Лаборатория биотехнологии

Руководитель: Мирошников Анатолий Иванович, академик
+7 (495) 330-59-38 · aiv@ibch.ru

Технологии получения рекомбинантных белков и пептидов, пептидные гормоны, полипептиды для медицинского применения, анти- и ангиогенные препараты, ферменты, ферменты нуклеинового обмена, нуклеозиды, биомодели, БАВ из морских беспозвоночных, БАВ из растений, прокариотические штаммы-продуценты, фосфоамидиты, производство биофармацевтических препаратов, мутагенез, ДНК-диагностика тромбофилии

Лаборатория биотехнологии была образована на основе созданного в 1980 г. отдела биотехнологии, с 1990 г. — лаборатория биотехнологии с комплексной опытной установкой, с 2000 г. — лаборатория биотехнологии. Основными направлениями работ лаборатории являются разработка фундаментальных и прикладных аспектов биотехнологии и внедрение результатов фундаментальных молекулярно-биологических и молекулярно-генетических исследований в производство биофармацевтических препаратов, а также в сельскохозяйственную практику.

В лаборатории осуществляется полный цикл работ в области генной инженерии: от выбора стратегии клонирования индивидуального гена и его химико-ферментативного синтеза до разработки метода выделения, очистки, полной физико-химической идентификации и исследования биологической активности, масштабирования экспрессии и стадии ферментации, а также создания лабораторных и опытно-промышленных регламентов, которые реализуются совместно с Опытным биотехнологическим производством.

Направления исследований

Лаборатория занимается разработкой лекарственных препаратов белковой природы на базе технологий рекомбинантных ДНК с привлечением последних достижений генной инженерии (группа синтеза рекомбинантых белков и пептидов под руководством к.х.н. Есипова Р.С.), осуществляя полный цикл работ: от выбора стратегии клонирования индивидуального гена и его химико-ферментативного синтеза до разработки методов выделения, очистки и тестирования целевого белка. Основные усилия сосредоточены на использовании прокариотических штаммов-продуцентов, штаммов-продуцентов культур растительных клеток.

Кроме рекомбинантых белков в лаборатории разрабатываются технологии получения других биологически активных веществ (БАВ): пептидов, гормонов, дисахаридов, ферментов, нуклеозидов, БАВ растительного происхождения с использованием химико-ферментативных процессов. В последнее время разрабатываются методы получения рекомбинантных белков и пептидов, в том числе и с использованием процессов белкового сплайсинга.

Наряду с развитием биотехнологических методов получения физиологически активных веществ, лаборатория разрабатывает методы химического синтеза нуклеотидов и нуклеозидов, пептидов; создает тест-системы для ДНК-диагностики мутаций, ассоциированных с тромбофилией.

Совместно с другими лабораториями Института и другими организациями проводятся исследования по испытанию на мышиных биомоделях новых противовирусных и противоопухолевых препаратов и вакцин.

Основные достижения

Одним из главных достижений лаборатории совместно с опытным биотехнологическим производством ИБХ является разработка и внедрение отечественной технологии производства активной фармацевтический субстанции (АФС) генно-инженерного инсулина человека (руководитель —  А. И. Мирошников). Реализация проекта была осуществлена в 2000—2004 гг. при активной поддержке Российской академии наук и Правительства г. Москвы. Получение АФС привело к разработке готовых лекарственных форм инсулина в виде быстродействующей лекарственной формы — «Инсуран Р» (удельная активность 40 и 100 МЕ/мл), а также лекарственной формы пролонгированного действия — «Инсуран НПХ» (40 и 100 МЕ/мл). Завершение этого масштабного проекта позволило на базе ИБХ освоить производство АФС и лекарственных форм генно-инженерного инсулина человека в количестве, обеспечивающем 14% потребности здравоохранения г. Москвы в инсулине. В 2005 г. эта работа была удостоена премии Правительства РФ в области науки и техники.

Аналогичные этапы исследования были проделаны при разработке технологии производства важных для медицинской практики рекомбинантных гормонов — соматропина (лекарственная форма «РастанТМ») и окситоцина.

Разработка и освоение опытно-промышленного производства рекомбинантных ферментов пурин- и пиримидинфосфорилаз позволила отработать и масштабировать отдельные стадии биотехнологического процесса получения субстанций лекарственных препаратов «Кладрибина» и «Флударабина» — препаратов на основе модифицированных нуклеозидов с использованием ферментативного трансгликозилирования и обладающих широким спектром противоопухолевой активности в отношении лимфоидных злокачественных новообразований, а также противовирусного препарата «Рибаварина».

