Солидные опухоли секретируют в кровоток большое количество высокогетерогенных циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК). Однако, только небольшая часть циркулирующих опухолевых клеток может выжить и в конечном итоге дать начало новой опухоли. Эффективное метастазирование (> 90%) ассоциировано с комплексами опухолевых клеток, иногда называемыми циркулирующими микроэмболиями опухоли, определяемыми как группы из двух или более ЦОК. В то время как отдельные ЦОК могут испытывать проблемы с выживанием, такие как окислительный стресс и иммунные эффекты, ведущие к апоптозу, ЦОК в комплексах остаются защищенными. Максимальным метастатическим потенциалом обладают опухолевые комплексы, содержащие опухоль-ассоциированные фибробласты (ОАФ), которые обеспечивают микросреду, благоприятную для выживания раковых клеток. Роль ОАФ в метастазировании широко изучена. Показано, что взаимодействия между ОАФ и раковыми клетками способствуют инвазии и метастазированию. ОАФ способны индуцировать образование метастазирующих опухолевых комплексов в том числе посредством белков межклеточной адгезии. Впервые метастазирующие опухолевые комплексы были найдены в асцитах пациенток с карциномой яичников. Находясь в брюшной полости, раковые клетки объединяются со свободно плавающими клетками миофибробластов, образуя гетеротипические комплексы. Это позволяет раковым клеткам выживать и приобретать более инвазивный фенотип. Несмотря на многочисленные исследования межклеточных взаимодействий в опухоли, механизмы взаимодействия ОАФ с раковыми клетками во время их коллективной миграции все еще далеки от понимания. В частности, остается нетронутым вопрос о том, формируются ли во время метастазирования кластеры взаимодействий (синаптоподобные структуры) между раковыми клетками и ОАФ и какие гены участвуют в их формировании. В ходе данного проекта будет предпринята попытка идентификации кластеров (синапсоподобных структур) взаимодействий раковых клеток и ОАФ при их совместном метастазировании, а также поиск возможностей для их разрушения. Идентификация синаптоподобных структур и генов, участвующих в их образовании, может дать начало новым подходам к лечению рака, разрушающим эти кластеры. Такие подходы смогут дополнить терапию с использованием иммунных контрольных точек, которая также направлена на нарушение взаимодействий между раковыми клетками и клетками иммунной системы. В проекте будут использованы самые современные методы молекулярной биологии: омиксные технологии (транскриптомный и протеомный анализ), методы геномного редактирования (в том числе CRISPR-Cas), конфокальная микроскопия, биоинформатический анализ (в том числе подход Connectivity Map). Исследование будет выполняться на раковых клетках и ОАФ, полученных из первичных и вторичных опухолей пациентов, в условиях in vitro (ко-культуры раковых клеток и ОАФ) и in vivo (ксенографтные опухолевые модели на nude/с мышах). В рамках данного проекта планируется решить следующие задачи: 1. На основе опубликованных данных транскриптомного и протеомного анализа циркулирующих в крови опухолевых комплексов выбрать поверхностные белки – кандидаты на роль посредников во взаимодействиях раковых и стромальных клеток в метастазирующих комплексах 2. Выделить раковые клетки из первичных опухолей и метастатических очагов пациентов с метастатическим раком. Провести сравнительный транскриптомный анализ раковых клеток из первичных очагов и из метастазов с целью выявления ключевых белков, осуществляющих взаимодействия между раковыми и стромальными клетками 3. Провести поиск кластеров (синаптоподобных структур) в 3D ко-культурах выделенных из опухолей раковых и стромальных клеток с помощью конфокальной микроскопии. Определить белковый состав найденных кластеров с помощью масс-спектрометрии. 4. Получить раковые клетки, в которых экспрессия выявленных генов, ответственных за образование кластеров, будет подавлена с помощью технологии геномного редактирования или генного нокдауна. Провести транскриптомный анализ, а также функциональные тесты подвижности и инвазивности нативных и полученных вариантов раковых клеток. Отобрать те гены, инактивация которых будет связана со снижением способности раковых клеток взаимодействовать с ОАФ и снижением их метастатического потенциала 5. Сравнить метастатический потенциал нативных и модифицированных раковых клеток путем прививания раковых клеток иммунодефицитным мышам. Это позволит выбрать гены кластеров, подавление которых оказывает наибольшее влияние на метастатический потенциал раковых клеток. 6. При помощи биоинформатического анализа, в том числе подхода Connectivity Map, предсказать препараты, оказывающие сходный с подавлением экспрессии выявленных генов эффект на раковые клетки. 7. В экспериментах in vitro провести сравнение эффектов предсказанных препаратов и подавления экспрессии выявленных генов на подвижность и инвазивность раковых клеток, а также на их способность взаимодействовать с фибробластами. Влияние таких препаратов на формирование кластеров между раковыми клетками и ОАФ будет изучено с помощью конфокальной микроскопии. Таким образом, в ходе проекта не только будут получены новые фундаментальные знания о раково-стромальных взаимодействиях, но также будут получены данные о влиянии изменений этих взаимодействий на прогрессию опухоли. Впервые будет проведена прямая проверка гипотезы о существовании синаптоподобной структуры между раковыми клетками и ОАФ. Такая информация может послужить основой для разработки новых или усовершенствования имеющихся терапевтических подходов, направленных на микроокружение опухоли.