформам В23 (B23.1 и B23.2) человека (совместно с проф. О.М. Вольпиной).

2. Впервые доказано, что эволюционно-консервативный фактор процессинга рРНК, ядрышковый белок SURF6 принимает участие в регуляции клеточной пролиферации и является новым – сверхранним – маркером бласт-трансформации лимфоцитов in vitro.  Установлено, что уровень экспрессии SURF6 повышен у больных лимфопролиферативными заболеваниями. Эти данные позволяют рассматривать SURF6 в качестве нового прогностического маркера при лимфолейкозах.

3. Предложена экспериментальная модель для индукции системных аутоиммунных болезней человека, сопровождающаяся выработкой анти-ядрышковых антител, с помощью регулярных инъекций HgCl2 инбредным мышам линии SJL. Модель была успешно использована для скрининга новых иммуносупрессоров (совместно с др. М.С. Красильщиковой и проф. В.И. Дейгиным).

4. Выявлены параметры, влияющие на оценку динамических характеристик белков в ядрышках живых клеток методом FRAP (fluorescence recovery after photobleaching).

5. Впервые показано, что ядрышко-подобные тельца предовуляторных ооцитов млекопитающих (на примере ооцитов мыши) содержат все ключевые белки и рРНК нормальных ядрышек, т.е. способны к биогенезу рибосом.

6. Доказано, что, несмотря на морфологическое сходство, «ядрышки» ооцитов и ранних зародышей млекопитающих различаются по составу, т.е. выполняют разные функции.

7. Разработаны критерии для оценки компетентности ооцитов к мейотическому созреванию.

Избранные публикации

  1. Shishova K.V., Khodarovich Y.M., Lavrentyeva E.A., Zatsepina O.V. (2016). Data on morphology, large-scale chromatin configuration and the occurrence of proteins and rRNA in nucleolus-like bodies of fully-grown mouse oocytes in different fixatives. Data Brief 7, 1179–84 [+]

    Here we provide data on accessibility of nucleolus-like bodies (NLBs) of fully-grown (GV) mouse oocytes to fluorescence in situ hybridization (FISH) probes and anti-nucleolar antibodies as well as on oocyte general morphology and large scale chromatin configuration, which relate to the research article "High-resolution microscopy of active ribosomal genes and key members of the rRNA processing machinery inside nucleolus-like bodies of fully-grown mouse oocytes" (Shishova et al., 2015 [1]). Experimental factors include: a cross-linking reagent formaldehyde and two denaturing fixatives, such as 70% ethanol and a mixture of absolute methanol and glacial acetic acid (3:1, v/v).

    ID:1543
  2. Астафьев А.А., Залесский А.Д., Зацепина О.В., Костров А.Н., Кривохарченко А.С., Осыченко А.А., Серобян Г.А., Надточенко В.А. (2016). Воздействие остросфокусированного фемтосекундного лазерного излечения на ядрышкоподобное тельце GV ооцитов и способность ооцитов мыши к созреванию. ДАН 467 (5), 602–606 ID:1552
  3. Fulka H., Kyogoku H., Zatsepina O., Langerova A., Fulka J. Jr (2015). Can Nucleoli Be Markers of Developmental Potential in Human Zygotes? Trends Mol Med 21 (11), 663–72 [+]

    In 1999, Tesarik and Greco reported that they could predict the developmental potential of human zygotes from a single static evaluation of their pronuclei. This was based on the distribution and number of specific nuclear organelles - the nucleoli. Recent studies in mice show that nucleoli play a key role in parental genome restructuring after fertilization, and that interfering with this process may lead to developmental failure. These studies thus support the Tesarik-Greco evaluation as a potentially useful method for selecting high-quality embryos in human assisted reproductive technologies. In this opinion article we discuss recent evidence linking nucleoli to parental genome reprogramming, and ask whether nucleoli can mirror or be used as representative markers of embryonic parameters such as chromosome content or DNA fragmentation.