Совместно с лабораторией биокатализа Института были клонированы и экспрессированы гены альбумина человека в метилотрофных дрожжах, а также фактора VII крови в эукариотической системе.

Разработана и реализована схема получения целевых пептидов с использованием процесса белкового сплайсинга. Новизна предлагаемого подхода заключается в использовании генетических конструкций, в состав которых входит белок интеин, способный к управляемому автокаталитическому расщеплению, в результате которого происходит выщепление целевого биологически активного пептида из гибридного белка в специально подобранных условиях. Основным преимуществом данного подхода является исключение стадии ферментативного расщепления гибридного белка, что значительно упрощает и удешевляет процесс получения целевых продуктов.

По схеме белкового сплайсинга клонированы и экспрессированы гены пептидных гормонов: тимозина α1, применяющегося для лечения бактериальных инфекционных и вирусных заболеваний (гепатитов В и С), а также в качестве противоопухолевого средства; глюкагона — анатагониста инсулина, используемого при терапии тяжелых гипогликемических состояний больных сахарным диабетом; эпидермального фактора роста — для заживления ран и при ангиогенезе; эксендина-4 — глюкагон-подобного пептида — для лечения диабета второго типа; кальцитонина — для лечения системных заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ; гирудина — как антикоагулянта для предотвращения осложнений, связанных с тромбообразованием при инфаркте миокарда и тромботическом инсульте.

Кроме того, в стадии научной разработки находятся следующие препараты: интерфероны α-2b иβ-1b, пептидные гормоны — проинсулин и С-пептид человека для диагностики инсулиномы; интерлейкин-3 человека для лечения органов кроветворения; полипептиды — циклотиды растений как противоопухолевые и противовирусные препараты, инсектициды, ESAT-6, микобактериальный антиген Mycobacterium tuberculosis как диагностическое средство, азурин из Pseudomonas aeruginosa как противоопухолевое средство; анти- и ангиогенные препараты — фрагменты тумстатина (L69К-95) и эндостатина 1—49, сосудистый фактор роста эндотелия, изоформа VEGF165b, сосудистый фактор роста эндотелия VEGF165, фрагмент 24—57 фактора дифференцировки пигментного эпителия (PEDF), ферменты нуклеинового обмена.

Помимо ингибиторов ферментов из ВИЧ-1 иВИЧ-2 на основе модифицированных нуклеозидов лаборатория занимается поиском пептидов-ингибиторов ферментов ревертазы ВИЧ и интегразы ВИЧ-1 из полихеты тропических морей Eunicidae Gen. sp. N3. Было показано, что оба ингибиторных пептида содержат необычные аминокислоты — метилгистидин и гомосерин.

Совместно с другими лабораториями разработан математический метод анализа, позволяющий выявлять в последовательностях белков иерархически организованные элементы — ЭЛементы Информационной Структуры (ЭЛИС). Показано, что ЭЛИС соответствуют устойчивым элементам в пространственной структуре белков. В белках с четко выраженной доменной структурой ЭЛИС высшего ранга соответствуют структурным доменам, а в остальных белках — «скрытым» доменам, ответственным за проявление белками функциональной активности.

Представления об информационной структуре белков позволили предложить:

  • метод получения новых рекомбинантных белков;
  • метод нахождения В-эпитопов в первичных структурах белков.

Предложенные теоретические методы были апробированы в экспериментальных исследованиях, выполненных в различных лабораториях ИБХ РАН. Метод АНализа Информационной Структуры (АНИС) белков реализован в виде общедоступного WEB-сервиса «ANIS-Trees» (anis.ibch.ru/trees).

Разработаны методы синтеза фосфоамидитов полностью защищенных тридезоксинуклеотидов — исходных компонентов для синтеза пептидных и олигонуклеотидных библиотек, а также частично защищенных дирибонуклеотидов высокой чистоты в препаративных масштабах (10—20 г) для синтеза олигорибонуклеотидов высокой чистоты.

Ведутся работы по синтезу библиотек модифицированных нуклеозидов, структурно-функциональному анализу полученных соединений и скринингу их биологической активности.

Разработано 12 тест-систем для ДНК-диагностики мутаций, ассоциированных с тромбофилией. Разработана тест-система ДНК-диагностики врожденной гиперплазии надпочечников и исследуются мутационные изменения гена CYP21 при этой патологии. Получены высококачественные препараты рекомбинантной Taq-ДНК-полимеразы и ее производных.

