Актуальным направлением современной медицины является разработка подходов к лечению и профилактике заболеваний, сопровождающихся пониженным уровнем функциональных белков, например, аполипротеина С3 (ишемическая болезнь сердца) и фратаксина (атаксия Фридрейха). Повышение может достигаться за счет применения белковых препаратов, а также манипуляцией с кодирующей белок мРНК. В последнем случае часто наблюдается неэффективная или недостаточная продукция целевого белка, что может быть скорректировано увеличением эффективности трансляции и стабильности мРНК. Показано, что трансляцию можно целенаправленно усилить с помощью антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые компенсируют функцию негативных регуляторных элементов (шпилек), присутствующих в 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) некоторых мРНК. В свою очередь, повышение стабильности мРНК можно достигнуть при использовании АСО, а также введением устойчивых к действию экзонуклеаз химических модификаций в поли(A) хвост мРНК. Настоящий проект можно разделить на два направления: 1) Специфическое воздействие на высокоструктурированные элементы в 5'-НТО мРНК с целью повышения эффективности трансляции АСО можно применять не только для специфического понижения экспрессии генов за счет деградации транскриптов, но также для специфического повышения уровня белка за счет повышения эффективности трансляции мРНК. В этом случае мишенями АСО являются шпильки или кОРС (короткие открытые рамки считывания) в 5’НТО мРНК. Однако до настоящего времени в качестве мишеней АСО не рассматривали G-квадруплексы, которые также присутствуют в 5'-НТО и могут регулировать трансляцию. Таким образом, целесообразна разработка новых модификаций и принципов дизайна АСО с улучшенными свойствами, а также поиск высокоструктурированных элементов в 5'-НТО, способных регулировать эффективность трансляции. Будет проведен поиск мишеней и опробован подход к повышению эффективности трансляции за счет таргетного воздействия. Подход основан на дизайне конструктов, содержащих низкомолекулярный фрагмент, способный разрушать классические GC пары в шпильках и G тетрады в G-квадруплексах, и олигонуклеотидную часть, обеспечивающую селективность за счет комплементарности к одноцепочечным фрагментам, фланкирующим вторичную структуру. 2) Разработка эффективных и масштабируемых способов получения функциональных конъюгатов мРНК с повышенной стабильностью Химическая модификация синтетической мРНК, например, N1-метилпсевдоуридином, является перспективным способом повышения эффективности векторов мРНК. Альтернативные стратегии обеспечивают повышение стабильности мРНК за счет ферментативной достройки поли(А)-хвоста модифицированными нуклеотидами или ферментативного лигирования по 3'-концу модифицированных олигонуклеотидов (ОН). Однако, достройка имеет переменную эффективностью и дает поли(А)-хвосты переменной длины, а конъюгирование не позволяет получать конъюгаты мРНК в достаточных для терапевтических целей количествах. Впервые будут опробованы подходы к повышению стабильности мРНК за счет масштабируемого химического конъюгирования ОН. Для этого будут разработаны соответствующие фосфорамидиты, вводимые по 5'-концу ОН и обеспечивающие эффективное конъюгирование. Для повышения стабильности конъюгатов мРНК будет опробован подход с применением модифицированных ОН, «удлиняющих» поли(А) хвост, и оригинальный принцип с «закольцовыванием» мРНК. В случае получения положительных результатов, будут проведены исследования эффективности разработанного подхода in vivo. В ходе реализации проекта будет предложено и апробировано несколько подходов к таргетному повышению количеств белка за счет повышения эффективности трансляции и стабильности мРНК, применяя синтетические ОН. Полученные результаты могут найти применение в биологии (изучение функций белков) и медицине (специфическая коррекция дефицита белков при патологиях, повышение эффективности терапевтических средств на основе мРНК).