Пресс-центр / новости / Наука /

Научные достижения ИБХ РАН в 2020 году

На заседании Ученого Совета ИБХ РАН 28 декабря 2020 г. были представлены результаты научной деятельности подразделений Института за 2020 год. Вашему вниманию предлагается презентация директора А.Г. Габибова, а также список  достижений, поданных подразделениями на сайте.

отчёт, достижения ИБХ

Гончарук С.А.

Итоговая презентация директора Института А.Г. Габибова

  • Скачать в формате PDF
  • Уважаемые коллеги, публикационная активность отделов и лабораторий представлена на 26 декабря 2020г. Напоминаем, что актуальная статистика всегда доступна на сайте.

Отдел пептидно-белковых технологий

Лаборатория биокатализа (Габибов А.Г.)

,  

Лаборатория химии протеолитических ферментов (Смирнов И.В.)

С помощью квантово-механического молекулярно-механического (QM/MM) подхода объяснено изменение стереопецифичности антител

Разработан новый подход на основе метода квантовой механики/молекулярной механики (QM/MM) и funnel-метадинамики с использованием возможностей суперкомпьютера для направленного изменения реакционной способности иммуноглобулинов (Ig). Это было достигнуто за счет определения позиций и типа аминокислотных остатков для замены в каталитическом центре, что позволило обеспечить усиление нуклеофильности атакующего остатка Тирозина 37. Оптимизированный с точки зрения вычислений вариант, L-Leu47Lys, обеспечивает 340-кратное увеличение реакционноспособной полученного мутантного варианта по сравнению с Ig-параоксоназой дикого типа в результате индуцированной субстратом ионизации остатка Тирозина 37. Этот универсальный алгоритм был с успехом использован для объяснения стереоселективности мутантных антител по отношению к Р-хиральному фенилфосфонату. Эти расчеты были подтверждены кинетическими и кристаллографическими методами.

  1. Mokrushina YA, Golovin AV, Smirnov IV, Chatziefthimiou SD, Stepanova AV, Bobik TV, Zalevsky AO, Zlobin AS, Konovalov KA, Terekhov SS, Stepanov AV, Pipiya SO, Shamborant OG, Round E, Belogurov AA, Bourenkov G, Makarov AA, Wilmanns M, Xie J, Blackburn GM, Gabibov AG, Lerner RA 2020 Multiscale computation delivers organophosphorus reactivity and stereoselectivity to immunoglobulin scavengers. Proc Natl Acad Sci U S A 117 (37) 22841–22848

Лаборатория биокатализа (Габибов А.Г.)

Открыт фермент – киназа AmiN, обеспечивающую резистентность к антибиотику амикумацину.

Открыт фермент – киназа AmiN, обеспечивающую резистентность к антибиотику амикумацину. Уникальность данной киназы заключается в ее необычайно высоком сродстве к субстрату, позволяющему высокоэффективно элиминировать даже следовые количества антибиотика в диапазоне наномолярных концентраций. Комплекс методов, включающих рентгеноструктурный анализ и математическое моделирование, позволил детально исследовать совершенный механизм катализа, связанный с закрытием активного центра фермента.

  1. Terekhov SS, Mokrushina YA, Nazarov AS, Zlobin A, Zalevsky A, Bourenkov G, Golovin A, Belogurov A, Osterman IA, Kulikova AA, Mitkevich VA, Lou HJ, Turk BE, Wilmanns M, Smirnov IV, Altman S, Gabibov AG 2020 A kinase bioscavenger provides antibiotic resistance by extremely tight substrate binding. Sci Adv 6 (26) eaaz9861

Лаборатория биокатализа (Габибов А.Г.)

,  

Лаборатория белков гормональной регуляции (Белогуров А.А.)

,  

Лаборатория химии протеолитических ферментов (Смирнов И.В.)

,  

Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии (Баранов П.В.)

Разработана математическая модель, являющаяся основой для рационализации амплификации библиотек с использованием ePCR.

Показано, что амплификация отдельных молекул ДНК, инкапсулированных в огромном количестве капель эмульсии (ePCR), позволяет решить эту проблему. Различные режимы ePCR были экспериментально проанализированы, чтобы определить наиболее совершенные методы амплификации библиотек ДНК. На основе полученных экспериментальных данных была разработана математическая модель, являющаяся основой для рационализации амплификации библиотек с использованием ePCR. Детальное описание ампликонов библиотек ДНК было получено в результате высокопроизводительного секвенирования, подчеркивающего основные преимущества ePCR по сравнению с обычной PCR. ePCR снижает частоту возникновения грубых ошибок в процессе ДНК амплификации и обеспечивает более равномерное распределение амплифицированных последовательностей. Таким образом, благодаря ePCR достигается квазимономолекулярная амплификация, представляющая собой фундаментальное требование при амплификации сложных матриц. Исследователи показали, что ePCR препятствует дегенерации разнообразия и обеспечивает сохранение качества библиотек ДНК.

  1. Terekhov SS, Eliseev IE, Ovchinnikova LA, Kabilov MR, Prjibelski AD, Tupikin AE, Smirnov IV, Belogurov AA, Severinov KV, Lomakin YA, Altman S, Gabibov AG 2020 Liquid drop of DNA libraries reveals total genome information. Proc Natl Acad Sci U S A 117 (44) 27300–27306

Лаборатория белков гормональной регуляции (Белогуров А.А.)

,  

Лаборатория фармакокинетики (Зинченко Д.В.)

Природные полиамины – новые модуляторы протеасомной активности

Полиамины, включая такие природные амины как спермин и спермидин, способны поддерживать активность протеасомальных комплексов в условиях защелачивания, характерного для злокачественно трансформированных клеток. Новое прочтение роли природных полиаминов в поддержании метаболизма и метастазирования опухолей.

  1. Kudriaeva AA, Saratov GA, Kaminskaya AN, Vladimirov VI, Barzilovich PY, Belogurov AA 2020 Polyamines Counteract Carbonate-Driven Proteasome Stalling in Alkaline Conditions. Biomolecules 10 (12)

Лаборатория белков гормональной регуляции (Белогуров А.А.)

,  

Лаборатория биокатализа (Габибов А.Г.)

Создание технологии CYCLOPS (CYtometry Cell-Labelling Operable Phage Screening).

Разработка технологии высокопроизводительного скрининга лигандов поверхностных рецепторов.

  1. Ishina IA, Filimonova IN, Zakharova MY, Ovchinnikova LA, Mamedov AE, Lomakin YA, Belogurov AA 2020 Exhaustive Search of the Receptor Ligands by the CyCLOPS (Cytometry Cell-Labeling Operable Phage Screening) Technique. Int J Mol Sci 21 (17)

Лаборатория химии протеолитических ферментов (Смирнов И.В.)

,  

Лаборатория биокатализа (Габибов А.Г.)

,  

Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии (Баранов П.В.)

Создание агентов биоконтроля Staphylococcus aureus на основе лизостафина

Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) - распространенный патоген человека, который очень часто ассоциируется с устойчивостью к антибиотикам. Уничтожение этого часто встречаемого инфекционного агента особенно затруднено из-за чрезмерного образования биопленок и резистентных клеток, которые уклоняются от действия антибактериальных препаратов. Конститутивная гетерологичная продукция высокоспецифичной бактериолитической протеазы лизостафина в дрожжах Pichia pastoris выступает как эффективный агент биоконтроля, в частности убивая S. aureus в сокультуре. Полученный пробиотик S.aureus эффективен в широком диапазоне температур и соотношении мишень-фактор, что указывает на его надежность и универсальность в устранении клеток S. aureus. Дальнейшее биомедицинское применение новых агентов биоконтроля на основе дрожжей требуют оценки на моделях in vivo. Однако мы считаем эту стратегию очень многообещающей, поскольку она обеспечивает безопасные, эффективные и селективные генетически запрограммированные пробиотики и целевые агенты биоконтроля.

  1. Pipiya SO, Mokrushina YA, Gabibov AG, Smirnov IV, Terekhov SS 2020 Selective Eradication of Staphylococcus aureus by the Designer Genetically Programmed Yeast Biocontrol Agent. Antibiotics (Basel) 9 (9) 1–12
  2. Terekhov SS, Mokrushina YA, Nazarov AS, Zlobin A, Zalevsky A, Bourenkov G, Golovin A, Belogurov A, Osterman IA, Kulikova AA, Mitkevich VA, Lou HJ, Turk BE, Wilmanns M, Smirnov IV, Altman S, Gabibov AG 2020 A kinase bioscavenger provides antibiotic resistance by extremely tight substrate binding. Sci Adv 6 (26) eaaz9861
  3. Terekhov SS, Nazarov AS, Mokrushina YA, Baranova MN, Potapova NA, Malakhova MV, Ilina EN, Smirnov IV, Gabibov AG 2020 Deep Functional Profiling Facilitates the Evaluation of the Antibacterial Potential of the Antibiotic Amicoumacin. Antibiotics (Basel) 9 (4)

Лаборатория клеточной биологии рецепторов (Петренко А.Г.)

,  

Группа молекулярной физиологии (Деев И.Е.)

,  

Лаборатория молекулярной диагностики (Завриев С.К.)

Изучена структуры и функций сенсора щелочи IRR с помощью панели моноклональных антител

-Получены шесть мышиных моноклональных антител против рекомбинантного эктодомена IRR.

-Определены сайты связывания полученных антител с IRR.

-Показано, что антитело 4D5 способно активировать IRR при нейтральном значении рН, а антитело 4С2 ингибирует активацию IRR щелочной средой.

Проведенное исследование является первым описанием объектов белковой природы, способных регулировать активность сиротского рецептора IRR, а также подтверждает, что активация щелочной средой является неотъемлемым свойством этой рецепторной тирозинкиназы.

  1. Goryashchenko AS, Mozhaev AA, Serova OV, Erokhina TN, Orsa AN, Deyev IE, Petrenko AG 2020 Probing structure and function of alkali sensor irr with monoclonal antibodies. Biomolecules 10 (7) 1–13
  2. Можаев АА, Ерохина ТН, Серова ОВ, Деев ИЕ, Петренко АГ 2017 Получение и иммунохимическая характеристика моноклонального антитела к эктодомену рецептора, подобного рецептору инсулина (IRR). 43 (6) 631–636

Лаборатория клеточной биологии рецепторов (Петренко А.Г.)

,  

Группа молекулярной физиологии (Деев И.Е.)

,  

Лаборатория молекулярной тераностики (Мартынов В.И.)

Созданы генетически кодируемые сенсоры для измерение внеклеточного рН методом FLIM

-На основе ранее описанного рН-сенсора SypHer3s создан сенсор внеклеточного слабощелочного рН SypHerExtra, представляющий собой SypHer3s с трансмембранным доменом нейрексина-1.

-Продемонстрировано, что при возбуждении на длине волны 445 нм время жизни флуоресценции сенсоров SypHer3s и SypHerExtra зависит от значения рН.

-Показано, что указанные сенсоры позволяют определять значения внутриклеточного и внеклеточного рН соответственно в диапазоне от рН 6.5 до 9.5 с помощью метода FLIM в различных биологических системах.

  1. Martynov VI, Pakhomov AA, Deyev IE, Petrenko AG 2018 Genetically encoded fluorescent indicators for live cell pH imaging. BIOCHIM BIOPHYS ACTA 1862 (12) 2924–2939
  2. Pakhomov AA, Martynov VI, Orsa AN, Bondarenko AA, Chertkova RV, Lukyanov KA, Petrenko AG, Deyev IE 2017 Fluorescent protein Dendra2 as a ratiometric genetically encoded pH-sensor. Biochem Biophys Res Commun 493 (4) 1518–1521

Лаборатория клеточной биологии рецепторов (Петренко А.Г.)

,  

Группа молекулярной физиологии (Деев И.Е.)

,  

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии (Арсеньев А.С.)

Выявлена каплевидная форма эктодомена щелочного сенсора ИРР

Используя атомно-силовую микроскопию (AFM), мы исследовали общую конформацию рекомбинантного растворимого эктодомена IRR (ectoIRR) при нейтральном и щелочном pH. В отличие от хорошо известной перевернутой U-образной конформации рецептора инсулина, структурные модели, реконструированные при различных значениях pH, показали, что организация ectoIRR имеет «каплевидную» форму с более коротким расстоянием между доменами фибронектина. При защелачивании внеклеточной среды происходят незначительные конформационные изменения, что говорит о том, что в активацию ectoIRR вовлечены дополнительные молекулярные механизмы, взаимодействие соседних рецепторных областей, влияние окружающей липидной среды.

  1. Shtykova EV, Petoukhov MV, Mozhaev AA, Deyev IE, Dadinova LA, Loshkarev NA, Goryashchenko AS, Bocharov EV, Jeffries CM, Svergun DI, Batishchev OV, Petrenko AG 2019 The dimeric ectodomain of the alkali-sensing insulin receptor-related receptor (ectoIRR) has a drop-like shape. J Biol Chem 294 (47) 17790–17798
  2. Mozhaev AA, Orsa AN, Deyev IE, Shvets VI, Petrenko AG 2019 Optimization of Heterologous Expression of Insulin Receptor-Related Receptor Ectodomain. Dokl Biochem Biophys 485 (1) 101–103

Группа молекулярной физиологии (Деев И.Е.)

,  

Лаборатория клеточной биологии рецепторов (Петренко А.Г.)

,  

Лаборатория молекулярной тераностики (Мартынов В.И.)

Получение и характеристика генетически кодируемых флуоресцентных сенсоров внеклеточного рН

Флуоресцентные белки в последнее время стали неотъемлемым инструментом для прижизненной визуализации различных процессов, протекающих в живых системах, начиная от отдельных органелл и заканчивая целыми организмами. Они позволяют наблюдать экспрессию белков, их локализацию, а также пригодны для мониторинга биохимических процессов в клетках. Как правило, флуоресцентные белки имеют рН-зависимые спектральные свойства, что позволяет конструировать на их основе генетически кодируемые рН-сенсоры для решения различных биологических задач. В данной работе мы получили набор сенсоров внеклеточного рН на основе белка SypHer3S, имеющего рН чувствительность в диапазоне значений рН от 7.4 до 9.0. Для этого были созданы химерные конструкции SypHer3S с различными трансмембранными доменами мембранных рецепторов, позволяющих направлять данный белок на внешнюю сторону цитоплазматической мембраны. Была охарактеризована их субклеточная локализация и подобран наиболее успешный вариант химерного рН-сенсора для измерения внеклеточного значения рН.

Группа молекулярной физиологии (Деев И.Е.)

,  

Лаборатория клеточной биологии рецепторов (Петренко А.Г.)

,  

Лаборатория молекулярных основ эмбриогенеза (Зарайский А.Г.)

Физиологическая роль рецептора IRR в развитие лягушки Xenopus laevis

Рецептор подобный-рецептору инсулина (IRR), в отличие от своих близких гомологов, рецептор инсулина (IR) и рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGF-IR) могут быть активированы слабощелочной внеклеточной средой. В отличие от повсеместно экспрессируемых IR и IGF-IR, IRR обнаруживается в определенных наборах клеток только в некоторых тканях, большинство из которых подвергаются воздействию экстракорпоральных жидкостей с экстремальным pH. Передача сигналов IR и IGF-IR важна для роста и развития в эмбриогенезе рыбок или лягушек. Напротив, роль активации IRR во время эмбриогенеза неизвестна, хотя ооциты лягушки имеют сильную экспрессию IRR. Чтобы решить эту проблему, мы исследовали функцию IRR во время развития Xenopus laevis посредством морфолино-опосредованного селективного нокдауна IRR. Мы продемонстрировали, что ингибирование экспрессии IRR у Xenopus laevis приводит к задержке развития, но этот фенотип может быть восстановлен путем инкубации эмбрионов в щелочной среде. Кроме того, используя последовательность РНК общей РНК, мы показали, что ингибирование IRR резко изменило транскриптом эмбриона и частично восстановилось после обработки щелочью. Мы идентифицировали несколько сотен генов (eomes, frzb, pax6 и др.), экспрессия которых изменяется после нокдауна IRR и восстанавливается под воздействием щелочи. Наши результаты ясно демонстрируют, что IRR играет ранее неизвестную важную роль в эмбриогенезе и росте лягушек.

Группа экспрессии белковых факторов роста и дифференцировки (Фролова Е.И.)

Клетки иммунотерапевтической клеточной линии NK-92 способны эффективно доставлять онколитический энтеровирус CVA7 к опухолям

Многие непатогенные энтеровирусы считаются многообещающими онколитическимиагентами; однако их системное введение в малоэффективно из-за быстрой нейтрализации вируса в кровотоке и барьерных функций эндотелия. Мы испытали клеточную линию натуральных киллеров в качестве носителей для доставки онколитических энтеровирусов, что позволило бы сочетать эффекты клеточной иммунотерапии с виротерапией. Мы протестировали четыре штамма непатогенных энтеровирусов против панели клеточных линий глиобластомы и оценили полученные инфекционные титры. Далее была испытана клеточная доставка при помощи линии NK-92, которая уже проходит клинические испытания в качестве иммунотерапевтического средства. Оказалось, что только вирус Коксаки A7 (CVA7) был способен эффективно реплицироваться в клетках NK-92. Сравнение эффективности доставки CVA7 in vivo с использованием клеток NK-92 и прямого внутривенного введения показало, что клеточная доставка более эффективна даже при однократном введении. Это указывает, что клеточная линия NK-92 может быть использована в качестве вектора для доставки онколитического штамма CVA7, что может улучшить клинический потенциал этого вирусного онколитика для лечения глиобластомы и других видов рака.

Отдел иммунологии

Лаборатория клеточных взаимодействий (Сапожников А.М.)

Обладающие высоким пролиферативным потенциалом NK-клетки CD56dimCD57−NKG2C+ являются возможными предшественниками адаптивных NK-клеток

1. NK-клетки из субпопуляции CD56dimCD57−NKG2C+ демонстрируют сходные паттерны экспрессии ряда поверхностных и внутриклеточных маркеров с клетками из субпопуляции CD56dimCD57+NKG2C+ . В обеих популяциях зарегистрирован повышенный уровень активированных, HLA-DR-экспрессирующих NK-клеток.

