Группа генно-инженерных биофармацевтических технологий

     Основным направлением работы группы генно-инженерных биофармацевтических технологий являются разработка фундаментальных и прикладных аспектов биотехнологии и внедрение результатов в производство биофармацевтических препаратов. В группе осуществляется полный цикл работ в области генной инженерии и белковой химии: от выбора стратегии клонирования индивидуального гена и его химико-ферментативного синтеза до разработки метода выделения, очистки, полной физико-химической идентификации и исследования биологической активности, масштабирования экспрессии и стадии ферментации, а также создания лабораторных и опытно-промышленных регламентов, которые реализуются совместно с Опытным биотехнологическим производством. Особое внимание уделяется разработке биотехнологий получения биологически активных фармацевтических субстанций (АФС) и созданию готовых лекарственных средств (ГЛС) препаратов на основе рекомбинантных белков и пептидов, на базе опытного биотехнологического производства ИБХ РАН.

     Группа, входящая в состав лаборатории биотехнологии, успешно принимает участие в государственных программах: «Фарма 2020», Федеральной космической программе России, грантах Российского Фонда Науки и Российского Фонда Фундаментальных Исследований. Сотрудники группы неоднократные победители конкурса молодых ученых на Московской международной конференции «БИОТЕХНОЛОГИЯ и МЕДИЦИНА», «УМНИК».

       Сотрудники группы обладают большим опытом в создании и дальнейшей верификации широкого круга рекомбинантных препаратов, получаемых в том числе и с помощью технологий белкового сплайсинга. Совместная работа сотрудников группы с опытным биотехнологическим производством ИБХ РАН позволила в кратчайшие сроки организовать получение опытных партий целого ряда потенциальных лекарственных препаратов в рамках государственных контрактов Минпромторга и Минобрнауки для проведения доклинических исследований.

      Большое внимание в группе уделяется работе со школьниками, студентами и аспирантами профильных учебных заведений. Студенты Института тонких химических технологий Московского технологического университета (МТУ), Заяц Евгений Андреевич и Терешин Михаил Николаевич, постоянно и активно работающие в группе генноинженрных биотехнологических технологий, являются призерами нескольких интеллектуальных турниров биологической направленности всероссийского и международного уровня в составе команды «БиоТех» МИТХТ.

1)  IV открытое всероссийское студенческое командное соревнование «Биотурнир 2017» в г. Пущино:
    II место в командном зачете.
Терешин Михаил получил приз «Лучшему игроку турнира».

2018_02_19_16_08_413.png

2)  Международная биологическая универсиада МГУ 2017:
      Командный диплом II степени.

2018_02_19_16_09_174.png

3)  III студенческий биологический турнир МГУ 2018:
      Командный диплом III степени
. Евгений и Михаил также стали победителями в личном первенстве, получив дипломы II степени. Михаил вошел в сборную лучших игроков турнира, получив диплом «Лучшего докладчика и рецензента».

2018_02_19_16_09_405.png

      27 октября 2016 года сотрудники Института биоорганической химии РАН провели экскурсию для участников профориентационного проекта библиотеки им. Н.А. Некрасова «Завтра»

     Одним из главных достижений группы генно-инженерных биофармацевтических технологий совместно с опытным биотехнологическим производством ИБХ является разработка и внедрение отечественной технологии производства активной фармацевтический субстанции (АФС) генно-инженерного глюкагона человека (руководитель – акад. А.И. Мирошников). Реализация проекта была осуществлена в 2012-2015 гг. при поддержке Министерства промышленности и торговли Российской Федерации. Получение АФС привело к разработке готовой лекарственной формы глюкагона – «ГЛЮКОРАН» (глюкагон рекомбинантный, человеческий генноинженерный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1 МЕ/мг). Завершение этого проекта позволило подготовить регистрационное досье на производство на базе ОБП ИБХ АФС и лекарственных форм генно-инженерного глюкагона человека.

За время существования группы, под руководством Есипова Романа Станиславовича,  защищено 4 кандидатские и более 25 бакалаврских и магистерских работ.

Фото с защиты кандидатской диссертации Макарова Д.А.