    ID:1542
  4. Shishova K.V., Khodarovich Y.M., Lavrentyeva E.A., Zatsepina O.V. (2015). High-resolution microscopy of active ribosomal genes and key members of the rRNA processing machinery inside nucleolus-like bodies of fully-grown mouse oocytes. Exp. Cell Res. 337 (2), 208–18 [+]

    Nucleolus-like bodies (NLBs) of fully-grown (germinal vesicle, GV) mammalian oocytes are traditionally considered as morphologically distinct entities, which, unlike normal nucleoli, contain transcribed ribosomal genes (rDNA) solely at their surface. In the current study, we for the first time showed that active ribosomal genes are present not only on the surface but also inside NLBs of the NSN-type oocytes. The "internal" rRNA synthesis was evidenced by cytoplasmic microinjections of BrUTP as precursor and by fluorescence in situ hybridization with a probe to the short-lived 5'ETS segment of the 47S pre-rRNA. We further showed that in the NLB mass of NSN-oocytes, distribution of active rDNA, RNA polymerase I (UBF) and rRNA processing (fibrillarin) protein factors, U3 snoRNA, pre-rRNAs and 18S/28S rRNAs is remarkably similar to that in somatic nucleoli capable to make pre-ribosomes. Overall, these observations support the occurrence of rDNA transcription, rRNA processing and pre-ribosome assembly in the NSN-type NLBs and so that their functional similarity to normal nucleoli. Unlike the NSN-type NLBs, the NLBs of more mature SN-oocytes do not contain transcribed rRNA genes, U3 snoRNA, pre-rRNAs, 18S and 28S rRNAs. These results favor the idea that in a process of transformation of NSN-oocytes to SN-oocytes, NLBs cease to produce pre-ribosomes and, moreover, lose their rRNAs. We also concluded that a denaturing fixative 70% ethanol used in the study to fix oocytes could be more appropriate for light microscopy analysis of nucleolar RNAs and proteins in mammalian fully-grown oocytes than a commonly used cross-linking aldehyde fixative, formalin.

    ID:1540
  5. Lavrentyeva E., Shishova K., Kagarlitsky G., Zatsepina O. (2015). Localisation of RNAs and proteins in nucleolar precursor bodies of early mouse embryos. Reprod. Fertil. Dev. , [+]

    Early embryos of all mammalian species contain morphologically distinct but transcriptionally silent nucleoli called the nucleolar precursor bodies (NPBs), which, unlike normal nucleoli, have been poorly studied at the biochemical level. To bridge this gap, here we examined the occurrence of RNA and proteins in early mouse embryos with two fluorochromes - an RNA-binding dye pyronin Y (PY) and the protein-binding dye fluorescein-5'-isothiocyanate (FITC). The staining patterns of zygotic NPBs were then compared with those of nucleolus-like bodies (NLBs) in fully grown surrounded nucleolus (SN)-type oocytes, which are morphologically similar to NPBs. We show that both entities contain proteins, but unlike NLBs, NPBs are significantly impoverished for RNA. Detectable amounts of RNA appear on the NPB surface only after resumption of rDNA transcription and includes pre-rRNAs and 28S rRNA as evidenced by fluorescence in situ hybridisation with specific oligonucleotide probes. Immunocytochemical assays demonstrate that zygotic NPBs contain rRNA processing factors fibrillarin, nucleophosmin and nucleolin, while UBF (the RNA polymerase I transcription factor) and ribosomal proteins RPL26 and RPS10 are not detectable. Based on the results obtained and data in the contemporary literature, we suggest a scheme of NPB assembly and maturation to normal nucleoli that assumes utilisation of maternally derived nucleolar proteins but of nascent rRNAs.

    ID:1541
  6. Станишевская И.Е., Кордюкова М.Ю., Владимирова Н.М., Миронова А.А., Станишевский Я.М., Зацепина О.В. (2015). Перспективы использования протеомных бионаносистем в персонифицированной медицине. Разраб.Регистр.Лек.Ср. 1 (10), 60–63 [+]

    Яд­рышко­вые бел­ки пред­став­ля­ют со­бой уни­каль­ную про­те­ом­ную би­она­носис­те­му, вклю­ча­ющую груп­пу внут­рикле­точ­ных бел­ков у мле­копи­та­ющих и че­лове­ка. Их изу­чение спо­собс­тву­ет ре­шению мно­гих на­уч­но-прак­ти­чес­ких за­дач, от вы­яс­не­ния ме­ханиз­мов ре­гуля­ции би­оге­неза ри­босом в опу­холе­вых клет­ках до раз­ра­бот­ки ин­но­ваци­он­ных спо­собов ге­ноте­рапии ра­ка и тес­ти­рова­ни­яп­ро­тиво­опу­холе­вых средств. При­мене­ние про­те­ом­ных би­она­носис­тем поз­во­лит сфор­му­лиро­вать но­вые под­хо­ды к пер­со­нали­зации ле­чения он­ко­боль­ных, а так­же обес­пе­чить ус­ло­вия для сни­жения сто­имос­ти ока­зания им эф­фектив­ной ме­дицин­ской по­мощи.