2. NK-клетки CD56dimCD57−NKG2C+ обладают высокой пролиферативной активностью и выживаемостью при культивировании in vitro.

3. В процессе культивирования NK-клетки могут терять экспрессию NKG2C, а также экспрессию маркера терминальной дифференцировки CD57.

  1. Kobyzeva PA, Streltsova MA, Erokhina SA, Kanevskiy LM, Telford WG, Sapozhnikov AM, Kovalenko EI 2020 CD56dimCD57−NKG2C+ NK cells retaining proliferative potential are possible precursors of CD57+NKG2C+ memory‐like NK cells. J Leukoc Biol
  2. Erokhina SA, Streltsova MA, Kanevskiy LM, Grechihina MV, Sapozhnikov AM, Kovalenko EI 2020 HLA-DR-expressing NK cells: Effective killers suspected for antigen presentation. J Leukoc Biol

Лаборатория клеточных взаимодействий (Сапожников А.М.)

Интраэпителиальные дендритные клетки осуществляют контроль за фагоцитарным ответом в слизистой дыхательных путей

Проведено исследование субпопуляционного состава и функциональных особенностей интраэпителиальных антигенпредставляющих клеток слизистой оболочки главного бронха в отсутствии воспаления и при формировании иммунного ответа на споры условно патогенного гриба Aspergillus fumigatus. Показано, что в отсутствии воспаления интраэпителиальные антигенпредставляющие клетки представлены MHCII+CD11c+ дендритными клетками, однако в процессе воспаления в подэпителиальное пространство также мигрируют MHCII+CD11c клетки, также характеризующиеся наличием дендритов. Как MHCII+CD11c+, так и MHCII+CD11c клетки взаимодействуют с CD11b+ фагоцитами, принимая участие в гомеостатической регуляции воспалительного процесса в дыхательных путях.

  1. Bogorodskiy AO, Bolkhovitina EL, Gensh T, Troyanova NI, Mishin V, Okhrimenko S, Braun A, Spies E, Gordeliy VI, Sapozhnikov AM, Borshchevskiy VI, Shevchenko MA 2020 Murine Intraepithelial Dendritic Cells Interact With Phagocytic Cells During Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Front Immunol 11 (298) 1–15

Лаборатория молекулярной иммунологии (Деев С.М.)

,  

НПП «Питомник лабораторных животных» (Телегин Г.Б.)

Стратегия синергичной комбинированной адресной иммуно/химиотерапии агрессивных опухолей с визуальным контролем.

Впервые для улучшенной терапии опухолей с визуальным контролем разработана стратегия региоспецифичного нацеливания на разные участки одного и того же рецептора опухолевой клетки комбинации двух противоопухолевых токсинов с разными механизмами действия - антибиотика доксорубицина в составе адресных наночастиц с диагностическим флуоресцентным красителем и белкового адресного токсина. Показано строгое синергетическое действие этих токсинов на опухоль, которое позволило снизить действующую дозу противоопухолевых токсинов в 1000 раз в опытах in vitro и существенно улучшить терапевтический эффект in vivo. Данная стратегия позволила замедлить рост опухоли и предотвратить появления метастазов.

  1. Shipunova VO, Komedchikova EN, Kotelnikova PA, Zelepukin IV, Schulga AA, Proshkina GM, Shramova EI, Kutscher HL, Telegin GB, Kabashin AV, Prasad PN, Deyev SM 2020 Dual Regioselective Targeting the Same Receptor in Nanoparticle-Mediated Combination Immuno/Chemotherapy for Enhanced Image-Guided Cancer Treatment. ACS Nano

Лаборатория молекулярной иммунологии (Деев С.М.)

Увеличение эффективности наномедицинских препаратов за счет увеличения времени их циркуляции в кровотоке путем принудительной временной цитоблокады мононуклеарной фагоцитарной системы.

Предложен принципиально новый подход, позволяющий существенно продлить время циркуляции наноагентов в кровотоке и, как следствие, увеличить их терапевтическую активность. Подход, названный «цитоблокадой мононуклеарной фагоцитарной системы» не требует какой-либо модификации наночастиц и заключается во введении в организм относительно небольшого количества антител против собственных эритроцитов. В результате иммунная система «сосредотачивается» на атаке на собственные эритроциты и на какое-то время «перестает видеть» вводимые наноматериалы, которые за это время способны найти целевые патогенные объекты и обеспечить терапевтическое действие. Важной характерной чертой данного подхода является его универсальность, т.е. независимость от природы, размера и других свойств используемых наночастиц [Nat Biomed Eng. 2020]. Еще один разработанный подход к улучшению терапевтического эффекта наноагентов, идеологически близкий к упомянутому выше, состоит во введении в организм «инертных» наноагентов, вызывающих на себя атаку иммунной системы, и только потом наночастиц с лекарством [J. Cont. Release. 2020].

  1. Zelepukin IV, Yaremenko AV, Yuryev MV, Mirkasymov AB, Sokolov IL, Deyev SM, Nikitin PI, Nikitin MP 2020 Fast processes of nanoparticle blood clearance: Comprehensive study. J Control Release 326 181–191
  2. Nikitin MP, Zelepukin IV, Shipunova VO, Sokolov IL, Deyev SM, Nikitin PI 2020 Enhancement of the blood-circulation time and performance of nanomedicines via the forced clearance of erythrocytes. Nat Biomed Eng 4 (7) 717–731

Лаборатория молекулярной тераностики (Мартынов В.И.)

Обнаружен альтернативный механизм синтеза хромофора красных флуоресцентных белков

В настоящее время считается, что синтез хромофора красных флуоресцентных белков проходит через промежуточную «синюю» форму с максимумом поглощения в районе 400 нм, которая непосредственно превращается в «красную» через образование двойной связи в боковой цепи хромофоробразующего остатка Tyr. В настоящей работе на примере хромобелка из из Actinia equina (aeCP) впервые показано, что синтез хромофора DsRed-типа может протекать через промежуточную «зеленую» форму с максимумом поглощения в районе 530 нм.

Отдел структурной биологии

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии (Арсеньев А.С.)

Структурные основы функционирования рецепторов нейротрофинов.

Рецепторы нейротрофинов, в том числе тропомиозиновые киназы и рецептор р75, регулируют жизненный цикл нейронов, участвуя в процессах нейрогенеза и развитии нейродегенеративных заболеваний. Сотрудники лаборатории ЯМР-спектроскопии совместно с коллегами из университета Валенсии изучили структуру и склонность к олигомеризации трасмембранных доменов (ТМД) рецептора TrkA, а также внутриклеточных доменов рецептора р75NTR. Удалось определить пространственную структуру димера ТМД TrkA, а также показать, что внутриклеточные домены р75NTR не проявляют склонности к взаимодействию между собой. Полученные данные позволили сформулировать новые механизмы функционирования указанных рецепторов.

  1. Goncharuk SA, Artemieva LE, Nadezhdin KD, Arseniev AS, Mineev KS 2020 Revising the mechanism of p75NTR activation: intrinsically monomeric state of death domains invokes the 'helper' hypothesis. Sci Rep 10 (1) 13686
  2. Franco ML, Nadezhdin KD, Goncharuk SA, Mineev KS, Arseniev AS, Vilar M 2019 Structural basis of the transmembrane domain dimerization and rotation in the activation mechanism of the TRKA receptor by nerve growth factor. J Biol Chem 295 (1) 275–286

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии (Арсеньев А.С.)

Механизм действия ингибитора LMP1 вируса Эпштейна-Барр.

LMP1 – основной онкоген вируса Эпштейна-Барр. Встраиваясь в мембрану клеток, белок имитирует активное состояние рецептора CD40 и запускает трансформацию клеток в опухолевые. Активация LMP1 управляется его олигомеризацией. Коллектив лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии совместно с коллегами из Института прикладной химии г. Чанчунь, Китай, разработали подход для исследования олигомеризации трансмембранного домена LMP1. Этот подход был применен, для изучения механизмов ингибирования LMP1 низкомолекулярным соединением пентамидин. Было показано, что пентамидин взаимодействует с остатком D150 в заряженном состоянии и нарушает олигомеризацию LMP1 высокого порядка.

  1. Kot EF, Wang Y, Goncharuk SA, Zhang B, Arseniev AS, Wang X, Mineev KS 2020 Oligomerization analysis as a tool to elucidate the mechanism of EBV latent membrane protein 1 inhibition by pentamidine. BIOCHIM BIOPHYS ACTA 1862 (10) 183380

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем (Ефремов Р.Г.)

,  

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии (Арсеньев А.С.)

Анализ конформационной динамики дает новое представление о роли димеризации трансмембранных доменов рецепторов инсулина и инсулин-подобного фактора роста (IGF-1R) в их активации

На основании данных молекулярного моделирования и ЯМР-спектроскопии предложены модели пространственной структуры димеров трансмембранных (ТМ) сегментов рецептора инсулина (IR) и в различных конформационных состояниях. С помощью методов молекулярной динамики в полноатомном и крупнозернистом приближении проведен анализ конформационной подвижности внеклеточного и внутриклеточного доменов IR в явно заданной мембране. Основные результаты: 1) Процесс активации рецептора сопровождается сближением примембранных участков во внеклеточном домене, что вызывает димеризацию ТМ сегментов в активном состоянии. 2) Внутриклеточный примембранный участок не влияет на поведение ТМ сегмента в мембране, свидетельствуя о возможности спонтанной димеризации ТМ доменов при активации. 3) Предложен набор возможных конформаций димеров ТМ доменов IR и IGF-1R, с помощью расчётов свободной энергии димеризации в мембране выявлены их наиболее стабильные состояния. 4) Для обоих белков найдены близкие структуры ТМ-димеров, что может указывать на похожий механизм активации рецепторов.

  1. Kuznetsov AS, Zamaletdinov MF, Bershatsky YV, Urban AS, Bocharova OV, Bennasroune A, Maurice P, Bocharov EV, Efremov RG 2020 Dimeric states of transmembrane domains of insulin and IGF-1R receptors: Structures and possible role in activation. BIOCHIM BIOPHYS ACTA 1862 (11) 183417

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем (Ефремов Р.Г.)

,  

Группа анализа структуры мембранных белков in silico (Чугунов А.О.)

,  

Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов (Козлов С.А.)

Управление работой ионного канала TRPV1 путем внесения в его поровый и TRP-домены точечных мутаций, предсказанных в результате рационального вычислительного дизайна

Функциональные эффекты новых точечных мутаций (G643A, I679A+A680G, K688G/P) в канале рецептора TRPV1, отвечающего за термочувствительность нейронов, предсказанные in silico как своеобразные “горячие точки”, ответственные за открытие канала, были изучены с использованием комплексного подхода, сочетающего молекулярное моделирование, биохимические и электрофизиологические методы. Основное внимание уделяли активации канала в ответ на изменение температуры и добавление капсаицина. Моделирование молекулярной динамики тетрамерного TRPV1 в липидном бислое позволило объяснить на атомистическом уровне результаты экспериментальных наблюдений. Полученные данные позволяют лучше понять термическую и капсаицин-индуцированную активацию TRPV1, а также оценить параметры его проводимости. Результаты исследования необходимы для понимания молекулярных механизмов терморегуляции и ноцицепции, а также для прогнозирования потенциально патогенных мутаций. Продемонстрирована эффективность предложенной универсальной вычислительной стратегии, позволяющей прогнозировать влияние точечных мутаций на различные аспекты функционирования мембранных каналов.

  1. Lubova KI, Chugunov AO, Volynsky PE, Trofimov Y, Korolkova YV, Mosharova IV, Kozlov SA, Andreev YA, Efremov RG 2020 Probing temperature and capsaicin-induced activation of TRPV1 channel via computationally guided point mutations in its pore and TRP domains. Int J Biol Macromol 158 1175–1183

Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул (Феофанов А.В.)

Тераностический агент - конъюгат хлорина е6 с нанокластером бис(дикарболлида) железа

Мы докладываем о свойствах конъюгата хлорина е6 с нанокластером бис(дикарболлида) железа, которые позволили сделать вывод о том, что данный конъюгат является перспективным тераностическим агентом для флуоресцентной диагностики, фотодинамической (ФДТ) и бор-нейтронно-захватной (БНЗТ) терапии опухолей. Этот вывод основан на наших данных, показывающих, что конъюгат (i) эффективно накапливается в клетках глиобластомы крысы С6, доставляя >109 атомов бора на клетку и тем самым удовлетворяя требованиям к агентам для БНЗТ, (ii) обладает яркой (за счет высокого внутриклеточного накопления) красной флуоресценцией в клетках, (iii) обеспечивает фотоиндуцированную 50% гибель клеток С6 при 35 ± 3 нМ, (iv) не токсичен для клеток без активирующего стимула.

Исследования проведены совместно со специалистами Института Тонкой Химической Технологии им. М. В. Ломоносова МИРЭА-Российского технологического университета (Ю.С. Коростей, М.К. Федотова, А.Ф. Миронов, М.А. Грин) и Института элементоорганических соединений им. А. Н. Несмеянова Российской академии наук (И.Б. Сиваев, В.И. Брегадзе)

  1. Ignatova AA, Korostey YS, Fedotova MK, Sivaev IB, Bregadze VI, Mironov AF, Grin MA, Feofanov AV 2020 Conjugate of chlorin е6 with iron bis(dicarbollide) nanocluster: synthesis and biological properties. Future Med Chem 12 (11) 1015–1023

Лаборатория структурной биологии ионных каналов (Шенкарёв З.О.)

,  

Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов (Люкманова Е.Н.)

Определены структуры и изучена динамика четырех трехпетельных белков человека методами ЯМР-спектроскопии

Трехпетельные белки, имеющие характерное строение, включающее Cys-стабилизированное β-структурное ядро и три протяженные петли, встречаются у многих представителей позвоночных, а также обнаружены у членистоногих и иглокожих. Наиболее изученными представителями этих белков являются токсины из яда змей. Однако, особый интерес вызывают представители этого семейства, присутствующие у высших млекопитающих, в том числе человека, и выполняющие роль модуляторов никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (nAChR).

Методами ЯМР был проведён комплексный анализ структурных и динамических свойств ряда «трехпетельных» белков человека, действующих на nAChR. Среди них были представлены как водорастворимые белки (SLURP-1, SLURP-2), так и изолированные трехпетельные LU-домены GPI-заякоренных белков (Lypd6, Lypd6b, Lynx1, Lynx2), а также нейротоксины змей («слабый» токсин WTX и нейротоксин NTII). Для части белков трёхмерная структура и динамика была определена впервые (SLURP-1, Lypd6, Lypd6b, Lynx2).

Были обнаружены два типа топологии β-структуры: один широкий β-лист для Lypd6 и Lypd6b и два β-слоя для остальных белков. α-Спиральные сегменты, которые до этого редко наблюдались для трехпетельных белков, были обнаружены в I и III петлях Lypd6, Lypd6b и Lynx2. Показана зависимость способа взаимодействия модулятора с рецептором от особенностей пространственного строения, таких как распределение заряженных и гидрофобных остатков на поверхности. Показана значительная конформационная пластичность трехпетельных белков: петли были очень мобильными в пикосекундно-наносекундном диапазоне времен, в то время как β-структурные области демонстрировали движения в масштабах микросекунды-миллисекунды. Предположительно, пластичность может быть важной особенностью трехпетельных белков человека.

  1. Paramonov AS, Kocharovskaya MV, Tsarev AV, Kulbatskii DS, Loktyushov EV, Shulepko MA, Kirpichnikov MP, Lyukmanova EN, Shenkarev ZO 2020 Structural Diversity and Dynamics of Human Three-Finger Proteins Acting on Nicotinic Acetylcholine Receptors. Int J Mol Sci 21 (19) 1–26

Лаборатория структурной биологии ионных каналов (Шенкарёв З.О.)

,  

Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов (Люкманова Е.Н.)

,  

Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии (Василевский А.А.)

Впервые обнаружен токсин-связывающий сайт в потенциал-чувствительном домене III канала Nav1.4 человека

Изучение взаимодействия ионных каналов с лигандами, модулирующими их активность, крайне важно с точки зрения понимания механизмов функционирования и разработки новых лекарственных средств для лечения заболеваний, связанных с различными каналопатиями. Методами ЯМР-спектроскопии проведено исследование взаимодействия потенциал-чувствительного домена из третьей субъединицы Na+ канала человека Nav1.4 (ПЧД-III) с токсином Hm-3 из яда паука. Несмотря на то, что ранее не предполагалось наличия сайта связывания токсина на этом домене из-за взаимодействия домена с бета-субъединицей канала, нами впервые обнаружено наличие такого сайта, а также оценена энергетика взаимодействия токсин/домен. Показано, что аффинность Hm-3 к ПЧД-III выше, чем для «канонических» сайтов связывания на втором и первом домене канала.

Лаборатория структурной биологии ионных каналов (Шенкарёв З.О.)

,  

Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов (Люкманова Е.Н.)

Водорастворимый вариант белка человека Lynx1 положительно влияет на синаптическую пластичность и восстанавливает когнитивные нарушения, связанные с дисфункцией α7-nAChR

Lynx1 – это GPI-заякоренный белок, солокализованный с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами (nAChR) в областях мозга, важных для обучения и памяти. Ранее мы показали, что при низких микромолярных концентрациях водорастворимый вариант Lynx1, лишенный GPI-якоря (ws-Lynx1), действует на α7-nAChR как положительный аллостерический модулятор. Мы предположили, что ws-Lynx1 может быть использован для улучшения когнитивных процессов, зависящих от nAChR. В представленной работе мы показали, что 2 мкМ ws-Lynx1 увеличивает вызванный ацетилхолином ток на α7-nAChR в интернейронах L1 первичной зрительной коры крыс. При более высоких концентрациях ws-Lynx1 ингибирует α7-nAChR, экспрессированные в ооцитах X. laevis, с IC50 ~ 50 мкМ. Была показана способность ws-Lynx1 проникать через гематоэнцефалический барьер при интраназальном введении у мышей линии C57BL/6 и накапливаться в коре головного мозга, гиппокампе и мозжечке. Длительный прием ws-Lynx1 предотвращает ухудшение обонятельной памяти и моторного обучения, вызванных ингибитором α7-nAChR метилликаконитином (MLA). Прием ws-Lynx1 также стимулировал долговременную потенциацию в срезах гиппокампа мышей, принимающих препарат, и отменял блокаду долговременной потенциации, наблюдающуюся при приеме MLA.

