Одной из важнейших задач современной биологии является выяснение механизмов работы различных белков не на уровне взаимодействий между молекулами, а на уровне пространственной структуры. Такие данные необходимы для рациональной инженерии белков с заданными свойствами, а также для разработки новых лекарственных средств. Особенный интерес в этой связи представляют мембранные белки, в частности, клеточные рецепторы, которые участвуют во множестве процессов жизнедеятельности клетки. Несмотря на свою очевидную важность, на сегодняшний день пространственная структура мембранных белков остается малоизученной. Основной научной проблемой, на решение которой направлен настоящий Проект, является выяснение механизмов функционирования сигнальных систем Толл-подобных рецепторов (TLR) на уровне пространственной структуры отдельных белков и их комплексов. TLR являются ключевыми участниками системы врожденного иммунитета. Активация TLR приводит к развитию иммунного ответа и воспаления, рецепторы семейства вовлечены в развитие ряда заболеваний, в том числе сепсиса, иммунодефицита, атеросклероза и астмы. Это делает TLR перспективными мишенями для разработки лекарственных средств направленного действия, более двадцати новых лекарств, воздействующих на TLR, уже сейчас находятся на различных фазах клинических испытаний. Несмотря на кажущуюся ясность, в области структурной биологии толл-подобных рецепторов осталось много неотвеченных вопросов. Так, не получены структуры TIR доменов шести представителей семейства, не описаны интерфейсы гомо- и гетеродимеризации TIR доменов для всех рецепторов семейства, кроме TLR10. Не изучены структуры комплексов между TIR доменами TLR и адаптерными белками, неясна структурная организация трансмембранных доменов и примембранных регионов большинства TLR. Не изучено структурное влияние доменов друг на друга в составе полноразмерного рецептора. В рамках Проекта предлагается заполнить большинство из перечисленных пробелов в структурной биологии TLR: исследовать структуру TIR доменов TLR в растворе, определить пространственные структуры трансмембранных доменов ряда TLR, изучить взаимодействия TIR доменов с ионами цинка, а также их внутримолекулярную подвижность. Планируется локализовать интерфейсы димеризации TIR доменов TLR, а также интерфейсы взаимодействия между TIR доменами TLR и адаптерными белками MyD88 и TIRAP. Изучить влияние димеризации TLR на взаимодействия их внутриклеточных доменов с адаптерными белками. Коллектив Проекта для исследования пространственных структур белков применяет метод спектроскопии ЯМР высокого разрешения. Данный метод имеет свои ограничения, преимущества и недостатки. Из преимуществ можно выделить возможность изучать поведение объектов исследования в растворе, при физиологических параметрах окружающей среды, при этом можно исследовать не только структуру, но и подвижность отдельных участков молекулы белка, что является важной информацией для изучения функционирования клеточных рецепторов. С другой стороны, существует необходимость мечения объектов исследования стабильными изотопами азота и углерода, а мембранные белки необходимо помещать в специализированное мембраноподобное окружение. Узким местом большинства таких исследований является получение изотопно-меченых препаратов белков в нативно свернутом состоянии. Решению данной проблемы в отношении внутриклеточных и трансмембранных доменов TLR и будет посвящена важная часть Проекта - будут разработаны подходы к получению внутриклеточных и трансмембранных доменов ряда TLR в нативном состоянии в бактериальных системах продукции, будут разрабатываться новые типы мембраноподобных сред на основе липодисков для обеспечения адекватного окружения. Наконец, на протяжении всего Проекта будет вестись разработка методов получения белковых конструкций, содержащих внутриклеточные и мембранные домены TLR. При этом, планируется использовать самые передовые технологии белкового лигирования и сегментного изотопного мечения. Таким образом, коллектив Проекта планирует получение важных результатов как в области белковой инженерии (разработка технологий продукции мембранных белков), так и в области структурной биологии (получение недостающей информации о структуре белков, участников сигнальных каскадов TLR). Все результаты работы будут оригинальными и не будут иметь мировых аналогов, работы будут выполнены на самом современном оборудовании с использованием недавних методов белковой инженерии и многомерной гетероядерной спектроскопии ЯМР в растворе и опубликованы в рецензируемых международных журналах.