Кульбацкий Дмитрий Сергеевич


Младший научный сотрудник (Группа биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов)

Эл. почта: d.kulbatskiy@gmail.com

Избранные публикации

  1. Парамонов А.С., Кульбацкий Д.С., Локтюшов Е.В., Царев А.В., Долгих Д.А., Шенкарёв З.О., Кирпичников М.П., Люкманова Е.Н. (2017). Рекомбинантная продукция и исследование структуры белков человека Lypd6 и Lypd6b. Биоорг. хим. 43 (6), 620–630 [+]

    Белки человека Lypd6 и Lypd6b экспрессируются во многих тканях и имеют высокую степень гомо-
    логии аминокислотной последовательности (~ 54%). Оба белка в отличие от других белков семейства
    Ly6/uPAR имеют дополнительные протяженные N- и С-концевые аминокислотные последователь-
    ности, примыкающие к трехпетельному LU-домену, роль которых на данный момент не изучена. Из-
    вестно, что Lypd6 увеличивает амплитуду токов кальция, индуцированных никотином в нейронах
    тройничного нерва мыши. Lypd6 рыбки Danio rerio участвует в регуляции Wnt/β-катенин сигнального
    каскада, и блокирование экспрессии гена lypd6 приводит к нарушению эмбрионального развития.
    Экспрессия Lypd6b в ооцитах X. laevis повышает чувствительность никотиновых ацетилхолиновых ре-
    цепторов к ацетилхолину и увеличивает скорость их десенситизации. Молекулярные механизмы дей-
    ствия, равно как и пространственная структура Lypd6 и Lypd6b, до сих пор не изучены. В представ-
    ленной работе получены и экспрессированы гены водорастворимых аналогов трехпетельных белков
    человека Lypd6 и Lypd6b, не содержащих N-концевые последовательности (rLypd6 и rLypd6b), а также
    Lypd6 с N-концевой последовательностью – N-rLypd6. Белки получали в виде цитоплазматических
    телец включения в E. coli с последующей солюбилизацией в денатурирующих условиях и ренатураци-
    ей. С целью оптимизации выхода рекомбинантных белков был проведен поиск условий ренатурации.
    Анализ полученных препаратов N-rLypd6, rLypd6 и rLypd6b методами ЯМР-спектроскопии показал,
    что N-rLypd6, возможно, не структурирован. Получение миллиграммовых количеств изотопно-ме-
    ченных вариантов rLypd6 и rLypd6b позволило охарактеризовать вторичную структуру этих белков
    и исследовать внутримолекулярную подвижность. Установлено, что rLypd6 и rLypd6b обладают струк-
    турными элементами, характерными для трехпетельных белков семейства Ly6/uPAR с некоторыми
    уникальными особенностями, такими как наличие дополнительной дисульфидной связи в третьей
    петле и спиральных участков в первой и третьей петлях.

    ID:1924
  2. Мышкин М.Ю., Парамонов А.С., Кульбацкий Д.С., Люкманова Е.Н., Кирпичников М.П., Шенкарёв З.О. (2017). ПОДХОД “РАЗДЕЛЯЙ И ВЛАСТВУЙ” ДЛЯ СТРУКТУРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ МУЛЬТИДОМЕННЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ НА ПРИМЕРЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПОТЕНЦИАЛ-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ДОМЕНОВ КАНАЛОВ Kv2.1 И Nav1.4 ЧЕЛОВЕКА1. Биоорг. хим. 43 (6), 608–619 [+]

    Потенциал-зависимые K+- и Na+-ионные каналы вовлечены в широкий спектр физиологических
    процессов, включая возбудимость сердечных, мышечных и нервных клеток, а также секрецию гор-
    монов и нейромедиаторов. Эти каналы имеют модульную структуру и состоят из пяти мембранных
    доменов: четырех потенциал-чувствительных доменов (ПЧД) и одного порового домена. На ПЧД раз-
    личных каналов локализованы уникальные сайты связывания с лигандами, поэтому ПЧД рассматри-
    ваются в качестве перспективных фармакологических мишеней. Модульная организация ионных ка-
    налов позволяет ставить задачи по структурным ЯМР-исследованиям изолированных ПЧД отдельно
    от поры. В настоящей работе рассмотрена возможность таких исследований на примере ПЧД канала
    Kv2.1 человека и первого ПЧД канала Nav1.4 человека. Разработаны сопряженные системы бескле-
    точного синтеза на основе бактериального экстракта S30 из E. coli, позволяющие получать милли-
    граммовые количества препаратов ПЧД, включая меченые стабильными изотопами аналоги. Важным
    этапом ЯМР-исследований является подбор мембраномоделирующей среды, обеспечивающей дол-
    говременную стабильность природной структуры мембранного белка в растворе и высокое качество
    ЯМР-спектров. Скрининг различных сред показал, что домены каналов Kv2.1 и Nav1.4 нестабильны
    в средах, содержащих фосфолипиды: мицеллах короткоцепочечного липида DC7PC и липид-детер-
    гентных бицеллах на основе цвиттер-ионных или анионных насыщенных липидов (DMPC и DMPG).
    Показано, что оптимальной средой для структурных ЯМР-исследований являются смеси цвиттер-
    ионного и слабокатионного детергентов (FOS-12/LDAO). Однако, несмотря на высокое качество
    спектров, образец ПЧД канала Nav1.4 в окружении FOS-12/LDAO необратимо агрегировал в течение
    нескольких дней. Вероятно, ПЧД K+- и Na+-каналов человека не являются полностью автономными
    мембранными доменами и для их стабилизации необходимы контакты с другими доменами канала.