Чтобы понять механизм действия ws-Lynx1, мы изучили взаимодействие ws-Lynx1 и MLA по отношению к α7-nAChR, измерили базальные концентрации эндогенного Lynx1 и α7-nAChR и их ассоциацию в мозге мыши. Мы предположили, что во взрослом мозге эндогенный Lynx1 ограничивает активацию α7-nAChR. При этом, ws-Lynx1 может частично вытеснять эндогенный Lynx1, вызывая тем самым положительную модуляцию α7-nAChR и повышение синаптической пластичности. Ws-Lynx1 и подобные соединения могут быть полезны для лечения когнитивных нарушений, связанных с дисфункцией холинергической системы.

  1. Shenkarev ZO, Shulepko MA, Bychkov ML, Kulbatskii DS, Shlepova OV, Vasilyeva NA, Andreev-Andrievsky AA, Popova AS, Lagereva EA, Loktyushov EV, Koshelev SG, Thomsen MS, Dolgikh DA, Kozlov SA, Balaban PM, Kirpichnikov MP, Lyukmanova EN 2020 Water-Soluble Variant of Human Lynx1 Positively Modulates Synaptic Plasticity and Ameliorates Cognitive Impairment Associated with a7-nAChR Dysfunction. J Neurochem

Группа анализа структуры мембранных белков in silico (Чугунов А.О.)

,  

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем (Ефремов Р.Г.)

Модель пирофосфатного фармакофора: как низин связывает липид II

С помощью компьютерного моделирования молекулярной динамики было установлено, что в основе их высокоселективного взаимодействия лежит способность пирофосфатной группы липида II формировать уникальный фармакофор на поверхности бислоя, состоящий из двух атомов кислорода из соседних фосфатных остатков, разделенных характерным расстоянием 3 Å. Этот фармакофор не может быть образован фосфолипидами мембраны и при этом он хорошо подходит для образования целого кластера водородных связей со стороны амидных групп антимикробного пептида низина, что и лежит в основе селективного связывания. Мы показали, что взаимное молекулярное распознавание происходит по механизму индуцированного соответствия и зависит от свойств окружающей среды. Так, среди конформационных ансамблей обоих партнеров было найдено всего одно-два состояния, подходящих для образования комплекса. Эти результаты могут быть полезны для разработки новых антибиотиков на основе низина. Эта работа продолжает наше исследование про особенности липида II, позволяющие назвать его «Ахиллесовой пятой» мембраны бактерий. Подробнее о нашей работе пишет научно-популярный журнал «За науку».

  1. Panina I, Krylov N, Nolde D, Efremov R, Chugunov A 2020 Environmental and dynamic effects explain how nisin captures membrane-bound lipid II. Sci Rep 10 (1) 8821

Отдел геномики и постгеномных технологий

Лаборатория регуляторной транскриптомики (Ажикина Т.Л.)

Малая некодирующая РНК Mycobacterium tuberculosis MTS1338 – бактериальный фактор вирулентности, модулирующий иммунный ответ при инфекции

Малая некодирующая РНК MTS1338 присутствует только в геномах патогенных микобактерий туберкулезного комплекса и высоко экспрессируется при инфекции макрофагов. Мы показали, что MTS1338 обеспечивает сопротивляемость микобактерий к окислительному стрессу, замедляет созревание фаголизосом при инфекции макрофагов и моделирует иммунный ответ, активируя синтез провоспалительных цитокинов. Созданные мутантные штаммы с делетированным геном MTS1338 демонстрировали существенное снижение вирулентности M. tuberculosis при инфекции мышей. Таким образом, малая некодирующая РНК MTS1338 – новый фактор вирулентности M. tuberculosis, обеспечивающий внутриклеточное выживание микобактерий.

  1. Bychenko OS, Skvortsova YV, Grigorov AS, Azhikina TL 2020 Use of Genetically Encoded Fluorescent Aptamers for Visualization of Mycobacterium tuberculosis Small RNA MTS1338 in Infected Macrophages. Dokl Biochem Biophys 493 (1) 185–189
  2. Ostrik AA, Salina EG, Skvortsova YV, Grigorov AS, Bychenko OS, Kaprelyants AS, Azhikina TL 2020 Small RNAs of Mycobacterium tuberculosis in Adaptation to Host-Like Stress Conditions in vitro. APPL BIOCHEM MICRO+ 56 (4) 381–386
  3. Salina EG, Grigorov AS, Skvortsova YV, Majorov KB, Bychenko OS, Ostrik AA, Logunova NN, Ignatov DV, Kaprelyants AS, Apt AS, Azhikina TL 2019 MTS1338, A Small Mycobacterium tuberculosis RNA, Regulates Transcriptional Shifts Consistent With Bacterial Adaptation for Entering Into Dormancy and Survival Within Host Macrophages. Front Cell Infect Microbiol 9 405

Лаборатория молекулярных основ эмбриогенеза (Зарайский А.Г.)

Открытие четырех генов семейства Noggin у миног согласуется с гипотезой о двух раундах геномных дупликаций у предков позвоночных

Сотрудники Лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза, в сотрудничестве с коллегой из ИПЭЭ им. Северцова, впервые описали четыре гена семейства Noggin у древнейших представителей позвоночных - миног, и провели сравнение их структуры, экспрессии и особенностей функционирования с таковыми известных генов данного семейства у других позвоночных. Гены Noggin кодируют секретируемые факторы, регулирующие многие важные процессы в эмбриогенезе. В результате был сделан вывод о том, что вся совокупность полученных данные в наилучшей степени согласуется с гипотезой о двух последовательных раундах дупликации предкового генома беспозвоночных, произошедших на самом раннем этапе эволюции позвоночных, т.е. около 550 миллионов лет назад, в Палеозойскую эру.

  1. Ermakova GV, Kucheryavyy AV, Zaraisky AG, Bayramov AV 2020 Publisher Correction: Discovery of four Noggin genes in lampreys suggests two rounds of ancient genome duplication. Communications Biology 3 (1) 532

Лаборатория молекулярных основ эмбриогенеза (Зарайский А.Г.)

,  

Отдел метаболизма и редокс-биологии (Белоусов В.В.)

Новый механизм регуляции стволового статуса эмбриональных клеток

Сотрудники лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН в техническом сотрудничестве с коллегами из отдела метаболизма и редокс-биологии ИБХ РАН, лаборатории геномики и эпигеномики позвоночных Федерального центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, а также группы клеточной подвижности Института белка РАН, открыли не известный ранее механизм регуляции активности генов, определяющих плюрипотентный статус эмбриональных стволовых клеток. Данный механизм основан на способности цитоскелетного белка Zyxin вытеснять мРНА генов плюрипотентности из комплексов с мРНК-стабилизирующим белком Ybx1, что ускоряет деградацию этих мРНК. Авторы предполагают, что этот механизм помогает координировать процессы морфогенеза и клеточной дифференцировки в эмбриогенезе.

  1. Parshina EA, Eroshkin FM, Оrlov EE, Gyoeva FK, Shokhina AG, Staroverov DB, Belousov VV, Zhigalova NA, Prokhortchouk EB, Zaraisky AG, Martynova NY 2020 Cytoskeletal Protein Zyxin Inhibits the Activity of Genes Responsible for Embryonic Stem Cell Status. Cell Rep 33 (7) 108396

Группа геномного анализа сигнальных систем клетки (Буздин А.А.)

Репертуар назначаемых противораковых препаратов не отражает особенности молекулярной гетерогенности опухолей

Мы провели первое исследование соответствия репертуара используемых противораковых препаратов реальной внутригрупповой гетерогенности в опухолях. Для этого были взяты 4980 образцов тканей, представляющих 13 наиболее распространенных видов рака у человека, для которых были доступны полноэкзомные мутационные и полнотранскриптомные профили. Сначала исследовали гипотезу, соотносится ли количество одобренных препаратов (в проекции на их молекулярные мишени) с размером внутригрупповой гетерогенности для каждого вида рака: как по всем генам, так и только по генам молекулярных мишеней препаратов. Оказалось, что связи между реальной молекулярной гетерогенностью и богатством спектра одобренных препаратов нет: ни на уровне транскриптомных, ни на уровне мутационных данных. Затем сравнили качественные характеристики: насколько режимы лечения разных видов рака в части используемых препаратов отражают молекулярные профили соответствующих опухолей. Впервые обнаружено сходство классификации опухолей по режимами лечения с классификацией по профилям генной экспрессии, но не по мутационным профилям. Наилучшим образом молекулярных профилям соответствовали методы лечения рака почки, желудка, мочевого пузыря, яичников и эндометрия. Хуже всего – опухолей мозга, рака простаты и толстой кишки.

  1. Zolotovskaia MA, Sorokin MI, Petrov IV, Poddubskaya EV, Moiseev AA, Sekacheva MI, Borisov NM, Tkachev VS, Garazha AV, Kaprin AD, Shegay PV, Giese A, Kim E, Roumiantsev SA, Buzdin AA 2020 Disparity between Inter-Patient Molecular Heterogeneity and Repertoires of Target Drugs Used for Different Types of Cancer in Clinical Oncology. Int J Mol Sci 21 (5) 1–18

Группа генной иммуноонкотерапии (Алексеенко И.В.)

Экспрессия генов, связанных с эпителиально-мезенхимальным переходом (ЭМП), в клетках рака прямой кишки определяет активацию фибробластов и ремоделирование коллагена

Перестройка структуры коллагена тесно связана с прогрессией раковых опухолей. Хотя она осуществляется, в первую очередь, опухоль-ассоциированными фибробластами, вклад разных клеточных компонентов в этот процесс изучен недостаточно. Мы исследовали связь между ЭМП состоянием раковых клеток, их способностью активировать нормальные фибробласты и ремоделировать внеклеточный матрикс. Используя иммунофлуоресцентный анализ, РНК-секвенирование (RNA-seq) и микроскопию генерации второй гармоники (ГВГ), мы впервые описали одновременные изменения фенотипической, транскриптомной и ремоделирующей активностей в фибробластах и раковых клетках при их совместной культивации in vitro и in vivo, а также корреляцию этих изменений с фенотипом раковых клеток. При ко-культивации наблюдалось изменение экспрессии многих генов, сопровождающееся активацией фибробластов и перестройкой коллагенового матрикса. Определены возможные лиганд-рецепторные взаимодействия между фибробластами и раковыми клетками. Работа выполнена совместно с НИИ экспериментальной онкологии и биомедицинских технологий ПИМУ.

  1. Druzhkova I, Shirmanova M, Ignatova N, Dudenkova V, Lukina M, Zagaynova E, Safina D, Kostrov S, Didych D, Kuzmich A, Sharonov G, Rakitina O, Alekseenko I, Sverdlov E 2020 Expression of EMT-Related Genes in Hybrid E/M Colorectal Cancer Cells Determines Fibroblast Activation and Collagen Remodeling. Int J Mol Sci 21 (21)
  2. Alekseenko IV, Chernov IP, Kostrov SV, Sverdlov ED 2020 Are Synapse-Like Structures a Possible Way for Crosstalk of Cancer with Its Microenvironment? Cancers (Basel) 12 (4)

Отдел молекулярной нейроиммунной сигнализации

Отдел молекулярной нейроиммунной сигнализации (Цетлин В.И.)

,  

Лаборатория молекулярной токсинологии (Уткин Ю.Н.)

,  

Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий (Кашеверов И.Е.)

Комплексный подход: от токсин-рецепторных взаимодействий к высокочувствительной диагностике

Применение радиолигандного анализа, электрофизиологии и флуоресценции в анализе токсин-рецепторных взаимодействий было расширено использованием гель-хроматографии комплексов в сочетании с масс-спектрометрией для определения констант взаимодействия, а также привлечением ведущих отечественных спектроскопистов , что позволило детально охарактеризовать связывание нейротоксинов с пептидами, моделирующими активный центр рецептора [1], а также добиться детекции в плазме крови тропонина (индикатора заболеваний сердца) в уникально низкой концентрации 1pg/ml [2].

  1. Melentiev PN, Son LV, Kudryavtsev DS, Kasheverov IE, Tsetlin VI, Esenaliev RO, Balykin VI 2020 Ultrafast, Ultrasensitive Detection and Imaging of Single Cardiac Troponin-T Molecules. ACS Sens
  2. Tsetlin VI, Kasheverov IE, Utkin YN 2020 Three-finger proteins from snakes and humans acting on nicotinic receptors: old and new. J Neurochem

Отдел молекулярной нейроиммунной сигнализации (Цетлин В.И.)

,  

Лаборатория молекулярной токсинологии (Уткин Ю.Н.)

,  

Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий (Кашеверов И.Е.)

,  

Лаборатория оксилипинов (Безуглов В.В.)

Новые эндогенные модуляторы ацетилхолиновой системы и селективные агонисты, действующие на раковые и иммунные клетки

Впервые установлено, что эндогенные аналоги ацетилхолина, в которых ацетильная группа замещена на ненасыщенные жирные кислоты, являются модуляторами ацетилхолиновой системы, способными ингибировать мышечные и нейрональные альфа7 никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАХР), а также ацетилхолинэстеразау. Было установлено, что арахидоноилхолин проявляет антиоксидантную активность в моделях in vitro и ex vivo. В А549 раковых клетках, рост которых усиливается при активации альфа7 нАХР, эти соединения дозозависимо ингибировали их рост на 50%. С использованием PNU 282,987, селективного агониста альфа7 нАХР, мы исследовали влияние активации этих рецепторов на экспрессию цитокинов и, впервые, на экспрессию мембранных макрофагальных маркеров. При этом было установлено, что экспрессия HLA-DR, CD54, и CD11b увеличивается , а экспрессия CD14 рецептора уменьшается. При этом, наряду с известным ранее уменьшением экспрессии TNF-α, отмечено значительное снижение экспрессии цитокина IL-10, что может иметь большое значение для борьбы с сепсисом и иммуносупрессией при «цитокиновом шторме».

 

1. Akimov MG, Kudryavtsev DS, Kryukova EV, Fomina-Ageeva EV, Zakharov SS, Gretskaya NM, Zinchenko GN, Serkov IV, Makhaeva GF, Boltneva NP, Kovaleva NV, Serebryakova OG, Lushchekina SV, Palikov VA, Palikova Y, Dyachenko IA, Kasheverov IE, Tsetlin VI, Bezuglov VV. Arachidonoylcholine and Other Unsaturated Long-Chain Acylcholines Are Endogenous Modulators of the Acetylcholine Signaling System. Biomolecules. 2020 Feb 12;10(2):283.
2. Akimov MG, Dudina PV, Fomina-Ageeva EV, Gretskaya NM, Bosaya AA, Rudakova EV, Makhaeva GF, Kagarlitsky GO, Eremin SA, Tsetlin VI, Bezuglov VV. Neuroprotective and Antioxidant Activity of Arachidonoyl Choline, Its Bis-Quaternized Analogues and Other Acylcholines. Dokl Biochem Biophys. 2020 Mar;491(1):93-97.
3. Siniavin AE, Streltsova MA, Kudryavtsev DS, Shelukhina IV, Utkin YN, Tsetlin VI. Activation of α7 Nicotinic Acetylcholine Receptor Upregulates HLA-DR and Macrophage Receptors: Potential Role in Adaptive Immunity and in Preventing Immunosuppression. Biomolecules. 2020 Mar 27;10(4):507.

Лаборатория молекулярной токсинологии (Уткин Ю.Н.)

,  

Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий (Кашеверов И.Е.)

,  

Лаборатория биологических испытаний (Дьяченко И.А.)

Впервые трех-петельные нейротоксины и новые аналоги брадикинин-петенцирующих пептидов обнаружены в яде гадюк с использованием транскриптомики и количественной протеомики

Из яда гадюки Azemiops feae ранее нами был выделен аземиопсин, новый нейротоксин, ингибирующий никотиновый рецептор ацетилхолина. Для характеристики других токсинов A. feae был использован метод количественной протеомики, который выявил 120 уникальных белков. Всего были идентифицированы токсины, представляющие 14 семейств, среди которых брадикинин-потенцирующие пептиды с уникальными аминокислотными последовательностями обладали биологической активностью in vivo. Протеомный анализ выявил также необычные трех-петельные токсины, относящиеся к группе токсинов, обладающих нейротоксичностью. Это первое указание на присутствие трех-петельных нейротоксинов в ядах гадюк. Параллельно с этим транскриптомный анализ ядовитой железы, проведенный методом высокопроизводительного секвенирования (NGS), дополнительно выявил 206 предполагаемых транскриптов яда. Комбинированное исследование позволило охарактеризовать протеом яда и транскиптом ядовитой железы A. feae, которые в целом напоминают таковые у других змей из семейства Viperidae. Однако были открыты новые токсины, ранее не обнаруженные в ядах гадюк, в том числе трех-петельные нейротоксины и необычные брадикинин-потенцирующие пептиды.

  1. Babenko VV, Ziganshin RH, Weise C, Dyachenko I, Shaykhutdinova E, Murashev AN, Zhmak M, Starkov V, Hoang AN, Tsetlin V, Utkin Y 2020 Novel Bradykinin-Potentiating Peptides and Three-Finger Toxins from Viper Venom: Combined NGS Venom Gland Transcriptomics and Quantitative Venom Proteomics of the Azemiops feae Viper. Biomedicines 8 (8)

Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий (Кашеверов И.Е.)

