Стратегия лизиса бактерий бактериофагами таксона Caudovirales заключается в разрушении клеточной стенки бактерии-хозяина изнутри с помощью группы литических белков, представленной как минимум диадой холин-эндолизин. Холины обладают мембранной активностью, а основную функцию в лизисе выполняют эндолизины – ферменты, деградирующие пептидогликан клеточной стенки. Эндолизины в одиночку способны вызывать осмотический лизис бактерий при применении извне. Исследование их, как антибактериальных агентов – «энзибиотиков», чей механизм действия отличен от антибиотиков, – весьма актуально с учетом широкого распространения резистентных бактериальных патогенов. Глобулярные L,D-пептидазы - многочисленное семейство однодоменных эндолизинов, первый представитель которого был выделен авторами проекта в 2009 году. В отличие от модулярных эндолизинов фагов грамположительных бактерий, состоящих из отдельных каталитического и субстратсвязывающего доменов, глобулярные эндолизины совмещают функции связывания и катализа в одном домене. Каким образом осуществляется в таком случае катализ, до сих пор не изучено, прежде всего в связи с ограниченностью структурных данных и сложностью строения субстрата. Установление конкретных аминокислотных остатков консенсусной последовательности, ответственных за связывание субстрата и катализ, и молекулярного механизма гидролиза глобулярными L,D-пептидазами - одна из целей проекта. Потенциально семейство L,D-пептидаз насчитывает более сотни членов только у литических фагов, не считая представителей, обнаруженных в профагах и бактериальных метагеномах. Однако, сейчас известно всего 5 глобулярных L,D-пептидаз, из них 3 изучены в нашей лаборатории – эндолизины сифовируса Т5, миовирусов RB43 и RB49. У пептидазы фага Т5 обнаружена кальцийсвязывающая петля нового типа; этот вариант ионной регуляции эндолизинов пока уникален. Между тем, есть основания полагать, что периплазматическая активация ионами кальция – распространенный путь регуляции лизиса у целого ряда литических бактериофагов, инфицирующих грамотрицательных хозяев. Для верификации данной гипотезы нужны новые экспериментальные данные об ионной активации L,D-пептидаз. Поиск, характеристика и структурное исследование новых эндолизинов с ионной регуляцией - вторая цель проекта. Гены литических белков у фагов обычно организованы в «кассеты» и находятся под контролем общих регуляторных элементов. Часто они имеют ранний промотор, то есть транскрипция начинается на начальной стадии жизненного цикла фага. Но продукты литических генов токсичны для клетки хозяина, и необходим тщательный контроль времени наступления лизиса, чтобы фаговое потомство было полностью сформировано и многочисленно. До сих пор ответственность за тайминг лизиса приписывают почти исключительно холинам, поскольку для некоторых холинов показана трансляционная регуляция посредством двойного старта. Однако, многие холины двойного старта не имеют, оставаясь токсичными мембранными белками. О других транскрипционных и трансляционных механизмах регуляции фаголизиса практически нет данных. Поиск природных регуляторных последовательностей, анализ транскрипционной активности, оценка эффективности трансляции и установление новых факторов, влияющих на уровень экспрессии различных генов литического оперона, помогут понять, как на молекулярном уровне координируется взаимодействие фаг-хозяин при фаголизисе, и является третьей целью проекта. Следует подчеркнуть, что мишень L,D-пептидаз – связь l-Ала-d-Глу – имеется в пептидогликане подавляющего числа видов бактерий, как грамотрицательных, так и грамположительных. Таким образом, эти ферменты потенциально имеют широкий спектр антибактериального действия. Уже охарактеризованные члены семейства обладают высокой удельной активностью и температурной устойчивостью, что расширяет возможности для их терапевтического (в биомедицине) и нетерапевтического (в биотехнологии) применения.