Среди многообразия веществ, участвующих в инфекционных процессах, особое место занимают пороформирующие токсины, секретирующиеся в водорастворимой или в мембран связанной формах и формирующие ионные каналы в клеточных мембранах эукариот. Данная работа посвящена изучению семейства бактериальных бета- порообразующих токсинов (бета-ПОТ) и способам ингибирования их активности. В качестве основной модели будет использован гемолизин II (HlyII) - один из факторов патогенности B. cereus, относящийся к группе бета-ПОТ. HlyII отличается от других изученных членов семейства бета-ПОТ наличием С-концевого удлинения из 94 аминокислот (HlyIICTD). Авторами проекта показано, что HlyIICTD способен ориентированно связываться с мембранами клеток-мишеней (Руденко и др., 2020), олигомеризоваться в присутствии клеточных мембран и формировать ионные каналы (Rudenko et al., 2022). B. cereus условно патогенная бактерия, являющаяся одной из распространенных причин внутрибольничных инфекций. Описаны виды Bacillus cereus sensu lato, в том числе и Bacillus anthracis - возбудитель сибирской язвы, которые не синтезируют зрелый HlyII, однако в их геномах выявлена последовательность, способная кодировать большой С-терминальный фрагмент HlyII (HlyIILCTD), соответствующий надмембранной части гемолизина II с предполагаемой молекулярной массой около 25 кДа. При использовании моноклональных антител против HlyIICTD, полученных авторами проекта (Руденко и др., 2020) были обнаружены укороченные с N-конца полипептиды, которые могут выполнять различные функции, важные для бактериальной клетки и быть претендентами на роль антитоксинов, так как необходимы внутриклеточные механизмы, защищающие бактерию от повреждения собственными белками. Данный проект направлен на изучение укороченных форм HlyII, в том числе и HlyIILCTD. Происхождение и функция которых к настоящему моменту не известна. Возможно, эти полипептиды участвуют в спасении собственной бактериальной клетки и выступают на определенной стадии ее развития в качестве антитоксинов. Перед нуклеотидной последовательностью, кодирующей HlyIILCTD, обнаружен участок, который имеет значительную гомологию в аминокислотной последовательности среди многих бактериальных бета-ПОТ. Выбран участок в аминокислотной последовательности HlyII, демонстрирующий высокую степень гомологии c CytK B. cereus, α-токсином Staphylococcus aureus и другими бактериальными бета-пороформирующими токсинами. В ходе работы предполагается получить панель моноклональных антител против этого участка, с целью выявления таких антител, которые способны узнавать и, возможно, подавлять широкий спектр бактериальных бета-ПОТ. Выяснение функции укороченных полипептидов бета-ПОТ, их происхождения, и возможной роли в подавлении их цитолитической активности - основная цель данного проекта. Укороченные формы токсина являются кандидатами на роль антивирулентных факторов. Описание и разработка средств, направленных на подавление факторов вирулентности, секретируемых патогенными бактериями, становится все более актуальным в связи с распространением штаммов бактерий, устойчивых к антибиотикам. Перспективным является использование в качестве антивирулентных факторов моноклональных антител, как высокоточного инструмента, направленного на конкретный участок на молекуле токсина. Моноклональные антитела, обезвреживающие бактериальные патогены путем ингибирования их бета-ПОТ на различных стадиях секреции или взаимодействия с клетками-мишенями могут стать лекарственными препаратами, в условиях, когда классические антибиотики и поддерживающая терапия не эффективны. Использование укороченных форм бета-ПОТ в качестве антигенов перспективно, так как получение антител к мономерам токсинов затруднено из-за их цитолитической атаки на клетки макроорганизмов. Участниками проекта было описано штамм специфическое моноклональное антитело HlyIIC-20, узнающее пространственный эпитоп HlyIICTD, способное подавлять цитолитическую активность токсина на стадии образования олигомерных форм (Rudenko et al., 2020). Обнаружение HlyIIC-20 предполагает большую вероятность отбора моноклональных антител, нейтрализующих действие токсина, так как HlyIICTD является частью HlyIILCTD. Использование в качестве антигена полипептида с высокой степенью гомологии будет альтернативной возможностью получения защитных (нейтрализующих) моноклональных антител. В результате будут получены представительные панели моноклональных антител, взаимодействующие с HlyII B. cereus, полученные как при иммунизации гомологичным полипептидом, так и HlyIILCTD. Планируется найти моноклональные антитела из полученных панелей, блокирующие гемолитическую активность гемолизина II. Будет изучена иммуноперекрестная активность полученных моноклональных антител с бета-ПОТ, для которых показана гомология аминокислотных последовательностей с HlyII B. cereus. Методом фагового дисплея с использованием комбинаторных пептидных библиотек будут определены антигенные детерминанты на молекуле гемолизина II, узнаваемые функционально значимыми антителами. Будет предпринята попытка определения общих структурных мотивов, участвующих в порообразовании. Исследование бактериальных порообразующих токсинов и получение моноклональных антител, нейтрализующих их цитолитическую активность, имеет выраженный медицинский аспект. Моноклональные антитела могут стать основой для разработки диагностических и лекарственных препаратов. Полученная панель моноклональных антител против HlyII позволит исследовать механизмы секреции и порообразования, что обеспечит значительный вклад в фундаментальную науку. На основе моноклональных антител будет разработана диагностическая тест-система для выявления патогенов в различных биологических жидкостях. Н. В. Руденко, А. П. Каратовская, А. В. Замятина, А. В. Сиунов, Ж. И. Андреева-Ковалевская, А. С. Нагель, Ф. А. Бровко, А. С. Солонин. С-терминальный домен гемолитического токсина II Bacillus cereus способен взаимодействовать с эритроцитами // Биоорганическая химия. – М.: 2020, том 46, № 3, с. 280–285. DOI: 10.31857/S013234232003029X. Natalia Rudenko, Alexander Siunov, Anna Zamyatina, Bogdan Melnik, Alexey Nagel, Anna Karatovskaya, Marina Borisova, Anna Shepelyakovskaya, Zhanna Andreeva-Kovalevskaya, Alexander Kolesnikov, Alexey Surin, Fedor Brovko, Alexander Solonin. The C-terminal domain of Bacillus cereus hemolysin II oligomerizes by itself in the presence of cell membranes to form ion channels. // International Journal of Biological Macromolecules. 2022, V. 200, Pages 416-427. doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2022.01.013. Rudenko N, Nagel A, Zamyatina A, Karatovskaya A, Salyamov V, Andreeva-Kovalevskaya Z, Siunov A, Kolesnikov A, Shepelyakovskaya A, Boziev K, Melnik B, Brovko F, Solonin A. A Monoclonal Antibody against the C- Terminal Domain of Bacillus cereus Hemolysin II Inhibits HlyII Cytolytic Activity. Toxins (Basel). 2020;12(12):806. doi: 10.3390/toxins12120806.