Создание нового соединения высокоселективного к α3β2 никотиновому холинорецептору (нАХР) и выяснение механизма его действия

Два подтипа никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР) - α3β2 и α3β4 играют важную роль в различных физиологических процессах, а также задействованы в некоторых патологиях. К настоящему времени практически не известно высоко эффективных соединений, различающих эти подтипы. На основе структуры α-конотоксина LvIA из яда морского моллюска Conus lividus, методом аланинового сканирования был получен аналог [N9A]LvIA со сродством к α3β2 на 3 порядка большим, чем к α3β4 нАХР. Получение кристаллической структуры этого соединения с ацетилхолин-связывающим белком и компьютерное моделирование комплекса [N9A]LvIA с α3β2 и α3β4 рецепторами позволили выявить аминокислотные остатки в β2 субъединице Phe106, Ser108, Ser113, Ser168, определяющие высокую селективность нового лиганда к α3β2 подтипу, что было подтверждено мутациями этих остатков.

  1. Zhu X, Pan S, Xu M, Zhang L, Yu J, Yu J, Wu Y, Fan Y, Li H, Kasheverov IE, Kudryavtsev DS, Tsetlin VI, Xue Y, Zhangsun D, Wang X, Luo S 2020 High Selectivity of an α-Conotoxin LvIA Analogue for α3β2 Nicotinic Acetylcholine Receptors Is Mediated by β2 Functionally Important Residues. J Med Chem 63 (22) 13656–13668

Лаборатория оксилипинов (Безуглов В.В.)

Эндованилоиды ацилдофамины - регуляторы биосинтеза холестерина и ингибиторы миграции клеток рака молочной железы

Впервые установлено, что уровень холестерина в раковых клетках является важным параметром, определяющим их чувствительность к цитотоксическому действию эндованилоидов ацилдофаминов. Снижение содержания холестерина в клетках и, прежде всего в цитоплазматической мембране, приводит к повышению цитотоксичности ацилдофаминов, предположительно в результате разрушения рафтов. Также впервые показано, что ацилдофамины в клетках рака молочной железы ингибируют их миграцию, эпителиально-мезинхимальный переход и стволовость (stemness). Кроме того ацилдофамины ингибируют ключевые гены биосинтеза холестерина в раковых клетках. Данный результат важен для разработки новых терапевтических стратегий борьбы с онкологическими заболеваниями, основанных на использовании эндогенных противораковых соединений и малых молекул, синтезированных на шаблоне их структур.

  1. Akimov MG, Dudina PV, Gamisonia AM, Gretskaya NM, Zinchenko GN, Mandal CC, Bezuglov VV 2020 The Influence of the Cholesterol Level in Cells on Endovanilloid Cytotoxicity. Dokl Biochem Biophys 493 (1) 167–170

Отдел биоинженерии

Лаборатория инженерии белка (Долгих Д.А.)

,  

Лаборатория молекулярной иммунологии (Деев С.М.)

Рецептор-специфический вариант DR5-B цитокина TRAIL обладает повышенной противоопухолевой активностью и имеет улучшенный фармакокинетический профиль

Нами был сконструирован рецептор-специфический вариант DR5-B противоопухолевого цитокина TRAIL, который обладает уникальным свойством селективно связываться только с рецептором смерти DR5, запускающим апоптоз, но не имеет сродства к рецептору DR4 и рецепторам-ловушкам DcR1, DcR2 и OPG. Исследование DR5-B показало, что он проявляет повышенную проапоптотическую активность в опухолевых клетках как отдельно, так и в комбинации с химиопрепаратами. DR5-B ингибирует рост опухоли в ксенотрансплантантах HCT116 и Caco-2 с эффективностью, в 2,5-3 раза превосходящей таковую для цитокина дикого типа, а также значительно увеличивает выживаемость животных. Фармакокинетические параметры DR5-B сопоставимы с параметрами TRAIL дикого типа, но период его полувыведения в 3,5 раза выше. Таким образом, рецептор-специфический вариант DR5-B цитокина TRAIL может являться эффективным средством для терапии опухолевых заболеваний.

  1. Аrtykov АА, Belov DA, Shipunova VO, Trushina DB, Deyev SM, Dolgikh DA, Kirpichnikov MP, Gasparian ME 2020 Chemotherapeutic Agents Sensitize Resistant Cancer Cells to the DR5-Specific Variant DR5-B more Efficiently than to TRAIL by Modulating the Surface Expression of Death and Decoy Receptors. Cancers (Basel) 12 (5)
  2. Yagolovich AV, Artykov AA, Karmakova TA, Vorontsova MS, Pankratov AA, Andreev-Andrievsky AA, Dolgikh DA, Kirpichnikov MP, Gasparian ME 2020 Genetically Modified DR5-Specific TRAIL Variant DR5-B Revealed Dual Antitumor and Protumoral Effect in Colon Cancer Xenografts and an Improved Pharmacokinetic Profile. Transl Oncol 13 (4) 100762

Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов (Люкманова Е.Н.)

,  

Лаборатория структурной биологии ионных каналов (Шенкарёв З.О.)

,  

Группа анализа структуры мембранных белков in silico (Чугунов А.О.)

Определена роль природных мутаций белка человека SLURP-1 в патогенезе кожного заболевания Mal de Meleda

Mal de Meleda (MDM) – это рецессивно наследуемая подошвенная кератодермия, связанная с мутациями в гене, кодирующем белок SLURP-1. SLURP-1 контролирует рост, дифференцировку и апоптоз кератиноцитов путем взаимодействия с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами α7-типа (α7-nAChR). SLURP-1 имеет трехпетельную структуру с β-структурным ядром («головой»). Чтобы определить роль мутаций SLURP-1, мы получили 24 мутантных варианта белка с заменами в различных частях молекулы SLURP-1, включая природные варианты, участвующие в развитии MDM. Все мутанты, кроме R71/H/P/A, T52/A, R96/P и L98/P, были успешно рефолдированы из цитоплазматических телец включения. Антипролиферативную активность мутантов изучали на кератиноцитах человека Het-1A. Мутации в петлях I и III приводили к частичной или полной инактивации SLURP-1, в то время как большинство мутаций в петле II увеличивали антипролиферативную активность SLURP-1. Замена остатков R96 и L98, расположенных в «голове» белка, на аланин, приводила к проявлению проапоптотической активности SLURP-1. Наши результаты согласуются с наблюдаемым разнообразием фенотипов MDM. На основе полученных функциональных данных построена модель комплекса SLURP-1/α7-nAChR. Наше исследование предоставляет новую функциональную и структурную информацию о роли мутаций SLURP-1 в патогенезе MDM и предсказывает новые варианты SLURP-1, которые могут вызывать заболевание.

Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов (Люкманова Е.Н.)

,  

Лаборатория структурной биологии ионных каналов (Шенкарёв З.О.)

,  

Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов (Козлов С.А.)

,  

Лаборатория мембранных и биоэнергетических систем (Шахпаронов М.И.)

Ингибитор каналов ASIC мамбалгин – новый прототип препаратов для направленной терапии онкозаболеваний

Протон-управляемые каналы ASIC1 являются молекулярной мишенью трехпетельных токсинов из яда черной мамбы (Dendroaspis polylepis) – мамбалгинов. Мамбалгины эффективно ингибируют гомо- и гетеромерные рецепторы, содержащие субъединицу ASIC1a, однако возможность их использования в качестве противоопухолевых агентов ранее не исследовалась. Показано, что мРНК ASIC1а экспрессируется в клетках хронической миелогенной лейкемии и глиом, но не в нормальных клетках. Мамбалгин-2 подавлял рост клеток глиомы U251 MG и A172 с ЕС50 в наномолярном диапазоне, не влияя на пролиферацию нормальных астроцитов. Примечательно, что мутанты мамбалгина-2 не влияли на рост клеток глиомы, указывая на ASIC1a как на главную молекулярную мишень мамбалгина-2 в глиомных клетках. Мамбалгин-2 вызывал остановку клеточного цикла, ингибировал фосфорилирование циклина D1 и циклин-зависимых киназ (CDK) и вызывал апоптоз в глиомных клетках. Кроме того, мамбалгин-2 подавлял рост клеток первичной линии, полученной от пациента с глиобластомой. Наши данные указывают на мамбалгин-2 как на перспективный прототип препаратов для направленного лечения онкозаболеваний, и на каналы, содержащие субъединицу ASIC1a, как на новую мишень таргетной терапии.

  1. Bychkov M, Shulepko M, Osmakov D, Andreev Y, Sudarikova A, Vasileva V, Pavlyukov MS, Latyshev YA, Potapov AA, Kirpichnikov M, Shenkarev ZO, Lyukmanova E 2020 Mambalgin-2 Induces Cell Cycle Arrest and Apoptosis in Glioma Cells via Interaction with ASIC1a. Cancers (Basel) 12 (7) 1–20
  2. Osmakov DI, Khasanov TA, Andreev YA, Lyukmanova EN, Kozlov SA 2020 Animal, Herb, and Microbial Toxins for Structural and Pharmacological Study of Acid-Sensing Ion Channels. Front Pharmacol 11 991
  3. Bychkov ML, Shulepko MA, Vasileva VY, Sudarikova AV, Kirpichnikov MP, Lyukmanova EN 2020 ASIC1a Inhibitor mambalgin-2 Suppresses the Growth of Leukemia Cells by Cell Cycle Arrest. Acta Naturae 12 (2) 101–116

Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов (Люкманова Е.Н.)

,  

Лаборатория структурной биологии ионных каналов (Шенкарёв З.О.)

,  

Группа анализа структуры мембранных белков in silico (Чугунов А.О.)

Методом cryo-EM определены структуры комплексов внеклеточного домена a7-nAChR с нейротоксинами a-Bgtx и WTX

Методами крио-электронной микроскопии получены изображения комплексов внеклеточного домена a7-nAChR с нейротоксинами a-Bgtx и WTX, что позволило в обоих случаях определить структуры комплексов со средним разрешением 3.5 А и 6.0 А, соответственно. Методами ЯМР-спектроскопии и сайт-направленного мутагенеза были получены дополнительные данные о взаимодействии токсина WTX с мембранным окружением a7-nAChR и самим рецептором. Полученные данные позволили методами компьютерного моделирования построить модель комплекса полноразмерного рецептора a7-nAChR с токсином WTX в мембранном окружении, что в свою очередь позволило описать новый тип взаимодействия нейротоксин/рецептор, не описанный ранее. В процессе работы также был разработан новый метод подтверждения комплексообразования рецептор-лиганд с применением флуоресцентно-меченых лигандов и гель-фильтрации.

  1. Kulbatskii DS, Shulepko MA, Sluchanko NN, Yablokov EO, Kamyshinsky RA, Chesnokov YM, Kirpichnikov MP, Lyukmanova EN 2020 Efficient screening of ligand-receptor complex formation using fluorescence labeling and size-exclusion chromatography. Biochem Biophys Res Commun

Группа нанобиоинженерии (Некрасова О.В.)

,  

Отдел структурной биологии (Арсеньев А.С.)

,  

Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул (Феофанов А.В.)

,  

Отдел биоинженерии (Кирпичников М.П.)

Новые флуоресцентные зонды на основе хонготоксина для поиска и изучения блокаторов калиевых каналов Kv1.1 и Kv1.3

Методами биоинженерии получены новые генокодируемые флуоресцентные лиганды на основе хонготоксина 1 и красного флуоресцентного белка tagRFP, локализованного на N- или С-конце химерного белка: RFP-L1-HgTx1 и HgTx1-L3-RFP.
Константы диссоциации комплексов RFP-L1-HgTx1 и HgTx1-L3-RFP с сайтами связывания потенциал-зависимых калиевых каналов Kv1.x (x = 1, 3) находятся в наномолярном диапазоне концентраций.
RFP-L1-HgTx1 и HgTx1-L3-RFP могут быть использованы в составе биоинженерных клеточных систем на основе гибридных каналов KcsA-Kv1.x (x = 1, 3) для поиска и изучения блокаторов Kv1.1 и Kv1.3 каналов, представляющих интерес для лечения заболеваний, сопровождающихся нарушением активности калиевых каналов.

Работа выполнена при участии студентов биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова А.Л. Примак и М.А. Скутель. Работа поддержана грантом РНФ 19-74-30014.

  1. Primak AL, Skutel MA, Nekrasova OV, Arseniev AS, Kirpichnikov MP, Feofanov AV 2020 Kv1 Potassium Channel Ligands Based On Hongotoxin 1 and Red Fluorescent Protein. Russ. J. Bioorganic Chem. 46 (6) 1011–1017
  2. Skutel M, Primak A, Kirpichnikov M, Arseniev A, Feofanov A, Nekrasova O 2020 RFP-tagged Hongotoxin 1 and Its Interactions with KscA-Kv1.1 Hybrid Channels. Microsc Microanal

Отдел молекулярной нейробиологии

Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов (Козлов С.А.)

,  

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем (Ефремов Р.Г.)

,  

Лаборатория химии метаболических путей (Ямпольский И.В.)

,  

Лаборатория биологических испытаний (Дьяченко И.А.)

Разработаны новые анальгетические препараты, пригодные для перорального использования

Среди кислоточувствительных ионных каналов (ASIC) субъединицы ASIC1a и ASIC3 являются наиболее привлекательными фармакологическими мишенями. Ингибирование этих каналов специфичными лигандами - прямой путь к лечению социально значимых заболеваний, таких как хроническая и патологическая боль, инсульт, балезнь Паркинсона. Растительный лигнан Севанол, выделенный ранее из темьяна, ингибирует активность изоформ ASIC1a и ASIC3 и оказывает значительное обезболивающее и противовоспалительное действие. Однако, его синтез сложен и содержит много стадий. Проведенные структурно-функциональные исследования позволили минимизировать структуру Севанола с сохранением как анальгетической активности на животных моделях, так и ингибирующее действие на ASIC. На структурном уровне было предсказано наличие сайта связывания Севанола в центральном вестибюле ASIC1a и показана его конкуренция за этот участок связывания с FRRF-амидным пептидом. Разработанные аналоги Севанола оказывали значительное обезболивающее и противовоспалительное действие при различных способах введения - внутривенное или внутримышечное (парентеральные способы), а также интраназальное или пероральное (неинвазивные способы). Разработанные методики синтеза аналогов позволяют уже сегодня начать внедрение этих потенциальных лекарственных средств в практические исследования, так как отсутствие выявленных побочных действий на данный момент и способ действия через желудочно-кишечный тракт являются важными конкурентными преимуществами новых молекул над существующими анальгетическими препаратами. Работа опубликована в журнале Pharmaceuticals (Basel).

Авторы: Осмаков Д.И, Владимиров А.А., Кошелев С.Г, Андреев Я.А., Козлов С.А. – лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН, Белозерова О.А., Кульбитский В.С.- лаборатория химии метаболических путей ИБХ РАН, Чугунов А.О., Ефремов Р.Г. - лаборатории моделирования биомолекулярных систем ИБХ РАН, Паликов В.А., Паликова Ю.А., Шайхутдинова Э.Р., Дьяченко И.А. - лаборатория биологических испытаний ФИБХ РАН, Гвозль А.Н. - ФГБУН "Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства"

  1. Belozerova OA, Osmakov DI, Vladimirov A, Koshelev SG, Chugunov AO, Andreev YA, Palikov VA, Palikova YA, Shaykhutdinova ER, Gvozd AN, Dyachenko IA, Efremov RG, Kublitski VS, Kozlov SA 2020 Sevanol and Its Analogues: Chemical Synthesis, Biological Effects and Molecular Docking. Pharmaceuticals (Basel) 13 (8) 1–21

Лаборатория внесинаптической передачи (Семьянов А.В.)

,  

Отдел биоинженерии (Кирпичников М.П.)

,  

Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов (Люкманова Е.Н.)

Сокращение потребления калорий стимулирует рост астроцитов и улучшает синаптическую пластичность в мозге

Известно, что сокращение потребления пищи оказывает нейропротекторное действие, замедляет возрастное снижение когнитивных способностей и снижает вероятность наступления нейродегенеративных заболеваний, однако роль астроцитов в этом процессе недостаточно изучена. Были исследованы две группы животных, возрастом 3 месяца. Первая группа получала пищу ad libitum, вторая 70 % от среднесуточного потребления первой группы. У второй группы в результате одного месяца диеты произошли морфологические и функциональные изменения в астроцитах гиппокампа по сравнению с первой группой: увеличилась объемная доля дистальных перисинаптических астроцитарных листочков. Увеличение размеров астроцита должно было привести к увеличению проводимости, а, следовательно, уменьшению сопротивления мембраны астроцитов. Однако этого не произошло потому, что в астроцитах снизилась экспрессия коннексинов, образующих гап-контакты. Это не только сбалансировало сопротивления мембраны, но и снизило связанность астроцитов в сети. Наблюдаемые морфологические изменения в астроцитах также привели к функциональным. Более плотное покрытие синапса увеличило эффективность захвата глутамата и удаления калия во время синаптической передачи. При этом изменений в экспрессии транспортеров глутамата не было выявлено. Более эффективный захват глутамата астроцитами привел к снижению спиловера (вытекания за пределы синаптической щели) этого нейропередатчика и снижению активации внесинаптических NMDA рецепторов. Эти рецепторы отвечают за синаптическую депрессию. В результате увеличилась эффективность синаптической потенциации, которая является клеточным механизмом обучения и памяти. Таким образом, было показано, что диета со сниженным потреблением калорий обеспечивает основу для улучшения обучения и памяти посредством морфофункционального ремоделирования астроцитов.

  1. Popov A, Denisov P, Bychkov M, Brazhe A, Lyukmanova E, Shenkarev Z, Lazareva N, Verkhratsky A, Semyanov A 2020 Caloric restriction triggers morphofunctional remodeling of astrocytes and enhances synaptic plasticity in the mouse hippocampus. Cell Death Dis 11 (3) 208

Лаборатория внесинаптической передачи (Семьянов А.В.)

