Внеклеточные везикулы (микровезикулы и экзосомы) транспортируют белки, нуклеиновые кислоты и липиды от клетки к клетке, осуществляя таким образом коммуникацию между ними, при патологии – между нормальными и поврежденными (трансформированными или инфицированными), а также иммунными клетками. Внеклеточные везикулы рассматриваются как перспективный целенаправленный способ доставки лекарственных веществ, так как внеклеточные везикулы обладают мембраной, обеспечивающей сохранность переносимых ими биомолекул. Однако, фундаментальные аспекты переноса внеклеточных везикул исследованы недостаточно, в особенности транспорт гликосфинголипидов (ГСЛ), которые могут выполнять как роль «вектора» доставки, так и сами по себе быть терапевтическими молекулами. На сегодняшний день не ясно, как внеклеточные везикулы преодолевают слой гликокаликса, чтобы достичь плазматической мембраны клетки-акцептора, происходит ли связывание везикул с рецепторами на поверхности клетки-акцептора, всегда ли оказываются внеклеточные везикулы в составе клетки-акцептора в результате слияния двух мембран, или существуют альтернативные пути. Если судьба белков и нуклеиновых кислот после доставки внеклеточными везикулами к клетке акцептора исследована хорошо, то о ГСЛ информации практически нет, хотя липиды являются одним из основных компонентов внеклеточных везикул. Большая часть липидов переносится по везикулярному механизму, ГСЛ обнаруживаются в экзосомах. Однако, данных о трафике ГСЛ с помощью микровезикул практически нет. Хотя очевидно, что ГСЛ, составляющие 20% липидного состава плазматической мембраны, должны попадать в микровезикулы, которые образуются путем отпочкования от плазматической мембраны. В данном проекте мы будем целенаправленно изучать только микровезикулы, уделяя внимание экзосомам только в случае необходимости. Наиболее интригующими, и соответственно, требующими изучения, мы считаем два следующих явления. 1. Размер большинства внеклеточных везикул больше, чем размер пор в гликокаликсе эндотелиальных клеток, Тем не менее, внеклеточные везикулы преодолевают без особого сопротивления как гликокаликс клетки-донора, так и клетки-акцептора. 2. Отсутствуют экспериментальные данные, позволяющие обоснованно предположить, каков механизм селективности переноса ГСЛ. Принимая всё это во внимание, мы фокусируемся на всех трёх фазах переноса ГСЛ микровезикулами, а именно выходе из гликокаликса эндотелиальных клеток, перемещении в крови до клетки-акцептора, и прохождении через гликокаликс клетки-акцептора (клетками-акцепторами могут быть как другие участки эндотелия, так и клетки крови). Соответственно трем названным фазам, мы выделяем следующие задачи: • Стадия выхода. Прежде всего, необходимо знать, формируют ли ГСЛ патчи на клетке; нужно будет выяснить, представляют ли собой эти патчи просто скопления (агрегаты) микровезикул или какую-то особую форму их существования в гликокаликсе, позволяющую им легко проходить через этот физический барьер. • Стадия преодоления межклеточного пространства. Речь идет о моделировании процессов, протекающих в кровотоке, позволяющем изучать те или иные факторы переноса ГСЛ. В частности, оценивать устойчивость (время жизни) микровезикул в присутствии физиологической концентрации альбумина и липопротеинов, которые из общих соображений способны акцептировать ГСЛ; изучить насколько важен динамический фактор (наличие потока) для проникновения ГСЛ в клетки-акцепторы. В результате, мы будем знать, в какой форме находятся ГСЛ пребывающие в среде, имитирующей кровь (в отношении альбумина и липопротеинов) – сохранятся ли исходные микровезикулы в их нативном виде, или ГСЛ из них способны переходить в состав комплексов с белками крови. • Стадия встраивания: нужно выяснить роль специфического фактора в заякоривании микровезикулы при встрече с гликокаликсом, а возможно и непосредственно в процессе слияния с плазматической мембраной клетки-акцептора. Для этого будет изучено возможное участие гликана (в составе ГСЛ везикулы) с лектином гликокаликса (в частности, галектинами) и лектином заякоренным в мембрану клетки-акцептора, в частности сиглеками; функция сиглеков - взаимодействовать с сиалогликанами клеток-партнеров, поэтому тот же механизм узнавания обязан действовать и для пары микровезикула/клетка-акцептор. В-третьих, мы предполагаем наличие переноса ГСЛ с микровезикул на клетку-акцептор без их слияния, а в результате процесса, аналогичного роллингу лейкоцитов на эндотелии, то есть качения микровезикулы по поверхности клетки-акцептора. Полученное знание поможет в разработке современных подходов к таргетной терапии, основанной на доставке везикул, или синтетических вакцин в составе искусственных или модифицированных природных везикул.