Сотрудники лаборатории работают с клеточными культурами растений, которые являются потенциальными продуцентами БАВ. Изучены состав экстрактов БАВ и возможность их использования в косметических средствах. Отработаны лабораторные способы выделения лигнанов, берберина, ведется работа по изучению биотехнологических способов получения из клеточных культур терпеноидов, апокаратиноидов, каратиноидов.

Большинство приоритетных работ защищено российскими патентами (более 40).

Лаборатория принимает участие в многочисленных исследовательских проектах совместно с другими отечественными лабораториями и международными партнерами. Партнерами Лаборатории являются: Филиал ИБХ РАН, Институт молекулярной биологии им. Энгельгардта РАН, Институт кристаллографии им. Шубникова РАН, НИИ химической биологии и фундаментальной медицины, НИИ физиопульманологии ММА им. Сеченова, МГУ прикладной биотехнологии, Гематологический центр РАМН, Институт вирусологии им. Ивановского РАМН, Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий, НИИ при больнице им. Кащенко, University of Kuopio Department of Pharmaceutical Chemistry (Kuopio, Finland), Фонд экспериментальной патологии и иммунологии опухоли (Амстердам, Нидерланды) и пр.

Лаборатория имеет 13 грантов МНТЦ, РФФИ и др.

Постоянно ведется работа с молодежью, и готовятся молодые специалисты. За время существования Лаборатории по тематике исследований были защищены 2 докторские и более 10 кандидатских диссертаций.

Лаборатория биотехнологии (слева направо): в нижнем ряду – асп. Бейрахова К.А., к.н., в.н.с. Берзин В.Б., зав. лаб., академик Мирошников А.И., д.н., в.н.с. Гуревич А.И., к.н., с.н.с. Леонов В.Н.; в верхнем ряду – инж.-иссл. Абрамчик Ю.А., к.н., н.с. Чупова Л.А., к.н., с.н.с. Есипов Р.С., к.н., н.с. Константинова И.Д., н.с. Музыка И.С., м.н.с. Фатеев И.В., к.н., с.н.с. Муравьева Т.И., к.н., с.н.с. Каюшин А.Л., н.с. Коростелева М.Д., математик Трофимова Е.Н., н.с. Дорофеева Е.В., к.н., н.с. Степаненко В.Н., н.с. Тихомирова О.Б., инж.-иссл. Лутонина О.И

 

Ф.И.О.ДолжностьЭл. почта
Аронов Дмитрий Алексеевичтех.-лаб.
Баранник Алла Петровнаинж.-иссл.
Берзин Валерий Беннович, к. х. н.в.н.с.
Берзина Мария асп.
Ванцева Светлана Ивановнаинженер
Васильев Олег Леонидович
Гукасова Елена Александровна, к. х. н.н.с.
Даянова Люция Кутузовнаасп.
Демехина Александра Андреевнаинж.-иссл.
Дорофеева Елена Викторовнан.с.
Елецкая Барбара Златковнаинженер
Елякова Людмила Алексеевна, д. х. н.в.н.с.
Есипов Роман Станиславович, к. х. н.с.н.с.
Карягина Татьяна Борисовна, к. б. н.н.с.
Каюшин Алексей Львович, к. х. н.с.н.с.
Кесслер Юлия Валерьевнаст. лаб.
Коваленко Татьяна Феликсовнам.н.с.
Константинова Ирина Дмитриевна, к. х. н.с.н.с.
Коростелёва Мария Дмитриевна, к. б. н.н.с.
Леонов Владимир Николаевич, к. х. н.с.н.с.
Лутонина Ольга Ивановнаинж.-иссл.
Любавина Ирина Александровнан.с.
Макаров Дмитрий Александровичвед. инж.
Михеева Ольга Олеговнаасп.
Моисеева Екатерина Викторовна, к. б. н.н.с.
Музыка Инесса Степановнан.с.
Муравьёва Татьяна Игоревна, к. б. н.с.н.с.
Патрушев Лев Иванович, д. б. н., профессорв.н.с.
Патрушева Наталья Львовнаинж.-иссл.
Рылова Юлия инж.-иссл.
Смирнова Ольга Сергеевнам.н.с.
Тихомирова Ольга Борисовнан.с.
Трофимова Елена Николаевнаматем.
Узнадзе Ольга Леонидовнаинж.-иссл.
Фатеев Илья Владимирович, к. х. н.н.с.
Чупова Лариса Анатольевна, к. х. н.н.с.