Партнеры:

  • АО «Р-Фарм»
  • Проф. И.П. Куранова – зав. лаборатории кристаллографии белков Институт кристаллографии им. Шубникова РАН
  • К.б.н. С.П. Домогатский – рук. группа инженерной иммунологии ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздрав РФ Институт экспериментальной кардиологии
  • Проф. В.С. Акопян – зав. кафедрой офтальмологии Факультет фундаментальной медицины МГУ
  • Проф. М.А.Владимирский – заведующим лаборатории иммунологических исследований и молекулярной диагностики туберкулёза. Научно-исследовательский Институт Физиопульманологии Московской Медицинской Академии им. Сеченова
  • К.б.н. М.Л.Филиппенко – руководитель лаборатории фармакогеномики НИИ Химической биологии и фундаментальной медицины
  • Д.х.н. Ю.С. Скоблов – зав. лаборатории изотопных методов анализа Институт биоорганической химии им. Академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН
  • Проф. С.Н.Михайлов – зав. лаборатории химии нуклеозидов Институт Молекулярной биологии им. Энгельгардта РАН
  • «Научный центр «Сигнал»» (ФГУП НЦ Сигнал)
  • «Научно-исследовательский институт прикладной акустики» (ФГУП НИИПА)

 

 

Генная инженерия и биоорганическая химия:

  1. Создание высокоэффективных штаммов-продуцентов белков, в том числе и ферментов, представляющих интерес, как для медицинской практики, так и для прикладного использования в биотехнологии и белковой инженерии.
  2. Разработка методов получения рекомбинантных белков и пептидов, том числе и с использованием процесса белкового сплайсинга, их пост-трансляционная модификация in vivo и in vitro.
  3. Химические и ферментативные модификации белков, в том числе и пост-трансляционные, изменяющие свойства целевых продуктов.
  4. Кристаллизация ферментов и создание рентгеноструктурных моделей белков. Изучение активного центра ферментов.
  5. Создание препаратов на основе белков и ДНК, ответственных за регенерацию тканей

Промышленная биотехнология:

Создание лабораторных и опытно-промышленных регламентов на производство субстанций рекомбинантных белков (пептидов), в том числе медицинского назначения, решение проблем масштабирования процессов ферментации, выделения и очистки.

 

Препараты медицинского назначения:

  • Разработан биотехнологический подход получения ряда активных фармацевтических субстанций рекомбинантных полипептидов на основе гибридных белков, содержащих тиоредоксин А, целевой полипептид и сайт расщепления гибридного белка TEV протеиназой.
  • Разработан интеин-опосредованный биотехнологический подход получения ряда активных фармацевтических субстанций рекомбинантных полипептидов на основе гибридного белка, содержащего элементы белкового сплайсинга и не требующего применения специфических протеаз.
  • Разработан биотехнологический способ получения рекомбинантных тимозина α1 и тимозина β4 человека, исключающий стадию химического ацетилирования пептида.
  • С использованием разработанных технологических подходов созданы опытно-промышленные технологии получения активных фармацевтических субстанций следующих рекомбинантных полипептидов: тимозин α1, тимозин β4 (Тиморан), глюкагон (Глюкоран), тумстатин (Тумастин), аналоги гирудина (Лепирудин и Дезирудин), эндостатин, сиалированный оксинтомодулин (Оксилонг), модифицированный фрагмент фактора дифференцировки пигментного эпителия (Пигостин), эпидермальный фактор роста, окситоцин, анальгетик АРНС-3 (Пептальгин), анальгетик РТ-1 (Пунальгин).
  • На основе АФС созданы лекарственные средства: «Глюкоран», «Оксилонг», «Пигостин», «Пептальгин», «Тиморан», «Пунальгин».

 

Пример активной фармацевтической субстанции, полученной для проведения доклинических испытаний.

  • Для всех созданных технологий разработаны методы технологического контроля и анализа конечного продукта, включая тестирование биологической активности.
  • Разработана технологическая документация (опытно-промышленные технологические регламенты).
  • Доказана высокая специфическая биологическая активность на клеточных и животных моделях препаратов «Тиморан», «Глюкоран», «Оксилонг», «Пигостин», «Тумстатин», «Лепирудин», «Дезирудин», «Пептальгин» и «Пунальгин».
  • Разработаны лабораторные регламенты получения серии цитокинов, в том числе и в пегилированной форме: интерлейкина 2, интерлейкина 3, инетрлейкин 4, интерлейкина 15, интерлейкин 18, интерферона альфа-2а, интерферона альфа-2в.