    ID:1550
  7. Шишова К.В., Ходарович Ю.М., Лаврентьева Е.А., Зацепина О.В. (2015). Анализ локализации фибрилларина и мест синтеза пре-рРНК в ядрышко-подобных тельцах GV ооцитов мыши после умеренной обработки протеиназой К. Онтогенез 46 (3), 162–173 ID:1551
  8. Shishova K.V., Lavrentyeva E.A., Dobrucki J.W., Zatsepina O.V. (2015). Nucleolus-like bodies of fully-grown mouse oocytes contain key nucleolar proteins but are impoverished for rRNA. Dev. Biol. 397 (2), 267–81 [+]

    It is well known that fully-grown mammalian oocytes, rather than typical nucleoli, contain prominent but structurally homogenous bodies called "nucleolus-like bodies" (NLBs). NLBs accumulate a vast amount of material, but their biochemical composition and functions remain uncertain. To clarify the composition of the NLB material in mouse GV oocytes, we devised an assay to detect internal oocyte proteins with fluorescein-5-isothiocyanate (FITC) and applied the fluorescent RNA-binding dye acridine orange to examine whether NLBs contain RNA. Our results unequivocally show that, similarly to typical nucleoli, proteins and RNA are major constituents of transcriptionally active (or non-surrounded) NLBs as well as of transcriptionally silent (or surrounded) NLBs. We also show, by exposing fixed oocytes to a mild proteinase K treatment, that the NLB mass in oocytes of both types contains nucleolar proteins that are involved in all major steps of ribosome biogenesis, including rDNA transcription (UBF), early rRNA processing (fibrillarin), and late rRNA processing (NPM1/nucleophosmin/B23, nucleolin/C23), but none of the nuclear proteins tested, including SC35, NOBOX, topoisomerase II beta, HP1α, and H3. The ribosomal RPL26 protein was detected within the NLBs of NSN-type oocytes but is virtually absent from NLBs of SN-type oocytes. Taking into account that the major class of nucleolar RNA is ribosomal RNA (rRNA), we applied fluorescence in situ hybridization with oligonucleotide probes targeting 18S and 28S rRNAs. The results show that, in contrast to active nucleoli, NLBs of fully-grown oocytes are impoverished for the rRNAs, which is consistent with the absence of transcribed ribosomal genes in the NLB mass. Overall, the results of this study suggest that NLBs of fully-grown mammalian oocytes serve for storing major nucleolar proteins but not rRNA.

    ID:1539
  9. Миронова А.А., Барыкина Н.В., Зацепина О.В. (2014). Цитологический анализ реакции ядрышковой РНК и РНК-связывающих белков на действие окислительного стресса в клетках HeLa. Цитология 56 (7), 489–499 [+]

    Ядрышко – одна из наиболее пластичных органелл клетки, функциональное и структурное состояние которой изменяется в ответ на многие стрессовые воздействия. Однако сведения о состоянии ядрышка при окислительном стрессе остаются весьма ограниченными. В настоящей работе мы изучили локализацию ядрышковой РНК и двух РНК-связывающих ядрышковых белков: фибрилларина – раннего фактора процессинга рРНК – и нуклеофозмина/B23 – фактора сборки рибосом при действии на клетки HeLa 1 мМ Н2О2 до 4 ч включительно. Мы показали, что в используемых условиях Н2О2 не вызывает клеточной гибели, но ингибирует транскрипцию рДНК, уменьшает общее содержание РНК в клетках и 18S рРНК в ядрышках и приводит к перераспределению фибрилларина и нуклеофозмина в ядрах. На сегодняшний день сходные изменения в локализации фибрилларина описаны только после действия на клетки млекопитающих HgCl2. Изменения в расположении нуклеофозмина, наблюдаемые при окислительном стрессе, проявляются также при ингибировании транскрипции рДНК и ранних стадий процессинга рРНК. В целом результаты работы показывают, что реакция ядрышек опухолевых клеток человека HeLa в ответ на окислительный стресс отчетливо проявляется на цитологическом уровне.