Избранные публикации

  1. Таран С.А., Верёвкина К.Н., Феофанов С.А., Мирошников А.И. (2009). Ферментативное трансгликозилирование природных и модифицированных нуклеозидов иммобилизованными термостабильными нуклеозидфосфорилазами из Geobacillus stearothermophilus. Биоорг. хим. 35 (6), 822–829 ID:198
  2. Kayushin A., Korosteleva M., Miroshnikov A. (2009). Large-scale solid-phase preparation of 3'-unprotected trinucleotide phosphotriesters--precursors for synthesis of trinucleotide phosphoramidites. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 19 (10-12), 1967–76 [+]

    The approach to large-scale solid-phase synthesis of 3'-unprotected trinucleotide phosphotriesters has been developed. The trinucleotides have been synthesized in 5 g scale by phosphotriester approach using CPG with pore size 70A. Total yield of target products was 75-90%. The molar extinctions of trinucleotides at various wave-lengths were calculated; the experimental UV-spectra of trinucleotides show a good agreement with theoretical ones. The trinucleotides synthesized were used for synthesis of trinucleotide phosphoramidites - synthons for generation of DNA/peptide libraries.

    ID:205
  3. Безуглов В.В., Грецкая Н.М., Клинов Д.В., Бобров М.Ю., Шибанова Е.Д., Акимов М.Г., Фомина-Агеева Е.В., Зинченко Г.Н., Баирамашвили Д.И., Мирошников А.И. (2009). Нанокомплексы рекомбинантных белков с полисиаловой кислотой. Получение, свойства и биологическая активность. Биоорг. хим. 35 (3), 350–356 ID:197
  4. Yagodkin A., Azhayev A., Roivainen J., Antopolsky M., Kayushin A., Korosteleva M., Miroshnikov A., Randolph J., Mackie H. (2007). Improved synthesis of trinucleotide phosphoramidites and generation of randomized oligonucleotide libraries. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 26 (5), 473–97 [+]

    A new method to produce a set of 20 high quality trinucleotide phosphoramidites on a 5-10 g scale each was developed. The procedure starts with condensation reactions of P-components with N-acyl nucleosides, bearing the 3 '-hydroxyl function protected with 2-azidomethylbenzoyl, to give fully protected dinucleoside phosphates 13. Upon cleavage of dimethoxytrityl group from 13, dinucleoside phosphates 16 are initially transformed into trinucleoside diphosphates 19 and then the 2-azidomethylbenzoyl is selectively removed under neutral conditions to generate trinucleoside diphosphates 5 in excellent yield. Subsequent 3 '-phosphitylation affords target trinucleotide phosphoramidites 7. When mutagenic oligonucleotides are synthesized employing mixtures of building blocks 7 as well as following the new synthetic protocol, representative oligonucleotide libraries are generated in good yields.

    ID:199
  5. Roivainen J., Elizarova T., Lapinjoki S., Mikhailopulo I.A., Esipov R.S., Miroshnikov A.I. (2007). An enzymatic transglycosylation of purine bases. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 26 (8-9), 905–9 [+]

    An enzymatic transglycosylation of purine heterocyclic bases employing readily available natural nucleosides or sugar-modified nucleosides as donors of the pentofuranose fragment and recombinant nucleoside phosphorylases as biocatalysts has been investigated. An efficient enzymatic method is suggested for the synthesis of purine nucleosides containing diverse substituents at the C6 and C2 carbon atoms. The glycosylation of N(6)-benzoyladenine and N(2)-acetylguanine and its O(6)-derivatives is not accompanied by deacylation of bases.

