Одной из важнейших задач современной биологии является выяснение механизмов работы различных белков не на уровне взаимодействий между молекулами, а на уровне пространственной структуры. Такие данные необходимы для рациональной инженерии белков с заданными свойствами, а также для разработки таргетных лекарственных средств. Особенный интерес в этой связи представляют мембранные белки (МБ), в частности, клеточные рецепторы, которые участвуют во множестве процессов жизнедеятельности клетки. Так, патологии в межклеточной сигнализации связаны с развитием ряда заболеваний, в том числе аутоиммунных, онкологических и нейродегенеративных. Несмотря на это, на сегодняшний день МБ остаются малоизученным классом объектов. Анализ базы данных пространственных структур PDB показывает, что лишь менее 10% полученных на настоящий момент структур принадлежит МБ. Это связано в первую очередь с методологическими трудностями. Наиболее проблемным этапом при исследовании пространственной структуры МБ является получение препаратов белков в нативно свернутом состоянии, в форме, пригодной для проведения экспериментов. Самым эффективным и экономичным способом получения МБ является их гетерологическая продукция в культурах бактерий. Однако, бактерии по большой части лишены тех механизмов, что позволяют клеткам эукариот правильным образом сворачивать МБ. В этой связи, многие МБ в бактериях синтезируются в составе агрегатов, в которых полипептидная цепь принимает ненативную структуру. Тогда применяется процедура рефолдинга или ренатурации, которая подразумевает денатурацию препарата белка с последующей ресолюбилизацией в средах, имитирующих мембранное окружение. Задача рефолдинга МБ на настоящий момент решается в единичных случаях, в первую очередь из-за отсутствия рационального подхода к выбору условий, при которых белок должен принимать нативную конформацию. Альтернативой является синтез рекомбинантных МБ в культурах клеток эукариот, однако такой подход сопряжен с существенным ростом издержек в связи с низкими выходами и высокой стоимостью компонентов культуральных сред. В случае использования спектроскопии ЯМР, из-за необходимости мечения белков стабильными изотопами азота и углерода, а также дейтерирования, продукция в клетках эукариот является чрезвычайно дорогим подходом, который могут себе позволить единичные лаборатории. В рамках предлагаемого Проекта планируется разработать и опробовать ряд новых методов получения рекомбинантных МБ в нативной конформации для исследования их пространственной структуры. Методики будут в первую очередь предназначены для применения при исследованиях методов ЯМР-спектроскопии высокого разрешения, однако ряд подходов могут применяться и в работах, выполняемых методами крио-электронной микроскопии. Для решения проблемы поиска параметров окружения при рефолдинге МБ предлагается изучить формирование частиц липид/детергент/белок в смесях органических растворителей с водой и разработать рациональные методики солюбилизации МБ в мембраноподобных средах, основанные на полученной информации. В качестве альтернативы рефолдингу планируется рассмотреть использование бесклеточных систем синтеза белков с ко-трансляционным встраиванием в новые мембраноподобные среды: бицеллы на основе сверхмягких детергентов Facade. Таким образом, коллектив Проекта планирует, двигаясь в двух различных направлениях, найти подходы к решению проблемы исследования МБ в нативно свернутом состоянии структурными методами. Все результаты работы будут оригинальными и не будут иметь мировых аналогов. Работы будут выполнены на самом современном оборудовании с использованием недавних методов белковой инженерии и многомерной гетероядерной спектроскопии ЯМР в растворе и опубликованы в рецензируемых международных журналах.