Противотуберкулезная тематика:

  1. Получены штамм-продуценты таргетных ферментов Mycobacterium tuberculosis, жизненно важных для деятельности микобактерии и разработаны методы очистки этих ферментов:
  • кислая фосфатаза
  • фосфопантетеин-аденилилтрансфераза
  • Ser/Thr-специфичная протеинкиназа
  • имидазол-глицерол-фосфатдегидратаза
  • аспартат аминотрасфераза AspC
  • кетол-кислотная редуктоизомераза

2. Методом встречной диффузии в капиллярах получены кристаллы микобактериальной фосфопантетеин-аденилилтрансферазы комплексе с субстратами – АТФ, коэнзимомА и с дефосфокоэнзимомА.

kristally_fosfopantetein-adenililtransfe

Кристаллы фосфопантетеин-аденилилтрансферазы M.tuberculosis

3. Методом рентгеноструктурного анализа решена кристаллическая структура микобактериальной фосфопантетеин-аденилилтрансферазы комплексе с субстратами:

-фосфопантетеин-аденилилтрансферазы Mycobacterium Tuberculosis с АТФ

-фосфопантетеин-аденилилтрансферазы Mycobacterium Tuberculosis с коэнзимом А

- фосфопантетеин-аденилилтрансферазы Mycobacterium Tuberculosis с DPCoA

 

4. Создан штамм-продуцент белков культурального фильтрата микобактерий туберкулеза, в семейство которых входит секреторные антигены ESAT-6 и CFP10. Разработаны методы выделения гибридного белка cfp10-esat6.

 

Антитромбиновая тематика (антикоагулянты):

  1. Разработан интеин-опосредованный биотехнологический подход получения рекомбинантных аналогов ряда высокоспецифичных прямых ингибиторов тромбина из кровососущих организмов: аналогов гирудина из медицинской пиявки H. medicinalis, анофелина из малярийного комара Anopheles albimanus, гемадина из Haemadipsa sylvestris и вариегина из тропического клеща Amblyomma variegatum, не требующий применения специфических протеаз.
  2. Проведено комплексное исследование антитромботической активности рекомбинантных антикоагулянтов, включающее: определение антитромботической активности in vitro с помощью амидолитического теста; влияние препаратов на изменение времен свертывания плазмы крови человека (тромбинового, протромбинового и активированного частичного тромбопластинового времен); установлены фармакодинамические эффекты при внутривенном введении мышам линии CD-1. Для исследования специфической антитромботической активности in vivo были использованы модели хвостового кровотечения и венозного тромбоза на фоне гиперкоагуляции на крысах Sprague Dawley. В качестве препаратов сравнения использовали рекомбинантный гирудин-1 (дезирудин), нефракционированный гепарин и дабигатрана этексилат (Pradaxa, Boehringer Ingelheim, Германия).

Ферменты нуклеинового обмена:

  1.  Получены штаммы-продуценты пуриннуклеозид фосфорилазы T.thermophiles, фосфорибозилпирофосфат синтетазы II T.thermophiles, аденинфосфорибозилтрансферазы T.thermophiles, рибокиназы T.sp., рибомутазы T.thermophiles, гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы T.thermophiles, пуриннуклеотид фосфорилазы E.coli, фосфорибозилпирофосфат синтетазы E.coli, тимидин фосфорилазы E.coli, уридин фосфорилазы E.coli, уридин фосфорилазы Salmonella typhimurium, аденозин дезаминазы E.coli, рибокиназы и рибомутазы E.coli.

  2.  Разработаны эффективные методы наработки ферментов нуклеинового обмена в промышленных масштабах.