    ID:1549
  10. Кордюкова Ю.М., Ползиков М.А., Шишова К.В., Зацепина О.В. (2014). Анализ белковых партнеров белка ядрышка человека SURF6 в клетках HeLa методом аффинной адсорбции. Биоорг. хим. 40 (4), 1–12 [+]

    Белки семейства SURF6 — это эволюционно-консервативные белки "домашнего хозяйства" эука-риот, однако функциональное значение SURF6 человека и его белковые партнеры до сих пор не установлены. В настоящей работе для ответа на эти вопросы мы использовали метод аффинной адсорбции (GST pull-down), а в качестве акцепторов — слитые с глутатион^-трансферазой (GST) ре-комбинантный SURF6 человека и рекомбинантный консервативный С-концевой домен Surf6 мыши (Surf6-dom мыши), имеющий 85% подобия с С-консервативным доменом SURF6 человека. Результаты работы показали, что GST-SURF6 в клетках человека HeLa взаимодействует c факторами процессинга рРНК (В23/нуклеофозмином, нуклеолином, EBP2), а также с кофактором РНК-поли-меразы I, белком UBF. Эти же белковые партнеры связывались с GST-Surf6-dom. Данные наблюдения являются первыми экспериментальными свидетельствами в пользу участия SURF6 человека в биогенезе рибосом, включая транскрипцию рДНК и процессинг рРНК. Набор белковых партнеров GST-Surf6-dom в клетках HeLa указывает, кроме того, на возможное взаимодействие SURF6 человека c ядрышковыми и ядерными белками других функциональных групп, т.е. на его многофункциональность.

    ID:1547
  11. Кордюкова М.Ю., Ползиков М.А., Шишова К.В., Зацепина О.В. (2014). Функциональное значение белка ядрышка SURF6 человека – ключевого белка одноименного семейства эукариот. ДАН 455 (4), 1–3 ID:1548
  12. Ахидова Е.В., Волкова Т.Д., Короев Д.О., Якупов И.Ю., Завалишина Л.Э., Каплун А.П., Жарская О.О., Зацепина О.В., Вольпина О.М. (2013). Получение аффинноочищенных противопептидных антител к сурвивину для структурно-функциональных исследований белка. Биоорг. хим. 39 (3), 326–337 [+]

    Опухолеассоциированный белок сурвивин — это бифункциональный белок, который в зависимости от локализации в клетке и своего структурного состояния может участвовать либо в регуляции клеточного деления, либо в ингибировании апоптоза. Цель данной работы заключалась в получении моноспецифических антител к сурвивину, направленных к различным его участкам и пригодных для изучения структурно-функциональных особенностей белка. Изучена способность антител выявлять сурвивин в опухолевых клетках и тканях опухоли молочной железы. Показано, что наиболее высокой специфической активностью обладают антитела, направленные к участкам (1—22) и (95—105) белка. Антитела к участку (1—22) в условиях иммуноблота связываются преимущественно с сурвивинсодержащим комплексом, который, предположительно, является димером сурвивина, тогда как антитела к участку (95—105) выявляют только мономерную форму белка. Исследование образцов опухолей молочной железы показало, что мономер сурвивина присутствует только в образцах опухолевых тканей, тогда как сурвивинсодержащий комплекс экспрессируется как в опухолевых, так и в смежных с опухолью тканях. Показано, что в условиях иммуноцитохимии антитела к участку (1—22) выявляют преимущественно сурвивин ядерной локализации, участвующий в регуляции митоза, в то время как антитела к участку (95—105) дают окрашивание нуклеоплазмы и цитоплазмы на всех стадиях клеточного цикла. Таким образом, полученные антитела могут служить полезным инструментом для проведения структурно-функциональных исследований сурвивина.