Тоническая ГАМКА проводимость селективно ингибирует долговременную пластичность, вызванную тетанической стимуляцией в гиппокампе

Некоторые нейротрансмиттеры, вовлеченные в синаптическую передачу, способны покидать синаптическую щель или высвобождаться астроцитами, и могут активировать внесинаптические рецепторы. Так, например, внесинаптические ГАМКА рецепторы опосредуют тоническую ГАМК проводимость, которая снижает возбудимость нейронов путем шунтирования. Мы показали, что тоническая ГАМК проводимость оказывает минимальное влияние на синаптическую пластичность, зависящую от времени возникновения потенциалов действия, при этом сильно ослабляя пластичность, вызываемую возбуждающими постсинаптическими потенциалами. Полученные результаты проливают свет на то, как изменения тонической проводимости могут выборочно влиять на различные формы обучения и памяти. В частности, эти результаты могут объяснить, как на различные формы памяти влияет увеличение тонической проводимости ГАМКА в физиологических или патологических условиях, а также под влиянием веществ, воздействующих на внесинаптические ГАМКА рецепторы (например, нейростероиды, седативные средства, противоэпилептические препараты и алкоголь).

  1. Dembitskaya Y, Wu YW, Semyanov A 2020 Tonic GABAA conductance favors spike-timing-dependent over theta-burst-induced long-term potentiation in the hippocampus. J Neurosci 40 (22) 4266–4276

Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии (Василевский А.А.)

Токсин скорпиона индуцирует внутриклеточные сигнальные каскады в чувствительных нейронах

В совместном исследовании с лабораторией профессора Тима Хухо (Кёльнский университет) мы обнаружили в составе яда скорпионов вещества с неожиданными свойствами. Хорошо известно, что токсины скорпионов воздействуют на ионные каналы и рецепторы в клеточной мембране нейронов. Теперь же оказывается, что некоторые содержащиеся в яде токсины способны воздействовать на сигнальные пути внутри клеток. Более того, выяснилось, что один из таких токсинов (MeuNaTxα-1) из яда пёстрого скорпиона (Mesobuthus eupeus) запускает сигнальные каскады за счет специфического воздействия на определенную изоформу натриевых каналов. В конечном итоге воздействие токсина на нейрон приводит к его сенситизации — повышенной чувствительности. Идентифицировать мишень токсина удалось благодаря использованию целого ряда других нейротоксинов с различающимися профилями специфичности — как молекулярные исследовательские инструменты.

  1. van Cann M, Kuzmenkov A, Isensee J, Andreev-Andrievskiy A, Peigneur S, Khusainov G, Berkut A, Tytgat J, Vassilevski A, Hucho T 2020 Scorpion toxin MeuNaTxα‐1 sensitizes primary nociceptors by selective modulation of voltage‐gated sodium channels. FEBS J

Отдел молекулярной биологии и биотехнологии растений

Отдел молекулярной биологии и биотехнологии растений (Завриев С.К.)

Роль протеома и пептидома растений в ответе на стрессовые факторы

Стрессовые факторы оказывают значительное влияние на растительный протеом и пептидом. Мы показали, что заражение картофеля вирусом Y в условиях теплового стресса вызывает значительные изменения протеома растений и приводит к снижению представленности ферментов метионинового цикла. Кроме того, деградация белков в стрессовых условиях также приводит к существенному изменению пула эндогенных пептидов. Одним из основных источников таких пептидов является хлоропластный протеом, подвергающийся активному ремоделированию в стрессовых условиях. Функции образующихся пептидов могут быть связаны с регуляцией ответа растений на стрессовые факторы. Растения используют множество пептидных сигналов для регуляции иммунного ответа. Однако, их происхождение и эволюция еще слабо изучены. Мы идентифицировали гены секретируемых пептидов в геномах бриофитов и обнаружили, что паттерны иммунных пептидов отличаются у разных филогенетических групп. Специфичные для покрытосеменных регуляторные иммунные пептиды вызывают ответ на уровне АФК у мха P. patens.

 

Лаборатория молекулярной биоинженерии (Мирошников К.А.)

Молекулярные механизмы действия сократительных «нанопружин»

Хвосты бактериофагов морфотипа Myoviridae, пиоцины R-типа и бактериальные системы секреции типа 6 представляют собой сложные «молекулярные пружины». Эти многобелковые комплексы специфически распознают рецепторы на поверхности бактерии и, сокращаясь, протыкают ее клеточную стенку. С разрешением 3.5 A определена структура пиоцина R2 с реконструкцией конформационных перестроений, сопровождающих сокращение. Связывание хвостовых комплексов с поверхностью клетки часто сопровождается ферментативной модификацией рецептора, что обеспечивает необратимую адсорбцию. Для ряда бактериофагов Pectobacterium методом ЯМР показано, что адсорбция сопровождается деацетилированием боковых цепей О-полисахарида.

  1. Shneider MM, Lukianova AA, Evseev PV, Shpirt AM, Kabilov MR, Tokmakova AD, Miroshnikov KK, Obraztsova EA, Baturina OA, Shashkov AS, Ignatov AN, Knirel YA, Miroshnikov KA 2020 Autographivirinae Bacteriophage Arno 160 Infects Pectobacterium carotovorum via Depolymerization of the Bacterial O-Polysaccharide. Int J Mol Sci 21 (9)
  2. Ge P, Scholl D, Prokhorov NS, Avaylon J, Shneider MM, Browning C, Buth SA, Plattner M, Chakraborty U, Ding K, Leiman PG, Miller JF, Zhou HZ 2020 Action of a minimal contractile bactericidal nanomachine. Nature 580 (7805) 658–662
  3. Lukianova AA, Shneider MM, Evseev PV, Shpirt AM, Bugaeva EN, Kabanova AP, Obraztsova EA, Miroshnikov KK, Senchenkova SN, Shashkov AS, Toschakov SV, Knirel YA, Ignatov AN, Miroshnikov KA 2020 Morphologically Different Pectobacterium brasiliense Bacteriophages PP99 and PP101: Deacetylation of O-Polysaccharide by the Tail Spike Protein of Phage PP99 Accompanies the Infection. Front Microbiol 10 3147

Лаборатория функциональной геномики и протеомики растений (Тальянский М.Э.)

Роль протеома и пептидома растений в ответе на стрессовые факторы

Стрессовые факторы оказывают значительное влияние на растительный протеом и пептидом. Мы показали, что заражение картофеля вирусом Y в условиях теплового стресса вызывает значительные изменения протеома растений и приводит к снижению представленности ферментов метионинового цикла. Кроме того, деградация белков в стрессовых условиях также приводит к существенному изменению пула эндогенных пептидов. Одним из основных источников таких пептидов является хлоропластный протеом, подвергающийся активному ремоделированию в стрессовых условиях. Функции образующихся пептидов, могут быть связаны с регуляцией ответа растений на стрессовые факторы. Растения используют множество пептидных сигналов для регуляции иммунного ответа. Однако, их происхождение и эволюция еще слабо изучены. Мы идентифицировали гены секретируемых пептидов в геномах бриофитов и обнаружили, что паттерны иммунных пептидов отличаются у разных филогенетических групп. Специфичные для покрытосеменных регуляторные иммунные пептиды вызывают ответ на уровне АФК у мха P. patens.

  1. Fesenko I, Spechenkova N, Mamaeva A, Makhotenko AV, Love AJ, Kalinina NO, Taliansky M 2020 Role of the methionine cycle in the temperature‐sensitive responses of potato plants to potato virus Y. Mol Plant Pathol
  2. Mamaeva A, Taliansky M, Filippova A, Love AJ, Golub N, Fesenko I 2020 The role of chloroplast protein remodeling in stress responses and shaping of the plant peptidome. New Phytol 227 (5) 1326–1334

Лаборатория экспрессионных систем и модификации генома растений (Долгов С.В.)

Создание интрагенных растений картофеля, проявляющих устойчивость к вирусу PVY вследствие целевого нокдауна семейства генов факторов инициации трансляции eIF4E

РНК вирусы растений для трансляции собственной РНК в растительных клетках рекрутируют факторы трансляции своих хозяев. Создание дефицита определенных факторов инициации трансляции, является одним из способов защиты растений от вирусной инфекции. Посредством RNAi регуляции экспрессии семейства генов, кодирующих факторы eIF4E, а именно благодаря 6-10 кратному снижению экспрессии гомологов SteIF4E1 и SteIF4E2, удалось существенно понизить восприимчивость растений картофеля к заражению PVY, считающимся самым вредоносным вирусом картофеля. Встраиваемая в геном картофеля hpRNAi кассета состояла только из регуляторных последовательностей (промотор, интрон, терминатор) и участков генома (инвертированные фрагменты SteIF4E1) картофеля, что позволило получить интрагенные растения, не содержащие какие-либо маркерные или селективные последовательности вирусного/бактериального происхождения. Для достижения устойчивости использовали тканеспецифичный промотор StLhca3 картофеля, обеспечивающий интерференционную активность преимущественно в листьях (являются основной мишенью для вируса), благодаря чему удалось избежать негативного эффекта «выключения» eIF4E генов на жизнедеятельность растений и клубнеобразование картофеля.

  1. Miroshnichenko D, Firsov A, Timerbaev V, Kozlov O, Klementyeva A, Shaloiko L, Dolgov S 2020 Evaluation of Plant-Derived Promoters for Constitutive and Tissue-Specific Gene Expression in Potato. Plants (Basel) 9 (11) 1–16
  2. Miroshnichenko N, Timerbaev R, Okuneva A, Klementyeva A, Sidorova N, Pushin S, Dolgov D 2019 Enhancement of resistance to PVY in intragenic marker-free potato plants by RNAi-mediated silencing of eIF4E translation initiation factors. Plant Cell Tissue Organ Cult 140 (3) 691–705

Лаборатория экспрессионных систем и модификации генома растений (Долгов С.В.)

Разработка растительной экспрессионной системы дляполучения рекомбинантного артемизинина с использованием методовсинтетической биологии.

Артемизинин – терпеновый лактон, содержащийся в растении полынь однолетняя (Artemisia annua) и обладающий высокой антималярийной активностью. В настоящее время комбинированные с артемизинином лекарственные средства являются наиболее эффективными препаратами для лечения малярии, использование таких препаратов является стандартом лечения во всем мире. Целью исследования являлось получение растений хризантемы, трансформированных генами пути биосинтеза артемизинина и анализ накопления рекомбинантного артемизинина в полученных растениях.

В результате агробактериальной трансформации были получены трансгенные линии с генами биосинтеза артемизинина. Таким образом, нами впервые в растениях хризантем был реконструирован биосинтетический путь артемизинина. В результате масс-спектрометрического анализа показано его накопление в листовых тканях трансгенных растений. Полученные результаты будут использованы в дальнейших исследованиях по разработке гетерологичных экспрессионных систем для производства артемизинина и других небелковых веществ.

  1. Firsov AP, Mitiushkina TY, Pushin AS, Tzareva AK, Vainstein AM, Dolgov SV 2020 Agrobacteium Transformation of Tobacco with a Genetic Module of Antimalarial Agent Artemisinin Biosynthesis. Biotekhnologiya 36 (3) 34–45
  2. Firsov A, Mitiouchkina T, Shaloiko L, Pushin A, Vainstein A, Dolgov S 2020 Agrobacterium-Mediated Transformation of Chrysanthemum with Artemisinin Biosynthesis Pathway Genes. Plants (Basel) 9 (4)

Лаборатория биотехнологии растений (Шевчук Т.В.)

Получение и анализ колонизированных сельскохозяйственных растений с повышенной устойчивостью к стрессовым факторам

Показан положительный эффект колонизации растений томата (Lucopersicon esculentum Mill.) и табака (Nicotiana tabacum L.), бактериями Pseudomonas fluorescens, Acinetobacter baumannii, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas putida, Methylovorus mays. У колонизированных растений повышалась скорость роста, урожайность и адаптационные способности. Впервые получены трансгенные растения рапса (Brassica napus), экспрессирующие антибактериальный пептид cecP1 и колонизированные ассоциативными микроорганизмами Pseudomonas aureofaciens или Methylovorus mesophilicum. Такой подход позволил повысить скорость роста по сравнению с трансгенными растениями и продемонстрировал повышенные адаптационные способности к неблагоприятным условиям. Созревание урожая семян колонизированного трансгенного рапса происходило быстрее, чем у трансгенных неколонизированных растений. Апробируется новый подход к более эффективному подбору колонизирующих микроорганизмов с учетом предварительной оценки их потенциальных симбиотических способностей, основанной на биоинформационном анализе бактериального генома. Наличие определенных генов в бактериях позволяет заранее предполагать их симбиотический потенциал. Принималось участие в анализе геномов бактерий из семейства Microbacteriaceae, образующих ассоциативные симбиотические сообщества с растениями и почвенных бактерий рода Achromobacter, способных метаболизировать глифосат и схожие фосфорорганические соединения в почве.

Показано сравнение устойчивости трансгенных колонизированных растений рапса по сравнению с контрольными.

  1. Pigoleva SV, Zakharchenko NS, Furs OV, Tarlachkov SV, Funtikova TV, Filonov AE, Aripovskii AV, Dyachenko OV, Buryanov YI, Shevchuk TV 2020 Effects of Associative Microorganisms on Plant Growth and Resistance to Xenobiotics and Phytopathogens. APPL BIOCHEM MICRO+ 56 (4) 473–482

Отдел химической биологии гликанов и липидов

Отдел химической биологии гликанов и липидов (Бовин Н.В.)

Изучен механизм выхода гликолипидов из эукариотической клетки, показано, что основным механизмом является выход в составе микровезикул

Гликосфинголипиды, среди прочих функций, еще играют роль сигнальных молекул; однако механизм обмена ими между собственными клетками, а также опухолевой клетки и клетками иммунной системы остается непонятным. Для его изучения мы используем синтетические гликолипиды, а затем при необходимости повторяем принципиальные эксперименты уже с природными. Изучена кинетика проникновения этих молекул в клетку, их локализация, а также релиз. Нагрузка выходит на плато за 1 час, выход на 50% проходит за сутки. Локализация – в виде патчей 300 нм в интерфейсе между плазматической мембраной и гликокаликсом. Наружу выходят в виде микровезикул среднего размера 140 нм

Отдел химической биологии гликанов и липидов (Бовин Н.В.)

Обнаружена гликан-связывающая способность у ключевого белка (S-белок, осуществляющий рецепцию вируса) коронавируса SARS-CoV-2.

Многие вирусы имеют второй («запасной») вариант рецепции на клетке-мишени, и это - как правило, гликан. Мы проверили способность рекомбинантного тримерного белка S (НПО Вектор) связываться с гликанами из нашей коллекции синтетических олигосахаридов клетки человека. Несколько из них с высокой аффинностью связывались с белком S, это гликаны семейства лактозамина – с общим структурным мотивом Galb1-4GlcNAc, которые являются типичными лигандами семейства белков галектинов. Интересно, что у всех коронавирусов есть неактивный галектиновый фолд в составе белка S. Какой фрагмент белка S на самом деле связывается с гликаном, сейчас выясняется с помощью молекулярно-динамических методов в группе Р.Г.Ефремова.

  1. Ryzhikov AB, Onkhonova GS, Imatdinov IR, Gavrilova EV, Maksyutov RA, Gordeeva EA, Pazynina GV, Ryzhov IM, Shilova NV, Bovin NV 2021 Recombinant SARS-CoV-2 S Protein Binds to Glycans of the Lactosamine Family in vitro. Biochemistry (Mosc)

Отдел химической биологии гликанов и липидов (Бовин Н.В.)

На плаценте идентифицированы резидентные антитела, узнающие собственные гликаны, но не инициирующие активации иммунной системы.

Известно, что беременность сопровождается общим ослаблением иммунитета – во избежание риска атаки плода. Один из предполагаемых механизмов – маскировка алло-антигенов плода иммунологически неактивными иммуноглобулинами матери. Мы проверили эту гипотезу. А именно, в щадящих условиях элюировали резидентные антитела с плаценты и изучили их гликановую специфичность с помощью гликанового эррея (60 гликанов). Элюат содержал несколько специфичностей, среди которых наиболее интересны антитела к антигену группы крови LeA, которые не обнаруживались в периферической крови матери, но находились в плаценте. Интересно, что у больных преэклампсией эти антитела отсутствуют в плаценте, что подтверждает гипотезу об их защитной роли в норме.

Лаборатория химии липидов (Водовозова Е.Л.)

,  

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем (Ефремов Р.Г.)

ФЛА2 инициирует локальный фазовый переход липидного бислоя для осуществления катализа

С помощью комбинации экспериментальных и вычислительных методов получены данные о механизме первого этапа взаимодействия фосфолипазы А2 с липидной мембраной. При контакте фермента с мембраной формируется сеть водородных связей, что приводит к деформации бислоя и образованию вмятины в зоне контакта. Реакция липидного бислоя на деформацию зависит от его фазового состояния. Предположительно, способность бислоя адаптироваться к деформации за счет перераспределения липидов определяет скорость начальных стадий катализа.

  1. Alekseeva AS, Volynsky PE, Krylov NA, Chernikov VP, Vodovozova EL, Boldyrev IA 2021 Phospholipase A2 way to hydrolysis: Dint formation, hydrophobic mismatch, and lipid exclusion. BIOCHIM BIOPHYS ACTA 1863 (1) 183481
  2. Алексеева АС, Болдырев ИА 2020 Фосфолипаза А2. Методы мониторинга активности. BIOL MEMBRANY 37 (5) 323–336

Отдел биомолекулярной химии

Отдел биомолекулярной химии (Ямпольский И.В.)

,  

Лаборатория молекулярной иммунологии (Деев С.М.)

,  

Лаборатория экспрессионных систем и модификации генома растений (Долгов С.В.)

,  

Лаборатория химии метаболических путей (Ямпольский И.В.)

,  

Группа синтетической биологии (Саркисян К.С.)

,  

Группа метаболической инженерии растений (Митюшкина Т.Ю.)

,  

Группа молекулярных меток для оптической наноскопии (Мишин А.С.)

Создание растений с генетически кодируемой биолюминесценцией

В статье, опубликованной в журнале Nature Biotechnology, ученые ИБХ РАН показали возможность создания растений, излучающих собственную видимую люминесценцию. Было обнаружено, что биолюминесценция некоторых грибов метаболически сходна с естественными процессами, характерными для растений. Интегрировав гены биолюминесцентной системы гриба Neonothopanus nambi в геном табака, ученые смогли создать растения, которые светятся намного ярче, чем это было возможно ранее. Созданные трансгенные растения светятся непрерывно на протяжении всего жизненного цикла и могут быть использованы в качестве системы для проведения биоимиджинга. В отличие от других широко используемых биолюминесцентных систем, например, светлячков, для поддержания биолюминесценции грибов не требуются уникальные химические реагенты.