  3. Предложена новая стратегия биосинтеза биологически важных нуклеозидов, которая состоит в мультиферментном каскадном превращении D-пентоз в пуриновые нуклеозиды. Каскадный синтез включает последовательное превращение в «одной колбе» D-пентоз в 5-фосфаты под действием рибокиназы, из которой затем синтезируется 1-фосфат пептоза под действием рибомутазы, и затем конденсация последних с гетероциклическими основаниями в присутствии пуриновых и пиримидиновых нуклеозид фосфорилаз дает желаемые нуклеозиды.

4.   Предложена новая стратегия биосинтеза биологически важных нуклеотидов, которая состоит в мультиферментном каскадном превращении D-пентоз в пуриновые нуклеотиды. Каскадный синтез включает последовательное превращение в «одной колбе» D-пентоз в 5-фосфаты под действием рибокиназы, из которых затем синтезируются 5-фосфо-α-D-пентофуранозо-1-пирофосфаты под действием фосфорибозилпирофосфатсинтетазы (PRPP-cинтетазы), конденсация последних с гетероциклическими пуриновыми основаниям в присутствии аденинфосфорибозилтрансферазы (APR-трансферазы) дает желаемые нуклеотиды.

kaskad.jpg

5. Методом встречной диффузии в капиллярах получены кристаллы рибокиназы E.coli и T.thermophiles, PRPP-cинтетазы и APR-трансферазы E.coli и T.thermophiles, пуриннуклеозид фосфорилазы E.coli и T.thermophiles, тимидинфосфорилазы E.coli в том числе и с ингибиторами и субстратами

 

Kristall_fosforibozil-pirofosfatsintetaz

Кристалл фосфорибозил-пирофосфатсинтетазы из Thermus thermophilus HB27.

Kristall_purinnukleozid_fosforilazy_E.co

Кристалл пуриннуклеозидфосфорилазы E.coli.

4. Определены субстратные свойства целого ряда ферментов нуклеинового обмена.

5. Методом рентгеноструктурного анализа решены кристаллические структуры следующих ферментов, в том с ингибиторами и субстратами:

  • рибокиназы из T.sp.
  • аденинфосфорибозил транферазы T.thermophiles
  • фосфорибозилпирофосфат синтетазы II из T.thermophiles

  • пуриннуклеотид фосфорилазы E.coli

  • пуриннуклеотид фосфорилазы E.coli с 7-деаза-гипоксантином

  • пуриннуклеотид фосфорилазы E.coli с ациклогуанозином

 

  • Фосфорибозилпирофосфат синтетазы E.coli

  • Тимидин фосфорилазы E.coli

  • Тимидин фосфорилазы E.coli с 3’-азидо-3’-3’-дезокситимидином

  • Тимидин фосфорилазы из E.coli with 3'-азидо-2'-фтор-дидезоксиуридином.

 

 

 

Патенты:

1. Есипов Р.С., Макаров Д. А., Степаненко В. Н., Андреев Я. А., Козлов С. А., Гришин Е. В. Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-APHC3, кодирующая гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием APHC3, штамм Eschrichia coli C3030/pER-АРНС3 продуцент указанных белков и способ получения рекомбинантного APHC3. Патент РФ № 2619170 от 18.09.2015.

2. Есипов Р.С., Макаров Д.А., Степаненко В.Н., Мирошников А.И. Ковалентный моноконьюгат капроновой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения. Патент РФ № 2604686 от 23.11.2015.

3. Есипов Р.С., Макаров Д.А., Степаненко В.Н., Мирошников А.И. Ковалентный моноконъюгат полисиаловой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения. Патент РФ № 2605385 от 23.11.2015.

4. Есипов Р.С., Макаров Д.А., Степаненко В.Н., Мирошников А.И. Ковалентный моноконьюгат полиэтиленгликоля с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения. Патент РФ № 2607527 от 23.11.2015.

5. Есипов Р.С., Степаненко В.Н., Макаров Д.А., Мирошников А.И. Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-TA1GyrA-AcSer, кодирующая сериновую ацетилтрансферазу, способную in vivo ацетилировать N-концевой серин дезацетилтимозина альфа-1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина альфа-1 человека, штамм-продуцент Eschrichia coli C3030/pER-TA1GyrA–AcSer продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина альфа-1 человека. Патент РФ № 2593172 от 07.07.2016.

