Одной из основных проблем, препятствующих эффективной борьбе с социально-значимыми инфекциями, вызываемыми патогенными микроорганизмами, является способность бактериальных патогенов приобретать устойчивость к традиционной терапии, основанной на использовании антибиотиков, как основного средства борьбы с бактериальными инфекциями. Мультирезистентные инфекции, устойчивые к широкому спектру антибиотиков, препятствуют рациональному использованию лекарственных средств в связи с необходимостью их постоянного обновления. Активность вновь создаваемых антибиотиков, как правило, направлена на довольно узкий, исторически сложившийся круг мишеней, к которым, в первую очередь, относятся ферменты биосинтеза клеточной стенки бактерий, бактериальные рибосомы, ферменты системы репликации и транскрипции и некоторые другие. Соответственно, вновь создаваемые препараты имеют минимальные отличия от своих предшественников и зачастую неспособны бороться с резистентными формами патогенов. Создание и введение в клиническую практику антибактериальных препаратов, отличных от традиционных антибиотиков по своей природе, механизмам действия и клеточным мишеням, является наиболее логичным путём рационализации борьбы с инфекционными заболеваниями бактериальной природы, который создаст предпосылки к переходу к высокотехнологичному здравоохранению. Данное направление биомедицинских исследований находится в процессе быстрого роста, так предполагаемый объём мирового рынка пептидных препаратов для лечения внутрибольничных мультирезистентных инфекций составит к 2021 году 33 млрд. $. Разработка подобных препаратов требует досконального изучение метаболических и/или сигнальных путей бактериальной клетки, которые являются мишенями воздействия, а также изучения защитных механизмов, позволяющих бактериальной клетке противостоять антибактериальной терапии. Конкретной задачей, на решение которой направлен проект, является исследование системы протеолитической деградации белков бактериальной клетки. Работа именно этой системы препятствует эффективному внедрению в клиническую практику антибактериальных препаратов белковой и пептидной природы. Планируемые исследования будут сфокусированы на ферментах, которые помимо своей основной метаболической функции играют роль в развитии вирулентности и резистентности микроорганизмов. К таким ферментам относятся АТР-зависимые Lon-протеазы бактерий – молекулярные машины, обеспечивающие сохранность протеома бактериальной клетки и регулирующие, в частности, качественный и количественный состав белков, ассоциированных с генетическим аппаратом бактерий (нуклеоидом), и соответственно адаптацию бактерий к неблагоприятным воздействиям (в том числе к антибактериальной терапии). Lon-протеазы освобождают клетки от потенциально опасных аномальных, дефектных и избыточных белков посредством их исчерпывающей деградации. Многие субстраты Lon-протеазы, включая гистоноподобные HU белки (HU), являются факторами вирулентности и/или резистентности бактериальной клетки, не исключено также прямое участие Lon в деградации антимикробных пептидов (АМП), способных проникать внутрь бактериальной клетки. В последние годы активно развиваются исследования по поискам ингибиторов Lon-протеазы, однако отсутствие чёткого понимания каким образом молекулярная машина осуществляет селективный отбор субстратов и незначительное количество, полученных на сегодня структурных данных осложняют работы по драг-дизайну. Второй группой исследуемых ферментов будут олигопептидазы В (OpB), представляющие собой малоизученную группу трипсиноподобных пептидаз бактерий, которые действуют на финальном этапе катаболизма (гидролиз олигопептидов) и обеспечивают защиту бактерий от АМП, включая пролин-богатые АМП (ПБ-АМП). Как и в случае Lon-протеазы, механизм каталитической активации бактериальных ОрВ слабо изучен, а структурные исследования находятся на начальной стадии. Таким образом, в проекте запланированы комплексные структурно-функциональные исследования системы протеолитической деградации бактериальной клетки на всём её протяжении, от начального этапа (расщепления белков до олигопептидов), на котором работает протеаза Lon, до финальных этапов катаболизма (расщепления олигопептидов до коротких пептидов и аминокислот), на котором функционируют OpB, а также исследования прямого участия ОрВ и Lon в протеолизе АМП не литического типа. Ключевым методическим подходом в ходе структурных исследований будет использование спектроскопии ЯМР высокого разрешения. Эти работы будут реализованы на базе центра коллективного пользования Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук – объекта научной инфраструктуры, используемого в рамках данного проекта. В результате выполнения проекта планируется восполнить имеющиеся пробелы в структурных исследованиях олигопептидаз В и Lon-протеаз, включая детальное описание и анализ структуры первой бактериальной ОрВ и уточнение структуры N-концевого домена Lon-протеазы. Исследования OpB будут сконцентрированы на изучении оригинального механизма активации OpB из S. proteomaculans (PSP) и определении его универсальности в бактериальном царстве. Новый механизм, во-первых, расширит фундаментальные знания о разнообразие механизмов протеолитической активации в семействе пролилолигопептидаз, во-вторых, позволит начать работы по поиску рациональных путей ингибирования протеолитической активности бактериальных ОрВ в отношении ПБ-АМП. Фокус исследований Lon-протеазы будет направлен на изучение перехода фермента от шаперонной к протеолитической активности и определение структурных особенностей белковых субстратов, которые регулируют этот переход. Выявление механизма селекции субстратов Lon-протеазой позволит начать поиск и разработку ингибиторов (пептидной природы или пептидомиметиков), способных влиять на вирулентность и резистентность микроорганизмов путём ингибирования протеолитической активности Lon-протеаз. В результате, полученные фундаментальные знания откроют новые возможности по разработке рациональных подходов повышения эффективности борьбы с инфекционными заболеваниями бактериальной природы.