Протеасома представляет собой мультисубъединичный протеиназный комплекс, ответственный за деградацию большинства внутриклеточных белков. В дополнение к деградации завершивших свою функцию и поврежденных белков, протеасома регулирует многие важные клеточные процессы посредством контролируемой деградации белков, например, факторов транскрипции, регуляторов клеточного цикла и других жизненно важных ферментов. Многие ингибиторы протеолитической активности протеасомы в настоящий момент применяются как лекарственные средства для лечения гематологических злокачественных новообразований, также активно изучается возможность их применения для терапии других заболеваний, в том числе аутоиммунной природы. Сигналом протеасомной деградации является цепь из молекул убиквитина, ковалентно связанная с белком-мишенью. Специфичность сигнала определяется длиной и структурой полиубиквитиновых цепей, которые распознаются рецепторами в составе регуляторных субчастиц протеасомы. На настоящий момент очевидно, что система убиквитин-опосредованной модификации является неоднозначной, так как известны как минимум семь функциональных лизинов, по которым может происходить рост полиубиквитиновой цепи. После связывания полипептидного субстрата с протеасомой посредством убиквитиновой метки происходит инициация его гидролиза в неупорядоченной области субстрата, которое само по себе является одним из компонентов сигнала деградации. Кроме убиквитин-зависимой деградации, существует также убиквитин-независимая деградация, в этом случает сигналом для протеолиза является либо последовательность внутри самого белка, либо некоторая вспомогательная молекула. На настоящий момент известно около двух десятков белков, гидролизующихся без предварительной модификации убиквитином. Например, некоторые протоонкобелки и белки-онкосупрессоры являются убиквитин-независимыми субстратами протеасомы, видоизмененная деградация которых может иметь туморогенный эффект. Несмотря на продолжительную и насыщенную историю изучения убиквитин-протеасомной системы до сих пор нет чёткого понимания механизмов, которые лежат в основе ассоциации субстратов с протеасомой. Таким образом, ряд ключевых вопросов, таких как длина и состав полиубиквитиновой цепи, круговорот и деградация самого убиквитина, а также структурные детерминанты, позволяющие субстратам напрямую взаимодействовать с протеасомой, до сих пор остаются нерешенными. В связи с этим современная наука нуждается в инструментах, которые позволили бы осуществлять мониторинг функционирования убиквитин-протеасомной системы непосредственно в живых клетках и тканях. Основные проблемы, связанные с изучением убиквитин-протеасомной системы можно сформулировать следующим образом: (i) сложность работы с убиквитином вследствие его размера, который налагает значительные ограничения на его модификацию различными кластерами и слитными белками; (ii) присутствие большого количества эндогенного убиквитина, который сильно интерферирует с привнесенным рекомбинантным, тем самым затрудняя адекватный анализ (iii) абсолютная неспособность клеток млекопитающих существовать без убиквитина, что делает невозможным проведение knock-out кодирующих его генов. Настоящий проект ставит своей целью – введение в клетки генетических элементов, кодирующих искусственные варианты убиквитина, под контролем индуцибельных промотеров – создание на их основе генетически модифицированных клеток с инактивированными генами, кодирующими убиквитин, с использованием системы CRISPR-Cas9 Далее с применением созданных клеточных линий в условиях полного отсутствия эндогенного убиквитина будет проведены следующие эксперименты – in vivo определение времени полужизни вариантов убиквитина и полиубиквитиновых цепей, средней длины полиубиквитиновой цепи, клеточной локализации убиквитина, накопления убиквитина при ингибировании протеасомы с помощью методики специфического ферментативного внутриклеточного мечения белков низкомолекулярными флуорофорами (метод PRIME) – анализ субстратной специфичности протеасомы к полиубиквитиновым цепям разного типа ветвления – транскрипционное профилирование клеток, содержащих различные варианты убиквитина