    ID:1925
  3. Lyukmanova E.N., Shulepko M.A., Shenkarev Z.O., Kasheverov I.E., Chugunov A.O., Kulbatskii D.S., Myshkin M.Y., Utkin Y.N., Efremov R.G., Tsetlin V.I., Arseniev A.S., Kirpichnikov M.P., Dolgikh D.A. (2016). Central loop of non-conventional toxin WTX from Naja kaouthia is important for interaction with nicotinic acetylcholine receptors. Toxicon 119, 274–9 [+]

    'Three-finger' toxin WTX from Naja kaouthia interacts with nicotinic and muscarinic acetylcholine receptors (nAChRs and mAChRs). Mutagenesis and competition experiments with (125)I-α-bungarotoxin revealed that Arg31 and Arg32 residues from the WTX loop II are important for binding to Torpedo californica and human α7 nAChRs. Computer modeling suggested that loop II occupies the orthosteric binding site at α7 nAChR. The similar toxin interface was previously described as a major determinant of allosteric interactions with mAChRs.

    ID:1598
  4. Lyukmanova E.N., Shulepko M.A., Shenkarev Z.O., Bychkov M.L., Paramonov A.S., Chugunov A.O., Kulbatskii D.S., Arvaniti M., Dolejsi E., Schaer T., Arseniev A.S., Efremov R.G., Thomsen M.S., Dolezal V., Bertrand D., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. (2016). Secreted Isoform of Human Lynx1 (SLURP-2): Spatial Structure and Pharmacology of Interactions with Different Types of Acetylcholine Receptors. Sci Rep 6, 30698 [+]

    Human-secreted Ly-6/uPAR-related protein-2 (SLURP-2) regulates the growth and differentiation of epithelial cells. Previously, the auto/paracrine activity of SLURP-2 was considered to be mediated via its interaction with the α3β2 subtype of the nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs). Here, we describe the structure and pharmacology of a recombinant analogue of SLURP-2. Nuclear magnetic resonance spectroscopy revealed a 'three-finger' fold of SLURP-2 with a conserved β-structural core and three protruding loops. Affinity purification using cortical extracts revealed that SLURP-2 could interact with the α3, α4, α5, α7, β2, and β4 nAChR subunits, revealing its broader pharmacological profile. SLURP-2 inhibits acetylcholine-evoked currents at α4β2 and α3β2-nAChRs (IC50 ~0.17 and >3 μM, respectively) expressed in Xenopus oocytes. In contrast, at α7-nAChRs, SLURP-2 significantly enhances acetylcholine-evoked currents at concentrations <1 μM but induces inhibition at higher concentrations. SLURP-2 allosterically interacts with human M1 and M3 muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) that are overexpressed in CHO cells. SLURP-2 was found to promote the proliferation of human oral keratinocytes via interactions with α3β2-nAChRs, while it inhibited cell growth via α7-nAChRs. SLURP-2/mAChRs interactions are also probably involved in the control of keratinocyte growth. Computer modeling revealed possible SLURP-2 binding to the 'classical' orthosteric agonist/antagonist binding sites at α7 and α3β2-nAChRs.

    ID:1597
  5. Lyukmanova E.N., Shulepko M.A., Kudryavtsev D., Bychkov M.L., Kulbatskii D.S., Kasheverov I.E., Astapova M.V., Feofanov A.V., Thomsen M.S., Mikkelsen J.D., Shenkarev Z.O., Tsetlin V.I., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. (2016). Human Secreted Ly-6/uPAR Related Protein-1 (SLURP-1) Is a Selective Allosteric Antagonist of α7 Nicotinic Acetylcholine Receptor. PLoS ONE 11 (2), e0149733 [+]

    SLURP-1 is a secreted toxin-like Ly-6/uPAR protein found in epithelium, sensory neurons and immune cells. Point mutations in the slurp-1 gene cause the autosomal inflammation skin disease Mal de Meleda. SLURP-1 is considered an autocrine/paracrine hormone that regulates growth and differentiation of keratinocytes and controls inflammation and malignant cell transformation. The majority of previous studies of SLURP-1 have been made using fusion constructs containing, in addition to the native protein, extra polypeptide sequences. Here we describe the activity and pharmacological profile of a recombinant analogue of human SLURP-1 (rSLURP-1) differing from the native protein only by one additional N-terminal Met residue. rSLURP-1 significantly inhibited proliferation (up to ~ 40%, EC50 ~ 4 nM) of human oral keratinocytes (Het-1A cells). Application of mecamylamine and atropine,-non-selective inhibitors of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) and muscarinic acetylcholine receptors, respectively, and anti-α7-nAChRs antibodies revealed α7 type nAChRs as an rSLURP-1 target in keratinocytes. Using affinity purification from human cortical extracts, we confirmed that rSLURP-1 binds selectively to the α7-nAChRs. Exposure of Xenopus oocytes expressing α7-nAChRs to rSLURP-1 caused a significant non-competitive inhibition of the response to acetylcholine (up to ~ 70%, IC50 ~ 1 μM). It was shown that rSLURP-1 binds to α7-nAChRs overexpressed in GH4Cl cells, but does not compete with 125I-α-bungarotoxin for binding to the receptor. These findings imply an allosteric antagonist-like mode of SLURP-1 interaction with α7-nAChRs outside the classical ligand-binding site. Contrary to rSLURP-1, other inhibitors of α7-nAChRs (mecamylamine, α-bungarotoxin and Lynx1) did not suppress the proliferation of keratinocytes. Moreover, the co-application of α-bungarotoxin with rSLURP-1 did not influence antiproliferative activity of the latter. This supports the hypothesis that the antiproliferative activity of SLURP-1 is related to 'metabotropic' signaling pathway through α7-nAChR, that activates intracellular signaling cascades without opening the receptor channel.

    ID:1420