  1. Mitiouchkina T, Mishin AS, Somermeyer LG, Markina NM, Chepurnyh TV, Guglya EB, Karataeva TA, Palkina KA, Shakhova ES, Fakhranurova LI, Chekova SV, Tsarkova AS, Golubev YV, Negrebetsky VV, Dolgushin SA, Shalaev PV, Shlykov D, Melnik OA, Shipunova VO, Deyev SM, Bubyrev AI, Pushin AS, Choob VV, Dolgov SV, Kondrashov FA, Yampolsky IV, Sarkisyan KS 2020 Plants with genetically encoded autoluminescence. Nat Biotechnol 38 (8) 944–946

Отдел биоматериалов и бионанотехнологий

Лаборатория молекулярной биофизики (Олейников В.А.)

,  

Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул (Феофанов А.В.)

Новые эффективные флуорофоры с двух-фотонным возбуждением для визуализации клеток на основе квантовых нанопластинок

Методом двухфотонной флуоресцентной микроскопии мы продемонстрировали, что нанопластинки дают на порядок больший флуоресцентный отклик. Это позволяет использовать их в качестве высокоэффективных флуоресцентных двух-фотонных меток в биомедицине.

Показано, что, несмотря на гораздо больший латеральный размер по сравнению с квантовыми точками, они могут эффективно поглощаться клетками. Благодаря более высокой эффективности возбуждения фотолюминесценции 1P и 2P, новые флуорофоры позволяют осуществлять детектирование и визуализацию при гораздо более низкой концентрации нанопластинок внутри клеток по сравнению с квантовыми точками. Это особенно важно в случае специфической детекции небольших количеств определенных белков в клетках.

  1. Radchanka A, Iodchik A, Terpinskaya T, Balashevich T, Yanchanka T, Palukoshka A, Sizova S, Oleinikov V, Feofanov A, Artemyev M 2020 Emitters with different dimensionality: 2D cadmium chalcogenide nanoplatelets and 0D quantum dots in non-specific cell labeling and two-photon imaging. Nanotechnology 31 (43) 435102

Лаборатория полимеров для биологии (Генералова А.Н.)

Универсальная платформа для биоимиджинга на основе апконвертирующих нанокристаллов, модифицированных коломиновой кислотой

Нанокристаллы с антистоксовой флуоресценцией (НАФ) являются перспективной платформой для создания биореагентов при in vivo визуализации патологических тканей под действием ближнего инфракрасного излучения, способного проникать глубоко в биоткани, сохраняя высокое соотношение сигнал/шум. Успешное применение НАФ связано с биофункционализацией их поверхности, обеспечивающей нетоксичность и биосовместимость наряду с длительным временем циркуляции наночастиц в кровотоке и их накоплением в целевой ткани. В данной работе представлен подход к биофункционализации НАФ с использованием эндогенной коломиновой кислоты и создания реагентов, которые характеризовались низким уровнем неспецифической адсорбции белков и захвата макрофагами. Данный подход позволил увеличить время циркуляции в кровотоке малых животных до 3-х часов, регистрировать интенсивный фотолюминесцентный сигнал в воспалительной ткани, а также визуализировать микро- и макро-кровеносные сосуды. Работа проводилась совместно с ФНИЦ «Кристаллография и фотоника», РОНЦ им. Н.Н. Блохина и Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

  1. Demina PA, Sholina NV, Akasov RA, Khochenkov DA, Arkharova NA, Nechaev AV, Khaydukov EV, Generalova AN 2020 A versatile platform for bioimaging based on colominic acid-decorated upconversion nanoparticles. Biomater Sci 8 (16) 4570–4580

Лаборатория биомедицинских материалов (Марквичева Е.А.)

Биодеградируемые полиэлектролитные наноконтейнеры на основе природных полисахаридов

Разработаны биодеградируемые полиэлектролитные наноконтейнеры на основе природных полисахаридов, загруженные липофильным противораковым препаратом тимохиноном. Эффективность накопления в клетках и цитотоксичность наноконтейнеров изучили на культурах раковых клеток в 2D (монослойная культура) в 3D (опухолевые сфероиды) in vitro моделях. Показана возможность их использования для пролонгированной доставки различных противораковых липофильных лекарств.

Совместно с ФНИЦ “Кристаллография и фотоника РАН”

  1. Borodina T, Gileva A, Akasov R, Trushina D, Burov S, Klyachko N, González-Alfaro Y, Bukreeva T, Markvicheva E 2020 Fabrication and evaluation of nanocontainers for lipophilic anticancer drug delivery in 3D in vitro model. J Biomed Mater Res B Appl Biomater

Лаборатория иммунохимии (Бровко Ф.А.)

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОДНОВРЕМЕННОГО АНАЛИЗА ТРЕХ СТАФИЛОКОККОВЫХ ЭНТЕРОТОКСИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ С ПРИМЕНЕНИЕМ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ МИКРОСФЕР И ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИИ

Одной из причин болезней, ассоциированных с пищевыми отравлениями, является заражение токсигенными стафилококками. Высокая стабильность энтеротоксинов стафилококков (SE) обуславливает необходимость усовершенствования методов контроля качества пищевых продуктов. Разработан высокочувствительный метод для одновременного количественного анализа трех стафилококковых энтеротоксинов (SEA, SEB и SEH) методом проточной цитофлуориметрии. Для обнаружения SE использовали функциональные микросферы, связанные с моноклональными антителами захвата, биотинилированные детектирующие моноклональные антитела и конъюгированный с фикоэритрином стрептавидин. Линейные диапазоны обнаружения SEA, SEB и SEH составляли 0,02–20 нг/мл, 0,2–30 нг/мл и 0,2–20 нг/мл соответственно. Каждый из токсинов детектировался специфично без перекрестных реакций, компоненты среды детекции не влияли на специфичность и чувствительность определения.

  1. Shepelyakovskaya A, Rudenko N, Karatovskaya A, Shchannikova M, Shulcheva I, Fursova K, Zamyatina A, Boziev K, Oleinikov V, Brovko F 2020 Development of a Bead-Based Multiplex Assay for the Simultaneous Quantification of Three Staphylococcal Enterotoxins in Food by Flow Cytometry. FOOD ANAL METHOD 13 (5) 1202–1210

Группа молекулярной экологии (Трубецкая О.Е.)

Экспресс-оценка антропогенного загрязнения природных вод и структурный анализ растворенного органического вещества на базе высокоэффективной эксклюзивной хроматографии с мультиволновой детекцией поглощения/флуоресценции.

Комбинация высокоэффективной эксклюзивной жидкостной хроматографии (SEC-HPLC) в сочетании с мультиволновыми детекторами поглощения/флуоресценции и метода трехмерной флуоресценции (3D-EEM) была впервые применена для структурного анализа растворенного органического вещества (РОВ) нескольких природных водоемов и экспресс-оценки их антропогенного загрязнения. Для этой цели были использованы препараты РОВ, выделенные из двух чистых водных источников – заповедной реки Сувани (Джорджия, США) и карельского заповедного Водопроводного озера, расположенного около ББС МГУ, а также из северо-западной части Онежского озера (Кондопогожский залив), экосистема которого подвергалась постоянному антропогенному воздействию Кондопогожского ЦБК. Независимо от генезиса и степени антропогенного влияния во всех исследованных образцах РОВ было впервые обнаружено несколько идентичных гуминоподобных флуорофоров, причем уменьшение максимумов эмиссии флуорофоров сопровождалось уменьшением их молекулярного размера. В образце РОВ из Онежского озера кроме гуминоподобных флуорофоров была зафиксирована протеиноподобная флуоресценция, детектированная по всему хроматографическому профилю. Наличие белковой компоненты было подтверждено анализом спектров флуоресценции с характерным максимумом эмиссии в районе 350 нм и соответствующими спектрами поглощения с максимумами в районе 270-280 нм. Полученные данные помогают лучше понять молекулярную структуру и природу флуоресцентных свойств РОВ природной воды. Разработанный подход также является эффективным для изучения микробной активности в природных водах в результате антропогенного загрязнения.

  1. Trubetskaya OE, Richard C, Patsaeva SV, Trubetskoj OA 2020 Evaluation of aliphatic/aromatic compounds and fluorophores in dissolved organic matter of contrasting natural waters by SEC-HPLC with multi-wavelength absorbance and fluorescence detections. Spectrochim Acta A 238 118450

Отдел геномики адаптивного иммунитета

Лаборатория методов иммуносеквенирования (Чудаков Д.М.)

,  

Отдел геномики адаптивного иммунитета (Чудаков Д.М.)

,  

Лаборатория сравнительной и функциональной геномики (Лебедев Ю.Б.)

,  

Группа структурной организации Т-клеточного иммунитета (Британова О.В.)

,  

Группа алгоритмов иммуносеквенирования (Шугай М.А.)

Исследование роли клональных субпопуляций Т-лимфоцитов в норме и патологии

- описаны две функционально различные субпопуляции CD8+ стволовых клеток памяти.

- разработан новый подход для оценки клональной гетерогенности опухоль-инфильтрирующих Т-лимфоцитов.

- показано, что стабильно клональный Т клеточный ответ ассоциирован с ответом на анти-PD1 иммунотерапию.

- охарактеризован Т-клеточный репертуар никель-специфичных CD4+ Т-лимфоцитов.

- исследован репертуар гамма-дельта Т лимфоцитов вовлеченных в противоопухолевый ответ.

- проведен сравнительный анализ репертуаров фолликулярных хелперных Т-лимфоцитов.

- проведено глубокое сравнительное исследование методов анализа репертуаров Т-клеточных рецепторов.

  1. Galletti G, De Simone G, Mazza EMC, Puccio S, Mezzanotte C, Bi TM, Davydov AN, Metsger M, Scamardella E, Alvisi G, De Paoli F, Zanon V, Scarpa A, Camisa B, Colombo FS, Anselmo A, Peano C, Polletti S, Mavilio D, Gattinoni L, Boi SK, Youngblood BA, Jones RE, Baird DM, Gostick E, Llewellyn-Lacey S, Ladell K, Price DA, Chudakov DM, Newell EW, Casucci M, Lugli E 2020 Two subsets of stem-like CD8+ memory T cell progenitors with distinct fate commitments in humans. Nat Immunol
  2. Yuzhakova DV, Volchkova LN, Pogorelyy MV, Serebrovskaya EO, Shagina IA, Bryushkova EA, Nakonechnaya TO, Izosimova AV, Zavyalova DS, Karabut MM, Izraelson M, Samoylenko IV, Zagainov VE, Chudakov DM, Zagaynova EV, Sharonov GV 2020 Measuring Intratumoral Heterogeneity of Immune Repertoires. Front Oncol 10 512
  3. Zhigalova EA, Izosimova AI, Yuzhakova DV, Volchkova LN, Shagina IA, Turchaninova MA, Serebrovskaya EO, Zagaynova EV, Chudakov DM, Sharonov GV 2020 RNA-Seq-Based TCR Profiling Reveals Persistently Increased Intratumoral Clonality in Responders to Anti-PD-1 Therapy. Front Oncol 10 385
  4. Aparicio-Soto M, Riedel F, Leddermann M, Bacher P, Scheffold A, Kuhl H, Timmermann B, Chudakov DM, Molin S, Worm M, Heine G, Thierse HJ, Luch A, Siewert K 2020 TCRs with segment TRAV9-2 or a CDR3 histidine are overrepresented among nickel-specific CD4+ T cells. Allergy 75 (10) 2574–2586
  5. Janssen A, Villacorta Hidalgo J, Beringer DX, van Dooremalen S, Fernando F, van Diest E, Terrizi AR, Bronsert P, Kock S, Schmitt-Gräff A, Werner M, Heise K, Follo M, Straetemans T, Sebestyen Z, Chudakov DM, Kasatskaya SA, Frenkel FE, Ravens S, Spierings E, Prinz I, Küppers R, Malkovsky M, Fisch P, Kuball J 2020 γδ T-cell Receptors Derived from Breast Cancer-Infiltrating T Lymphocytes Mediate Antitumor Reactivity. Cancer Immunol Res 8 (4) 530–543
  6. Brenna E, Davydov AN, Ladell K, McLaren JE, Bonaiuti P, Metsger M, Ramsden JD, Gilbert SC, Lambe T, Price DA, Campion SL, Chudakov DM, Borrow P, McMichael AJ 2020 CD4 T Follicular Helper Cells in Human Tonsils and Blood Are Clonally Convergent but Divergent from Non-Tfh CD4 Cells. Cell Rep 30 (1) 137–152.e5
  7. Barennes P, Quiniou V, Shugay M, Egorov ES, Davydov AN, Chudakov DM, Uddin I, Ismail M, Oakes T, Chain B, Eugster A, Kashofer K, Rainer PP, Darko S, Ransier A, Douek DC, Klatzmann D, Mariotti-Ferrandiz E 2020 Benchmarking of T cell receptor repertoire profiling methods reveals large systematic biases. Nat Biotechnol
  8. De Simone G, Mazza EMC, Cassotta A, Davydov AN, Kuka M, Zanon V, De Paoli F, Scamardella E, Metsger M, Roberto A, Pilipow K, Colombo FS, Tenedini E, Tagliafico E, Gattinoni L, Mavilio D, Peano C, Price DA, Singh SP, Farber JM, Serra V, Cucca F, Ferrari F, Orrù V, Fiorillo E, Iannacone M, Chudakov DM, Sallusto F, Lugli E 2019 CXCR3 Identifies Human Naive CD8 T Cells with Enhanced Effector Differentiation Potential. J Immunol 203 (12) 3179–3189

Лаборатория сравнительной и функциональной геномики (Лебедев Ю.Б.)

,  

Лаборатория методов иммуносеквенирования (Чудаков Д.М.)

Динамика и клональная характеристика Т-клеток памяти при противовирусной вакцинации

По результатам высокопроизводительного секвенирования одновременно α и β цепей Т-клеточных рецепторов (αβTCR), а также РНК-секвенирования единичных Т-клеток определены закономерности формирования Т-клеточного иммунного ответа на вакцинацию против вируса желтой лихорадки (YFV). У каждого из обследованных доноров идентифицированы обширные группы YFV-ассоциированных Т-клонов, претерпевающих 100-кратную клональную экспансию, приобретающих свойства клеток памяти и узнающих иммунодоминантный эпитоп YFV. Для последних с использованием оригинальной методики реконструированы структуры полных αβTCR. На разных стадиях иммунного ответа для CD4 и CD8 Т-клеток памяти показано преобладание клонов CM, EM, EMRA и др. иммунофенотипов со свойствами цитотоксических или долгоживущих Т-лимфоцитов.

  1. Minervina AA, Pogorelyy MV, Komech EA, Karnaukhov VK, Bacher P, Rosati E, Franke A, Chudakov D, Mamedov IZ, Lebedev YB, Mora T, Walczak AM 2020 Primary and secondary anti-viral response captured by the dynamics and phenotype of individual T cell clones. Elife 9

Группа структурной организации Т-клеточного иммунитета (Британова О.В.)

Влияние аллелей MHC-II на формирование репертуара Т клеточных рецепторов наивных CD4+ и наивных регуляторных Т-лимфоцитов.

В ходе исследования формирования наивных CD4+ T-лимфоцитов в разном контексте MHC-II в мышах, мы обнаружили, что дефективная селекция CD4+ Т-клеток в мышах с аллельным вариантом MHC-II j сопровождается отбором менее разнообразного и более публичного репертуара Т-клеточных рецепторов. В то же время, селекция на аллельном варианте j поддерживает образование CD4+ Т-клеток в среднем с бóльшим числом гидрофобных и ароматических аминокислотных остатков в CDR3 антиген-связывающем участке Т-клеточного рецептора, что по ранее опубликованным данным свидетельствует о высокой аффинности и кросс-реактивности таких Т-клеточных рецепторов. Регуляторные CD4+ Т-клетки, несущие Т-клеточные рецепторы с еще более гидрофобными и аффинными CDR3 участками, в нашей мышиной модели эффективно вступают в гомеостатическую пролиферацию на периферии, восстанавливая численность своей популяции, несмотря на дефективную селекцию на MHC-II j в тимусе. Интересно, что это различие в среднем числе гидрофобных и ароматических остатков в CDR3 между регуляторными и конвенциональными (CD4+ Foxp3-) T-лимфоцитами выражено сильнее при селекции на аллельном варианте MHC-II j скорее, чем b.

Мы провели функциональные in vitro тесты супрессорной активности регуляторных Т-клеток, прошедших селекцию на аллелях b или j, и обнаружили более эффективное подавление пролиферации аутологичных конвенциональных Т-клеток регуляторными клетками, прошедшими селекцию на аллели j.

  1. Logunova NN, Kriukova VV, Shelyakin PV, Egorov ES, Pereverzeva A, Bozhanova NG, Shugay M, Shcherbinin DS, Pogorelyy MV, Merzlyak EM, Zubov VN, Meiler J, Chudakov DM, Apt AS, Britanova OV 2020 MHC-II alleles shape the CDR3 repertoires of conventional and regulatory naïve CD4 T cells. Proc Natl Acad Sci U S A 117 (24) 13659–13669

Группа алгоритмов иммуносеквенирования (Шугай М.А.)

Эпитопы SARS-CoV-2 распознаются публичным и разнообразным репертуаром рецепторов Т-клеток человека.

Понимание признаков иммунного ответа на SARS-CoV-2 имеет решающее значение для борьбы с пандемией COVID-19. Мы оценили антитела и реактивность Т-клеток у выздоравливающих пациентов с COVID-19 и здоровых доноров, взятых как до, так и во время пандемии. Здоровые доноры, обследованные во время пандемии, показали повышенное количество Т-клеток, специфичных для SARS-CoV-2, но не имели гуморального ответа. Их вероятное воздействие вируса привело либо к бессимптомной инфекции без секреции антител, либо к активации ранее существовавшего иммунитета. У выздоравливающих пациентов мы наблюдали публичный и разнообразный Т-клеточный ответ на эпитопы SARS-CoV-2, выявляя мотивы Т-клеточного рецептора (TCR) с особенностями, кодируемыми зародышевой линией. Массовые ответы CD4 + и CD8 + Т-клеток на спайковый гликопротеин были опосредованы группами гомологичных TCR, некоторые из которых были общими для нескольких доноров. В целом, наши результаты демонстрируют, что Т-клеточный ответ на SARS-CoV-2, включая идентифицированный набор TCR, может служить полезным биомаркером для изучения противовирусного иммунитета.