6. Есипов Р.С., Макаров Д.А., Степаненко В.Н., Мирошников А.И. Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-TB4GyrA-AcSer, кодирующая сериновую ацетилтрансферазу, способную in vivo ацетилировать N-концевой серин дезацетилтимозина бета 4 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина бета 4 человека, штамм-продуцент Eschrichia coli C3030/pER-TB4GyrA–AcSer продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина бета 4 человека. Патент РФ № 2592860 от 07.07.2016.

7. Есипов Р.С., Степаненко В.Н., Василевский А.А., Королькова Ю.В., Гришин Е.В. Способ получения рекомбинантного анальгетического пептида. Патент РФ на изобретение № 2571942 от 27.11.2015.

8. Есипов Р.С., Степаненко В.Н., Бейрахова К.А., Мирошников А.И., Автушенко С.С., Сурков К.Г., Романов В.Д., Генкин Д.Д. Оксинтомодулин человека, его применение. Лекарственный препарат на его основе и способ применения препарата для лечения и профилактики гипергликемии. Патент РФ на изобретение № 2524204 от 27.07.2014

9. Есипов Р.С., Степаненко В.Н., Костромина М.А., Мирошников А.И., Воробьев А.И., Юрьев А.С. Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-Hir, кодирующая гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием [Leu1, Thr2]-63-десульфатогирудина, штамм Escherichia coli ER2566/pER-Hir - продуцент указанного белка и способ получения генно-инженерного [Leu1, Thr2]-63-десульфатогирудина. Патент РФ на изобретение № 2435858 от 10.12.11.

Прикладные работы

Мы осуществляем полный цикл работ в области генной инженерии: синтез гена и его клонирование в выбранный вектор, скрининг трансформантов и проверку экспрессии целевого гена, проводим оптимизацию экспрессии и ферментации, масштабирование стадии ферментации (от 250 мл до 200 л) и выделения (1 мг до 10 грамм). Разрабатываем стандартизованный протокол очистки целевого белка.

Избранные публикации (показать все)

Загружаются...

Есипов Роман Станиславович

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 53, комн. 5607
  • Тел.: +7(495)336-68-33
  • Эл. почта: esipov@ibch.ru

Комплексное исследование рекомбинантных аналогов природных ингибиторов тромбина в качестве потенциальных антитромботических препаратов (2018-11-28)

Внедрение антитромботических препаратов прямого действия, таких как ингибиторы тромбина и фактора Xa, в медицинскую практику при венозных тромбоэмболиях обусловлено высокими рисками побочных эффектов при стандартной терапии препаратами группы гепаринов. Было проведено комплексное исследование антитромботической активности рекомбинантных полипептидов из различных кровососущих организмов, включающее: изучение фармакодинамики препаратов при внутривенном введении мышам линии CD-1, исследование специфической активности in vivo на моделях хвостового кровотечения и венозного тромбоза на фоне гиперкоагуляции на крысах Sprague Dawley. По результатам проведенных исследований показано, что вариегин обладает ярко выраженным антитромботическим действием и является более перспективным объектом для дальнейших исследований по сравнению с гаемадином, гирудином-1 и анофелином.

Разработка способов получения аналогов тимозина-бета 4 в виде коньюгатов с увеличенным временем жизни in vivo (2017-11-28)

Разработан способ получения моноконъюгатов рекомбинантного тимозин-бета 4 (Тβ4) человека с капроновой кислотой, полисиаловой кислотой 14 кДа и полиэтиленгликолем 10 кДа. В результате многофакторных экспериментов были определены компоненты реакционной смеси и оптимизированы условия проведения данных реакций. Для каждого из аналогов разработана схема одностадийной очистки с помощью ОФ-ВЭЖХ, гарантирующая достижение не менее 98% хроматографической чистоты. Результаты пептидного картирования в совокупности с хромато-масс-спектрометрическим и электрофоретическим методами анализа показали, что полученные аналоги тимозин-бета 4 являются моноконъюгатами, в которых исходный пептид модифицирован по N-концевому серину. Полученные аналоги обладают повышенной устойчивостью к деградации в плазме крови по сравнению с немодифицированным тимозином бета 4 и могут рассматриваться как перспективные кандидаты для дальнейших биологических испытаний.