    ID:200
  6. Chuvikovsky D.V., Esipov R.S., Skoblov Y.S., Chupova L.A., Muravyova T.I., Miroshnikov A.I., Lapinjoki S., Mikhailopulo I.A. (2006). Ribokinase from E. coli: expression, purification, and substrate specificity. Bioorg. Med. Chem. 14 (18), 6327–32 [+]

    Ribokinase (RK) was expressed in the Escherichia coli ER2566 cells harboring the constructed expression plasmid encompassing the rbsK gene, encoding ribokinase. The recombinant enzyme was purified from sonicated cells by double chromatography to afford a preparation that was ca. 90% pure and had specific activity of 75 micromol/min mg protein. Catalytic activity of RK: (i) is strongly dependent on the presence of monovalent cations (potassium>>>ammonium>cesium), and (ii) is cooperatively enhanced by divalent magnesium and manganese ions. Besides D-ribose and 2-deoxy-D-ribose, RK was found to catalyze the 5-O-phosphorylation of D-arabinose, D-xylose, and D-fructose in the presence of ATP, and potassium and magnesium ions; L-ribose and L-arabinose are not substrates for the recombinant enzyme. A new radiochemical method for monitoring the formation of D-pentofuranose-5-[32P]phosphates in the presence of [gamma-32P]ATP and RK is reported.

    ID:201
  7. Mikoulinskaia G.V., Gubanov S.I., Zimin A.A., Kolesnikov I.V., Feofanov S.A., Miroshnikov A.I. (2003). Purification and characterization of the deoxynucleoside monophosphate kinase of bacteriophage T5. Protein Expr. Purif. 27 (2), 195–201 [+]

    Deoxynucleoside monophosphate kinase (dNMP kinase) of bacteriophage T5 (EC 2.7.4.13) was purified to apparent homogeneity from phage-infected Escherichia coli cells. Electrophoresis in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel showed that the enzyme has a molecular mass of about 29 kDa. The molecular mass of dNMP kinase estimated by analytical equilibrium ultracentrifugation turned out to be 29.14 +/- 3.03 kDa. These data suggest that the enzyme exists in solution as a monomer. The isoelectric point of dNMP kinase was found to be 4.2. The N-terminal amino acid sequence, comprising 21 amino acids, was determined to be VLVGLHGEAGSGKDGVAKLII. A comparison of this amino acid sequence and those of known enzymes with a similar function suggests the presence of a nucleotide-binding site in the sequenced region.

    ID:202
  8. Esipov R.S., Gurevich A.I., Chuvikovsky D.V., Chupova L.A., Muravyova T.I., Miroshnikov A.I. (2002). Overexpression of Escherichia coli genes encoding nucleoside phosphorylases in the pET/Bl21(DE3) system yields active recombinant enzymes. Protein Expr. Purif. 24 (1), 56–60 [+]

    The Escherichia coli genes encoding purine nucleoside phosphorylase, uridine phosphorylase, and thymidine phosphorylase were cloned into pET plasmids to generate highly effective E. coli BL21(DE3) strains producing each of these enzymes. Optimum conditions for biosynthesis of each enzyme as a soluble protein with intact biological activity were found. The crude preparations are approximately 80% pure and can be used immediately for enzymatic transglycosylation. The enzyme preparations were purified to homogeneity by two steps including fractional precipitation with ammonium sulfate and subsequent chromatography on Sephadex G-100 and DEAE-Sephacel.

    ID:203
  9. Sergeev N.V., Gloukhova N.S., Nazimov I.V., Gulyaev V.A., Shvets S.V., Donetsky I.A., Miroshnikov A.I. (2001). Monitoring of recombinant human insulin production by narrow-bore reversed-phase high-performance liquid chromatography, high-performance capillary electrophoresis and matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry. J Chromatogr A 907 (1-2), 131–44 [+]

    An analytical scheme for monitoring recombinant human insulin (rhI) production is suggested. The scheme includes high-performance separation micro-techniques (narrow-bore RP-HPLC, HPCE) based on different separation mechanisms and matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight MS, and allows one to obtain unambiguous information about purity and primary structure of all intermediates of the rhI production. The use of this scheme at all production steps provided optimisation of certain technological parameters [conditions for a fusion protein (FP) refolding, temperature and duration of the FP cleavage with trypsin, conditions for carboxypeptidase B digestion of di-ArgB31-B32-insulin] and achievement of a high purity of the end-product. The proposed scheme may be used for solving various problems in monitoring production of other recombinant proteins.

    ID:204
  10. Миргородская О.А., Козьмин Ю.П., Титов М.И., Савельева Н.М., Кернер Р., Сонксен К., Ройпсторфф П., Мирошников А.И. (2000). Использование MALDI-MS для количественного анализа пептидов и белков. Биоорг. хим. 26 (9), 662–671 ID:206

Руководитель подразделения

Мирошников Анатолий Иванович

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 53, комн. 6601
  • Тел.: +7 (495) 330-59-38
  • Эл. почта: aiv@ibch.ru
Факс: +7 (495) 330-74-10