Отдел «Учебно-научный центр»

Отдел «Учебно-научный центр» (Овчинникова Т.В.)

,  

Лаборатория структурной биологии ионных каналов (Шенкарёв З.О.)

Новые β-шпилечные BRICHOS-ассоциированные антимикробные пептиды из морской полихеты Capitella teleta

Стремительный рост антибиотикорезистентности в сочетании с трудностями поиска новых антибиотиков требуют принципиально иных подходов к созданию противоинфекционных лекарственных средств. В рамках работы по изучению BRICHOS-ассоциированных антимикробных пептидов (АМП) животных, проводимой в Учебно-научном центре ИБХ РАН, были получены рекомбинантные аналоги новых защитных катионных пептидов из морской полихеты Capitella teleta, а также изучены их структурные и биологические свойства, включая молекулярный механизм действия против бактерий. Капителлацины – новые BRICHOS-ассоциированные АМП из полихеты C. teleta, обладающие структурным сходством с тахиплезинами – защитными пептидами мечехвостов. Показан широкий спектр активности в отношении мультирезистентных бактерий и уникальный механизм действия капителлацинов. Сравнительно невысокая амфифильность обуславливает низкую цитотоксичность капителлацинов в отношении нормальных клеток млекопитающих. С помощью ЯМР спектроскопии высокого разрешения определена пространственная структура и изучена мембранная активность рекомбинантного аналога антимикробного пептида капителлацина (capitellacin) из морского червя Capitella teleta. Капителлацин в водном растворе представлен в виде мономера и образует правозакрученную бета-шпильку. Его структура не обладает амфипатичностью, типичной для гомологичных ему пептидов, однако он сохраняет свою способность пронизывать мембрану. Вероятно, из-за отсутствия явно выраженной амфипатичности капителлацин не образует димеров в модельных мембранах и сохраняет свою конформацию в мембранном окружении. Исследование пространственной структуры и мембранной активности антимикробных пептидов открывает путь к разработке новых антибиотиков на их основе.

По результатам работы получен патент РФ (RU № 2721273) и опубликована статья в журнале Marine Drugs (IF 4.073): P.V. Panteleev, A.V. Tsarev, V.N. Safronova, O.V. Reznikova, I.A. Bolosov , S.V. Sychev, Z.O. Shenkarev, T.V.Ovchinnikova. Structure Elucidation and Functional Studies of a Novel β-hairpin Antimicrobial Peptide from the Marine Polychaeta Capitella teleta. Marine Drugs, 2020, 18, 620; doi:10.3390/md18120620.

Отдел «Учебно-научный центр» (Овчинникова Т.В.)

В структуре липид-транспортирующего белка чечевицы Lc-LTP2 выявлены ключевые аминокислотные остатки, ответственные за образование комплексов с липидами. Найден новый сигнальный лиганд Lc-LTP2 – липид PI(4,5)P2.

Липид-транспортирующие белки (LTP) участвуют в ряде процессов в растениях благодаря своей способности связывать и переносить широкий спектр гидрофобных лигандов. Пространственная структура LTP характеризуется наличием внутренней полости, способной вмещать гидрофобные лиганды. В УНЦ впервые показано, что Lc-LTP2 чечевицы, а также LTP из других растений, связывают фосфатидилинозитол (4,5)-бисфосфат (PI(4,5)P2) и, возможно, участвуют в передаче сигнала. Впервые показано, что два консервативных для растительных LTP аминокислотных остатка, Arg45 и Tyr80, играют важную роль как в инициирующих взаимодействиях с различными лигандами, так и в стабилизации белок-лигандных комплексов. Также показано, что Tyr80 играет ключевую роль во взаимодействии Lc-LTP2 с мембраной.

  1. Melnikova D, Bogdanov I, Ovchinnikova T, Finkina E 2020 Interaction between the Lentil Lipid Transfer Protein Lc-LTP2 and Its Novel Signal Ligand PI(4,5)P2. Membranes (Basel) 10 (11) 1–11
  2. Melnikova DN, Bogdanov IV, Ignatova AA, Ovchinnikova TV, Finkina EI 2020 New insights into ligand binding by plant lipid transfer proteins: A case study of the lentil Lc-LTP2. Biochem Biophys Res Commun 528 (1) 39–45

Отдел функционирования живых систем

Лаборатория молекулярной онкологии (Донцова О.А.)

Регуляторные Т-клетки у пациентов с ранним ревматоидным артритом

Сотрудник Лаборатории молекулярной онкологии Рубцов Ю.П. совместно со специалистами из Института ревматологии им. Насоновой опубликовал в журнале Biochimie результаты исследования размеров популяции и фенотипа регуляторных Т-клеток пациентов с ревматоидным артритом. Это клиническое исследование показало, что:

  • Ранние пациенты с не леченным ревматоидным артритом имеют cущественный дефект в Трег крови;
  • Снижение количества Treg у пациентов с РА связано со снижением экспрессии ISOS, CD40L и PD-L1 на поверхности клеток;
  • Лечение метотрексатом (МТ) восстанавливает количество и экспрессию маркеров активации Treg;
  • Поверхностная экспрессия CTLA4 может использоваться для оценки ответа на лечение МТ.
  1. Avdeeva AS, Rubtsov YP, Dyikanov DT, Popkova TV, E L N 2020 Regulatory T cells in patients with early untreated rheumatoid arthritis: Phenotypic changes in the course of methotrexate treatment. Biochimie 174 9–17

Лаборатория молекулярной онкологии (Донцова О.А.)

За счет чего гипертермия усиливает эффекты химио- и радиотерапии

Виктория Шендер и Георгий Арапиди, сотрудники Лаборатории молекулярной онкологии, совместно с коллегами с Кафедры молекулярной биологии Биофака МГУ участвовали в исследовании, опубликованном в журнале Cells в 2020 году (DOI: 10.3390/cells9061423). В работе расшифрованы молекулярные механизмы того, как гипертермия, применявшаяся для усиления эффекта химио- и радиотерапии может влиять на чувствительность раковых клеток к этим традиционным видам лечения. Оказалось, что нагрев приводит к «залипанию» факторов транскрипции и белков, участвующих в организации структуры хроматина, регуляции транскрипции и репликации, что делает репарацию ДНК менее эффективной, приводя, тем самым, к гибели трансформированных клеток.

  1. Luzhin AV, Avanesyan B, Velichko AK, Shender VO, Ovsyannikova N, Arapidi GP, Shnaider PV, Petrova NV, Kireev II, Razin SV, Kantidze OL 2020 Chromatin Trapping of Factors Involved in DNA Replication and Repair Underlies Heat-Induced Radio- and Chemosensitization. Cells 9 (6)

Лаборатория молекулярного дизайна и синтеза (Коршун В.А.)

,  

Группа молекулярных меток для оптической наноскопии (Мишин А.С.)

Эксимер-FRET каскад в бинарных ДНК-зондах

Эффективность гибридизационного анализа с помощью флуоресцентных ДНК-зондов зачастую ограничивается низким соотношением сигнал/фон, которое может быть частично преодолено сложными методами усиления сигнала. Глубокое понимание механизмов тушения флуоресценции и передачи энергии в сложных ДНК-зондах, а также выбор оптимальных пар донор/акцептор наряду с рациональным дизайном могут значительно повысить эффективность работы ДНК-зондов. Мы предлагаем новые бинарные FRET-ДНК-зонды с эксимеробразующей пиреновой парой в качестве донора и красителем сульфо-Cy3 в качестве акцептора. Зонды продемонстрировали 75-кратное улучшение флуоресценции сульфо-Cy 3 при гибридизации с мишенью. Стоксов сдвиг 220 нм минимизирует перекрестные помехи. Однофотонный отсчёт времени позволил выявить два возбужденных состояния пиренового эксимера, из которых лишь одно непосредственно участвует в резонансном переносе энергии на сульфо-Cy3. Оптимизированные ДНК-зонды продемонстрировали высокую чувствительность с отличным соотношением сигнал/фон и были применены для визуализации 18S рРНК методом флуоресцентной гибридизации in situ в клетках HEK293T.

  1. Aparin IO, Sergeeva OV, Mishin AS, Khaydukov EV, Korshun VA, Zatsepin TS 2020 Excimer-FRET Cascade in Dual DNA Probes: Open Access to Large Stokes Shift, Enhanced Acceptor Light up, and Robust RNA Sensing. Anal Chem 92 (10) 7028–7036

Лаборатория молекулярного дизайна и синтеза (Коршун В.А.)

Селективная самосборка компактных дискретных ДНК-наноструктур

Для получения малых дискретных наноструктур ДНК, содержащих ковалентные сочленения, требуются надежные методы синтеза и сборки разветвленных олигодезоксинуклеотидных конъюгатов. Представлен подход к самосборке труднодостижимых простых дискретных наноструктур ДНК – "наноэтиленов", димеров, образованных двухниточными олигонуклеотидами с помощью V-образных блоков. Масштабирован синтез V-образных конъюгатов олигонуклеотидов с использованием диазида на основе пентаэритрита и алкин-модифицированных олигонуклеотидов с использованием медь-(I)-катализируемого азид-алкин-циклоприсоединения и оптимизированы условия образования "наноэтилена". Разработаны "наноэтиленовые" "наномономеры", содержащие боковые адаптеры. Такие блоки продемонстрировали плавное спонтанное преобразование в минимальный циклический продукт – ДНК-четырехугольник "нанометилциклобутан". Формирование наноструктур ДНК подтверждено с использованием нативного электрофореза в полиакриламидном геле и атомно-силовой микроскопии, а также дополнительно изучено методом молекулярного моделирования. Предложенный легкий подход к дискретным наноструктурам ДНК с использованием точной адаптерно-направленной самосборки расширяет инструментарий в области ДНК-оригами

  1. Brylev VA, Ustinov AV, Tsvetkov VB, Barinov NA, Aparin IO, Sapozhnikova KA, Berlina YY, Kokin EA, Klinov DV, Zatsepin TS, Korshun VA 2020 Toehold-Mediated Selective Assembly of Compact Discrete DNA Nanostructures. Langmuir 36 (49) 15119–15127

Лаборатория микрофлюидных технологий для биомедицины (Тоневицкий А.Г.)

Интегративный анализ данных секвенирования микроРНК и мРНК позволяет выявить потенциальные регуляторные механизмы ACE2 и TMPRSS2.

Разработка новых подходов к регулированию экспрессии ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2) и трансмембранной сериновой протеазы 2 (TMPRSS2) становится все более важной в контексте продолжающейся пандемии COVID-19, поскольку эти ферменты играют решающую роль в клеточной инфекции. Был проведен поиск предполагаемых сетей регуляции экспрессии ACE2 и TMPRSS2 с участием различных изоформ микроРНК (isomiR) в разных органах человека, используя общедоступные данные парного секвенирования микроРНК/мРНК из проекта The Cancer Genome Atlas (TCGA). В результате были идентифицированы несколько семейств микроРНК, нацеленных на гены ACE2 и TMPRSS2 во многих тканях. В частности, мы обнаружили, что лизин-специфическая деметилаза 5B (JARID1B), кодируемая геном KDM5B, может косвенно влиять на экспрессию ACE2/TMPRSS2 путем репрессии транскрипции семейств микроРНК hsa-let-7e/hsa-mir-125a и hsa-mir-141/hsa-miR-200, которые нацелены на эти гены.

 

Рисунок: Схема сети взаимодействия, состоящей из JARID1B, семейств микоРНК let-7e/miR-125a и miR-141/miR-200 и ферментов ACE2/TMPRSS2.

  1. Nersisyan S, Shkurnikov M, Turchinovich A, Knyazev E, Tonevitsky A 2020 Integrative analysis of miRNA and mRNA sequencing data reveals potential regulatory mechanisms of ACE2 and TMPRSS2. PLoS One 15 (7) e0235987

Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии (Баранов П.В.)

,  

Лаборатория биокатализа (Габибов А.Г.)

,  

Лаборатория белков гормональной регуляции (Белогуров А.А.)

,  

Лаборатория химии протеолитических ферментов (Смирнов И.В.)

Амплификация ДНК в каплях позволяет глубже раскрыть полную генетическую информацию

Исследователи из Лаборатории биокатализа, Лаборатории химии протеолитических ферментов, Лаборатории биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии и Лаборатории белков гормональной регуляции ИБХ РАН вместе с коллегами из других российских и зарубежных институтов показали, что амплификация отдельных молекул ДНК, инкапсулированных в огромном количестве капель эмульсии (ePCR), позволяет решить эту проблему. Различные режимы ePCR были экспериментально проанализированы, чтобы определить наиболее совершенные методы амплификации библиотек ДНК. На основе полученных экспериментальных данных была разработана математическая модель, являющаяся основой для рационализации амплификации библиотек с использованием ePCR. Детальное описание ампликонов библиотек ДНК было получено в результате высокопроизводительного секвенирования, подчеркивающего основные преимущества ePCR по сравнению с обычной PCR. ePCR снижает частоту возникновения грубых ошибок в процессе ДНК амплификации и обеспечивает более равномерное распределение амплифицированных последовательностей. Таким образом, благодаря ePCR достигается квазимономолекулярная амплификация, представляющая собой фундаментальное требование при амплификации сложных матриц. Исследователи показали, что ePCR препятствует дегенерации разнообразия и обеспечивает сохранение качества библиотек ДНК.

  1. Terekhov SS, Eliseev IE, Ovchinnikova LA, Kabilov MR, Prjibelski AD, Tupikin AE, Smirnov IV, Belogurov AA, Severinov KV, Lomakin YA, Altman S, Gabibov AG 2020 Liquid drop of DNA libraries reveals total genome information. Proc Natl Acad Sci U S A 117 (44) 27300–27306

Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии (Баранов П.В.)

Открыт новый белок, закодированный в гене митохондриальной ДНК полимеразы POLG

Mitochondrial DNA polymeraseis essential for mitochondrial DNA replication. It consists of two subunits. POLG gene, which codes for catalytic subunit of polymerase, is notorious for more than 200 mutations linked to devastating inherited diseases. It is proposed that POLG mutations lead to progressive accumulation of mitochondrial DNA mutations and, subsequently, to organism disfunction and death. Andreev and colleagues discovered an efficient CUG start-codon in 5’-leader of POLG mRNA which initiates translation of a long alternative reading frame overlapping with POLG ORF. The new open reading frame is rather long (260 triplets in humans) and is conserved in placental mammals. The new protein was named POLGARF (POLG Alternative Reading Frame). POLGARF accumulates in nucleoli, but upon certain mitogenic stimuli is cleaved and secreted outside of cells. It has been proposed that POLGARF evolved approximately 100-200 mln years ago by MIR transposon insertion into POLG gene, which allows alternative reading frame translation and evolution of POLGARF protein coding function.

  1. Loughran G, Zhdanov AV, Mikhaylova MS, Rozov FN, Datskevich PN, Kovalchuk SI, Serebryakova MV, Kiniry SJ, Michel AM, OConnor PBF, Papkovsky DB, Atkins JF, Baranov PV, Shatsky IN, Andreev DE 2020 Unusually efficient CUG initiation of an overlapping reading frame in POLG mRNA yields novel protein POLGARF. Proc Natl Acad Sci U S A 117 (40) 24936–24946

Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии (Баранов П.В.)

Контекст стартового кодона взаимосвязан с наличием альтернативных стартов трансляции в основной рамке считывания

Сотрудникам ИБХ РАН вместе с зарубежными коллегами удалось обнаружить ранее неизвестную эволюционную зависимость между эффективностью стартовых кодонов и встречаемостью AUG кодонов в 5'-концевой части белок-кодирующих последовательностей. В том случае, когда старт кодоны мало эффективны, вероятность встречаемости следующего АUG кодона выше в той же рамке считывания. В то время как для высоко-эффективных кодонов встречаемость следующего АUG кодона выше в альтернативных рамках. Им также удалось показать что слабая инициация на первом старт кодоне связана с синтезом укороченных протеоформ обусловленных инициацией на втором старте.

  1. Benitez-Cantos MS, Yordanova MM, OConnor PBF, Zhdanov AV, Kovalchuk SI, Papkovsky DB, Andreev DE, Baranov PV 2020 Translation initiation downstream from annotated start codons in human mRNAs coevolves with the Kozak context. Genome Res

Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии (Баранов П.В.)

Оцифровывание работы рибосом в живых клетках

Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии ИБХ РАН в сотрудничестве с коллегами из Ирландии опубликовала обзор в журнале WIRES RNA, в котором собрана информация о вычислительных методах, программном обеспечении и базах данных рибосомного профилирования, разработанных в течение последних десяти лет.

  1. Kiniry SJ, Michel AM, Baranov PV 2019 Computational methods for ribosome profiling data analysis. Wiley Interdiscip Rev RNA 11 (3) e1577

Группа молекулярных инструментов для исследования живых систем (Аралов А.В.)

,  

Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий (Кашеверов И.Е.)

Феноксазиновый остов для дизайна агентов взаимодействующих с G-квадруплексами

G-квадруплексы (G4) представляют собой один класс неканонических вторичных структур нуклеиновых кислот, которые в настоящее время рассматриваются как многообещающие и привлекательные мишени для противораковой, противовирусной и антибактериальной терапии. Мы исследовали новый феноксазиновый остов на основе i-Clamp для создания стабилизирующих G4 лигандов. Длина протонированных аминоалкильных линкеров («рукавов») лиганда на основе феноксазина была оптимизирована in silico. Были синтезированы два двухлинкерных лиганда, различающихся взаимной ориентацией линкеров, и один однолинкерный лиганд. Двухлинкерные лиганды значительно увеличивали термическую стабильность G-квадруплексных структур (увеличивали температуру плавления до 20 ° C) и проявляли селективность по отношению к G4 по сравнению с дуплексной ДНК. Лиганды выглядят многообещающими для биологических исследований, и феноксазиновый остов может стать отправной точкой для разработки новых G4-взаимодействующих соединений.