    ID:1546
  13. Красильщикова М.С., Манских В.Н., Арефьева А.С., Зацепина О.В. (2013). Анализ реакции аутбредных мышей стока CFW на регулярные инъекции сублетальных доз хлорида ртути. Иммунология 34 (2), 95–100 [+]

    Одной из основных моделей системных аутоиммунных патологий человека является аутоиммунно-подобный процесс, индуцируемый у мышей инбредных линий (например, линии SJL/J) регулярными воздействиями сублетальных доз хлорида ртути (HgCl 2). Реакции, развиваемые животными в этих условиях, включают образование аутоантител к ядрышку, увеличение продукции суммарных иммуноглобулинов (прежде всего иммуноглобулинов подкласса IgG 1) и отложение иммунных комплексов в почках. Однако вопрос об особой генетической предрасположенности инбредных мышей к воздействию HgCl 2 до сих пор остается открытым. В настоящей работе мы проанализировали способность HgCl 2 индуцировать проявление основных признаков аутоиммунных реакций у мышей аутбредного стока CFW. Полученные результаты показали, что после 6 нед подкожных инъекций HgCl 2 в стандартной дозе 1,6 мг/кг у всех мышей отмечаются появление аутоантител к ядрышку в высоких титрах, отложение иммунных комплексов в почках и усиление продукции IgG 1 и IgE. Полученные данные позволяют заключить, что аутбредные мыши стока CFW воспроизводят основные признаки аутоиммунно-подобного процесса, индуцированного HgCl 2 у мышей инбредных линий, и могут быть использованы в качестве их альтернативы.

    ID:1545
  14. Polzikov M., Yakovenko S., Voznesenskaya J., Troshina M., Zatsepina O. (2012). Overexpression of ribosomal RNA in cumulus cells of patients with polycystic ovary syndrome. J. Assist. Reprod. Genet. 29 (10), 1141–5 [+]

    To evaluate the level of ribosomal RNA (rRNA) in cumulus cells (CCs) from women with polycystic ovary syndrome (PCOS) undergoing ICSI.

    ID:1553
  15. Polzikov M.A., Kordyukova M.Y., Zavalishina L.E., Magoulas C., Zatsepina O.V. (2012). Development of novel mouse hybridomas producing monoclonal antibodies specific to human and mouse nucleolar protein SURF-6. Hybridoma (Larchmt) 31 (1), 48–53 [+]

    SURF-6 is an evolutionarily conserved nucleolar protein that is important for cell viability; however, its function in mammals still remains uncertain. The aim of this study is to generate monoclonal antibodies to human SURF-6 protein suitable for fundamental and biomedical research. The full-size human SURF-6 was expressed as a recombinant GST-fusion protein and used as an antigen to generate monoclonal antibodies, S79 and S148, specific for SURF-6. The monoclonal antibody produced by hybridoma clone S79 specifically recognizes endogenous SURF-6 by Western and immunofluorescence analyses in various cultured human cells, and by immunohistochemistry in paraffin-embedded sections of human breast cancer samples. Moreover, S79 immunoprecipitates protein complexes containing SURF-6 from HeLa cells extracts. The antibody S79 recognizes SURF-6 only in human cells; however, the antibody produced by hybridoma clone S148 can detect SURF-6 of human and mouse origin. Monoclonal antibodies to the nucleolar protein SURF-6 described in this work can be a useful tool for studies of ribosome biogenesis in normal and cancer cells.

    ID:1537
  16. Барыгина В.В., Миронова А.А., Зацепина О.В. (2012). Параметры, влияющие на оценку подвижности белков ядрышка в живых клетках методом FRAP на примере белка фибрилларина. Цитология 54 (1), 17–24 [+]

    Метод FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) в сочетании с конфокальной лазерной сканирующей микроскопией является одним из основных подходов к изучению свойств белков в живых клетках млекопитающих. Однако данные разных авторов о динамическом состоянии одного и того же белка даже в клетках одного типа могут сильно различаться. Причины таких расхождений до сих пор специально не анализировались. В настоящей работе на примере белка ядрышка фибрилларина, слитого с EGFP, изучено влияние площади облучаемой области (region of interest, ROI) и температурных условий проведения эксперимента на основные динамические характеристики белка - долю мобильной фракции и время полу-восстановления флуоресценции (t1/2) после фотообесцвечивания. Полученные результаты показали, что оба параметра заметно влияют на оценку подвижности фибрилларина-EGFP в клетках HeLa. Сделано заключение, что при постановке экспериментов методом FRAP площадь ROI должна быть стандартизована и, по возможности, минимизирована. Кроме того, при анализе динамических характеристик белков ядрышка, участвующих в температуро-зависимых энзиматических реакциях, необходимо придерживаться стандартных температурных условий.

    ID:1544

Зацепина Ольга Владимировна

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 51, комн. 659
  • Тел.: +7(495)779-23-66
  • Эл. почта: zatsepina_olga@mail.ru