  1. Tsvetkov VB, Varizhuk AM, Lizunova SA, Nikolenko TA, Ivanov IA, Severov VV, Belyaev ES, Shitikov EA, Pozmogova GE, Aralov AV 2020 Phenoxazine-based scaffold for designing G4-interacting agents. Org Biomol Chem 18 (31) 6147–6154

Группа молекулярных инструментов для исследования живых систем (Аралов А.В.)

,  

Группа химии гетероциклических соединений (Баранов М.С.)

Короткий дуплексный модуль, соединенный с G-квадруплексами, увеличивает флуоресценцию синтетических аналогов хромофора GFP

Аптасенсоры стали популярными инструментами в биоаналитической химии и молекулярной биологии. Для повышения специфичности перспективные сигнальные элементы в аптасенсорах можно разделить на G-квадруплексную (G4) часть и свободный флуоресцентный краситель, который разгорается при связывании с G4 частью. Однако существующие системы ограничены относительно низким усилением флуоресценции при связывании красителя. Мы присоединили дуплексные модули к G4 структурам, что предположительно вызывает образование связывающей краситель полости между двумя модулями. Скрининг множества синтетических аналогов хромофора GFP и вариация дуплексного модуля позволили отобрать красители, которые разгораются после образования комплекса с двухмодульными структурами и их РНК-аналогами до 20 раз по сравнению с G4 без дуплексного модуля. Мы продемонстрировали усиление флуоресценции красителя после связывания с модифицированными структурами TBA, LTR-III и Tel23a G4 и предполагаем, что такая архитектура коротких сигнальных элементов дуплекс-G4 будет способствовать разработке улучшенных аптасенсоров.

  1. Zaitseva SO, Baleeva NS, Zatsepin TS, Myasnyanko IN, Turaev AV, Pozmogova GE, Khrulev AA, Varizhuk AM, Baranov MS, Aralov AV 2020 Short Duplex Module Coupled to G-Quadruplexes Increases Fluorescence of Synthetic GFP Chromophore Analogues. Sensors (Basel) 20 (3)

Группа молекулярных инструментов для исследования живых систем (Аралов А.В.)

Геномные ДНК i-мотивы в качестве быстрых сенсоров, реагирующих на микроизменения pH вблизи физиологически релевантных значений

Мы разработали простые и надежные сенсоры для измерения внутриклеточного pH на основе ДНК i-мотивов (iMs), обнаруженных в генах, связанных с нейродегенерацией или канцерогенезом. Данные iM, по-видимому, являются геномными регуляторными элементами и могут модулировать транскрипцию в ответ на изменения pH. Учитывая присущую им чувствительность к незначительным изменениям pH в пределах физиологического диапазона, данные неканонические структуры ДНК можно использовать в качестве основного элемента сенсора без дополнительных модулей, за исключением флуоресцентных меток или тушителей. Мы отобрали несколько iM, которые демонстрировали быструю кинетику фолдинга/расплетения. Используя метод остановленного потока и метод FRET-плавления/отжига, мы подтвердили, что скорость зависимых от температуры переходов iM-оцДНК коррелируют со скоростью pH переходов. Таким образом, мы предлагаем анализ гистерезиса на основе FRET в качестве экспресс-метода выбора сенсоров с заданными кинетическими характеристиками. Для лидерного быстродействующего сенсора мы оптимизировали схему мечения и провели внутриклеточную калибровку. В отличие от обычно используемых низкомолекулярных индикаторов pH, данный сенсор эффективно транспортировался на ядра клеток. Благодаря подходящим кинетическим характеристикам сенсор можно использовать для мониторинга динамики протонов в ядре. Наши результаты свидетельствуют о том, что дизайн с применением геномных последовательностей является продуктивным подходом к разработке биосовместимых молекулярных инструментов.

  1. Turaev AV, Isaakova EA, Severov VV, Bogomazova AN, Zatsepin TS, Sardushkin MV, Aralov AV, Lagarkova MA, Pozmogova GE, Varizhuk AM 2020 Genomic DNA i-motifs as fast sensors responsive to near-physiological pH microchanges. Biosens Bioelectron 112864

Отдел биотехнологии

Лаборатория биофармацевтических технологий (Есипов Р.С.)

,  

Лаборатория биосинтеза низкомолекулярных физиологически активных соединений (Константинова И.Д.)

Сравнительный анализ ферментативной активности и 3D-структур пурин- нуклеозидфосфорилаз из термофильной бактерии Thermus thermophilus HB27

Получены две рекомбинантные пуриннуклеозидфосфорилазы из термофильной бактерии Thermus thermophilus HB27. Проведено сравнительное исследование их ферментативной активности и 3D структур. Для ферментов показана разная специфичность: у TthPNPI к гуанозину, а у TthPNPII к аденозину. Получена структура апоформы TthPNPII с разрешением 2.5 Å и депонирована в базу данных RCSB Protein Data Bank под идентификатором 6tk9. Сравнение активных центров TthPNPII и PNP из Thermus thermophilus HB8, являющейся полным гомологом TthPNPI, показало принципиальную разницу в участке, ответственном за распознавание пуринового основания: остатки Asn204 и Glu156 в TthHB8PNP и Asp235 и Ala193 в TthPNPII. Для TthPNPII, обладающей высокой гомологией с тримерными PNP, показана уникальная гексамерная организация (димер тримеров). Результаты аналитической гель-фильтрационной хроматографии и SAXS исследования подтвердили данные рентгеноструктурного анализа.

  1. Timofeev VI, Fateev IV, Kostromina MA, Abramchik YA, Konstantinova ID, Volkov VV, Lykoshin DD, Mikheeva OO, Muravieva TI, Esipov RS, Kuranova IP 2020 The comparative analysis of the properties and structures of purine nucleoside phosphorylases from thermophilic bacterium Thermus thermophilus HB27. J Biomol Struct Dyn 1–16

Лаборатория биосинтеза низкомолекулярных физиологически активных соединений (Константинова И.Д.)

,  

Лаборатория структурной биологии ионных каналов (Шенкарёв З.О.)

,  

Лаборатория биофармацевтических технологий (Есипов Р.С.)

Радикальное дегалоидирование и пуриннуклеозидфосфорилаза E. coli: как примесь 2',3'-ангидроинозина ингибировала синтез 2-фторкордицепина

Во время ферментативного синтеза 2-фторкордицепина из 2-фтораденозина мы обратили внимание на замедление реакции и заметное снижение выхода целевого продукта до 5 %. Неизвестный нуклеозид, в последствие идентифицированный как соединение (4) был обнаружен в реакционной смеси. Этот нуклеозид образовывался из примеси 2',3'-ангидроинозина (1) в исходном 3'-дезоксиинозине. 2',3'-Ангидроинозин -побочный продукт, который образовывался во время реакции радикального дегалоидирования 9-(2′,5′-ди-O-ацетил-3′-бром-3′-дезокси­ксилофуранозил)гипоксантина (предшественника 3'-дезоксиинозина в химическом синтезе). Как могла примесь 2',3'-ангидроинозина или продукты ее деградации в буферном растворе влиять на работу пуриннуклеозидфосфорилазы E. coli в синтезе 2-фторкордицепина? Мы досконально изучили процесс деградации 2',3'-ангидроинозина (1). Заменой H2O на D2O мы замедлили химические процессы. Нам удалось идентифицировать полупродукты деградации эпокиси инозина - (2) и (3), выделить их из реакционной смеси и установить их структуру с помощью масс- и ЯМР-спектроскопии. Механизм деградации 2',3'-ангидроинозина в D2O и структура нуклеозидов(2) и (3) описаны впервые.

Manuscript ID: Вiomolecules-976139 Title: "Radical dehalogenation and purine nucleoside phosphorylase E. coli: how does an admixture of 2',3'-anhydroinosine hinder 2-fluoro-cordycepin synthesis". Submitted 8 October 2020 to section: "Enzymology", Special Issue «Biotechnological and Biomedical Applications of Enzymes Involved in the Synthesis of Nucleosides and Nucleotides»

Группа химии пептидов (Азев В.Н.)

,  

Лаборатория биологических испытаний (Дьяченко И.А.)

Дизайн и синтез пептида с антибактериальной активностью

С целью создания нового класса соединений пептидной природы с антибактериальными свойствами предложен химический синтез конъюгатов состоящих из двух функционально-активных пептидов. Один пептид является амилоидогенным фрагментом цитозольного белка бактирии и его функция заключается в индукции агрегации «родительского» цитозольного белка. Второй пептид имеет свойство транслоцироваться через биологические мембраны, кроме того он служит переносчиком различных молекул через них. Таким образом, возможный биологический эффект конъюгата на молекулярном уровне заключался бы в индукции агрегации цитозольного белка внутри бактерии и нарушению его функционирования с фатальным эффектом для микроорганизма. Описаный подход экспериментально проверен в ходе изучения биологической активности конъюгатов состоящих из амилоидогенных пептидов, являющихся фрагментами белка S1 бактерии Thermus thermophilus и интернализирующего пептида RKKRRQRRR являющегося фрагментом белка Tat (Tat49-57). Один из конъюгатов обладал антибактериальной активностью сравнимой с антибиотиком канамицином по величине MIC. Предварительные данные по изучению механизма действия конъюгата свидетельствуют о том, что его взаимодействие с бактерией более сложное, чем предполагает исходная гипотеза, но эти данные не исключают наличия цитозольной мишени.

  1. Kurpe SR, Grishin SY, Surin AK, Selivanova OM, Fadeev RS, Dzhus YF, Gorbunova EY, Mustaeva LG, Azev VN, Galzitskaya OV 2020 Antimicrobial and amyloidogenic activity of peptides synthesized on the basis of the ribosomal S1 protein from thermus thermophilus. Int J Mol Sci 21 (17) 1–19

Группа молекулярной биотехнологии (Микулинская Г.В.)

Спектр антибактериального действия эндолизинов бактериофагов Т5, RB43 и RB49

Исследовано антибактериальное действие трёх фагоспецифических пептидаз на бактерии с различной структурой пептидогликана. Показано, что эндолизины миовирусов RB43 и RB49 эффективно лизируют целый ряд бактерий, не являющихся хозяевами для этих фагов. Промежуточной стадией лизиса является образование сферопластов и протопластов. Полученные данные расширяют возможности применения этих ферментов как в биомедицине, так и для нужд биотехнологии.

  1. Shadrin VS, Machulin AV, Dorofeeva LV, Chernyshov SV, Mikoulinskaia GV 2020 Lysis of cells of diverse bacteria by l,d‐peptidases of Escherichia coli bacteriophages RB43, RB49 and T5. J Appl Microbiol

Отдел биофотоники

Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов (Лукьянов К.А.)

Генетически кодируемый сенсор поли-АДФ-рибозы

Поли-АДФ-рибозилирование - это обратимая посттрансляционная модификация белков и ДНК, которая играет важную роль в различных клеточных процессах, таких как реакция на повреждение ДНК, репликация, транскрипция и гибель клеток. В настоящей работе мы разработали первый полностью генетически кодируемый флуоресцентный сенсор поли-АДФ-рибозы (ПАР) на основе Фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET).

Домен WWE убиквитинлигазы RNF146 E3, который распознает внутреннюю ПАР-специфическую структурную единицу изо-АДФ-рибозы, был использован в качестве модуля нацеливания на ПАР. Сенсор состоял из флуоресцентных белков Turquoise2 и Venus, каждый из которых был слит с доменом WWE. Этот двухчастный сенсор, названный sPARroW (sensor for PAR relying on WWE), позволял контролировать накопление и распад ПАР в живых клетках млекопитающих в ответ на различные стимулы, а именно на обработку перекисью водорода, УФ-облучение и гипертермию.

Универсальность возможных способов детекции сигнала сенсора (транслокация сигнала, либо ратиометрическая детекция FRET, либо визуализации FRET на основе детекции времени жизни флуоресценции) делает sPARroW легко применимым в различных биологических моделях и микроскопах.

  1. Serebrovskaya EO, Podvalnaya NM, Dudenkova VV, Efremova AS, Gurskaya NG, Gorbachev DA, Luzhin AV, Kantidze OL, Zagaynova EV, Shram SI, Lukyanov KA 2020 Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Poly-ADP-Ribose. Int J Mol Sci 21 (14) 1–11

Лаборатория рентгеноструктурных исследований биополимеров (Плетнёв В.З.)

,  

Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов (Лукьянов К.А.)

Структурно-функциональная взаимосвязь красного флуоресцентного биомаркера FusionRed

Красный флуоресцентный белок FusionRed является эффективным мономерным малотоксичным биомаркером и широко используется для мечения биологических объектов в живых клетках и тканях. resolution. Методом рентгеноструктурного анализа в определена его структура при сверхвысоком разрешении 1.09Å. Установлено наличие двух альтернативных путей пост-трансляционной модификации белка с образованием зрелого хромофора (~60%) и интактной хромофоробразующей триады (~40%). Структурно обоснованная замена остатка Cys158 (стабилизирующего несозревшую форму за счет Н-связи) на объемный гидрофобный остаток Leu привела к 100% созреванию хромофора.

  1. Muslinkina L, Pletnev VZ, Pletneva NV, Ruchkin DA, Kolesov DV, Bogdanov AM, Kost LA, Rakitina TV, Agapova YK, Shemyakina II, Chudakov DM, Pletnev S 2020 Two independent routes of post-translational chemistry in fluorescent protein FusionRed. Int J Biol Macromol 155 551–559

Лаборатория рентгеноструктурных исследований биополимеров (Плетнёв В.З.)

,  

Группа молекулярных меток для оптической наноскопии (Мишин А.С.)

Пространственная организация фотостабильного биомаркера нового типа - DiB1

Методом рентгеноструктурного анализа c высоким разрешением 1.58Å установлена структура фотостабильного нековалентного комплекса бактериального липокалина Blc c синтетическим хромофором М739 (DiB1:M739).

Установлены стереохимические детали связывания хромофора и на основе полученных структурных данных осуществлен дизайн двух новых генно-инженерных биомаркеров (зеленого и желтого) с повышенной аффинностью и яркостью.

  1. Muslinkina L, Gavrikov AS, Bozhanova NG, Mishin AS, Baranov MS, Meiler J, Pletneva NV, Pletnev VZ, Pletnev S 2020 Structure-Based Rational Design of Two Enhanced Bacterial Lipocalin Blc Tags for Protein-PAINT Super-resolution Microscopy. ACS Chem Biol 15 (9) 2456–2465

Группа молекулярных меток для оптической наноскопии (Мишин А.С.)

,  

Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов (Лукьянов К.А.)

К/E-спирали: флуоресцентное мечение белков и наноскопия Protein-PAINT

Гетеродимеризацию K/E-спиралей впервые применили для флуоресцентного мечения белков в живых клетках.

Одна из специально подобранных α-спиралей (K или E) служит меткой для целевого белка, а другую помещают на генетически кодируемый флуоресцентный белок. За счет обратимого взаимодействия K и E-спиралей целевая белковая структура окрашивается, а непрерывный обмен флуоресцентных белков в составе комплекса на порядок увеличивает устойчивость к фотообесцвечиванию.

Небольшой размер меток (всего 2-3 кДа) позволяет сохранить нативную динамику исследуемых белков. Вдобавок, такой метод дает возможность наблюдать белки практически сразу после их синтеза.

Наиболее интересным оказалось применение K/E-спиралей для Protein-PAINT – локализационной микроскопии сверхвысокого разрешения, основанной на обратимом взаимодействующих метках. Непрерывный обмен флуоресцентных белков между целевой клеточной структурой и цитоплазматическим пулом обеспечивает стабильно высокую плотность мечения даже при продолжительной съемке. С помощью K/E-спиралей впервые удалось воплотить концепцию наноскопии Protein-PAINT с использованием только генетически кодируемых репортеров.

  1. Perfilov MM, Gurskaya NG, Serebrovskaya EO, Melnikov PA, Kharitonov SL, Lewis TR, Arshavsky VY, Baklaushev VP, Mishin AS, Lukyanov KA 2020 Highly photostable fluorescent labeling of proteins in live cells using exchangeable coiled coils heterodimerization. Cell Mol Life Sci 77 (21) 4429–4440

Отдел биологических испытаний

Лаборатория фармакокинетики (Зинченко Д.В.)

Новый подход к экспрессии и очистке миристоилированных форм белков семейства нейрональных кальциевых сенсоров.

Молекулярные механизмы функционирования белков семейства нейрональных кальциевых сенсоров (НКС) представляют большой интерес, так как они участвуют в прогрессировании офтальмологических и нейродегенеративных заболеваний, а также развитии рака. Используемые в настоящий момент подходы для получения, соответствующих нативным, миристоилированных форм рекомбинантных НКС посредством их бактериальной коэкспрессии с N-миристоилтрансферазой из Saccharomyces cerevisiae часто дают смесь миристоилированных и немиристоилированных форм. Мы предлагаем новую методику получения НКС (рековерин, GCAP1, GCAP2, нейрокальцин δ и NCS-1), обеспечивающую их почти полное N-миристоилирование. Предложенная методика включает в себя оптимизирование бактериальной экспрессии и схему разделения миристоилированных и немиристоилированных форм НКС с использованием нескольких типов гидрофобной хроматографии. Кроме этого, нами было показано, что после ренатурации NCS-1 сохраняет свою Са2+-связывающую способность и стабильность третичной структуры. Стоить отметить, что разработанный подход может быть использован для получения миристоилированных форм различных других белков.

  1. Vladimirov VI, Baksheeva VE, Mikhailova IV, Ismailov RG, Litus EA, Tikhomirova NK, Nazipova AA, Permyakov SE, Zernii EY, Zinchenko DV 2020 A Novel Approach to Bacterial Expression and Purification of Myristoylated Forms of Neuronal Calcium Sensor Proteins. Biomolecules 10 (7)

28 декабря 2020 года