Лаборатория органического синтеза

Научно-исследовательские подразделения

Руководитель: Формановский Андрей Альфредович, д. х. н.
formanovsky@yandex.ru+7(495)335-39-30

Синтетические методы органической химии, антигены, гаптены, флуоресцентные метки, нетрадиционные аминокислоты, полиазамакроциклы, хромофорные соединения, ионные жидкости, природные низкомолекулярные соединения

Лаборатория проводит молекулярный дизайн, разработку синтетических схем и синтез в препаративных количествах соединений самых разнообразных классов. Например, три- и тетрауглеводных рецепторов тетрасахарида SiaLex , замещенных арилборных кислот различной кислотности, производных индола, 7-гидроксикумарина, пиррол-2,3-дикарбоновой кислоты, ди- и трикарбоновых кислот ряда тиазола, олигоглицинов с фрагментами N-бензилглицина,  фенилдигидронафталинов, 1,2-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты, сложных бициклических производных.

Лаборатория проводит эксперименты по поиску возможных условий абиогенного синтеза аденозина и аденозинмонофосфата, а также работы по изучению свойств, синтеза и возможного использования ионных жидкостей – принципиально нового типа растворителей.

Кроме того, сотрудники занимаются созданием флуоресцентных зондов для ДНК, анестетиков и миорелаксантов нового поколения, а также разрабатывают методы определения наркотических веществ.

Лаборатория сотрудничает с лабораториями Института, Институтом геохимии и аналитической химии имени В.И. Вернадского РАН, Химическим факультетом МГУ, Институтом молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Институтом биохимии им. А.Н. Баха РАН, Российским химико-технологическим университетом имени Д.И. Менделеева и др.

Лаборатория создана на базе Группы органического синтеза (функционирует с 1994 года) в 2010 году.

  • Разработка инновационных методов синтетической органической химии и принципиально новых схем синтезов органических соединений
  • Практическое получение соединений различных классов: бензогетероциклов, арилсульфамидов и арилсульфоновых кислот, полициклических и каркасных соединений, арилборных кислот, продуктов деградации лекарственных веществ, антигенов и гаптенов, флуоресцентных меток, нетрадиционных аминокислот, спин-меченых аминокислот, хромофорных и фотосенсибилизирующих соединений, природных низкомолекулярных соединений.
  • Синтезированы компоненты олигопептидных ингибиторов Plm II протеаз – ω-гидроксизамещенных L-α-аминокислот.
  • Разработан новый препаративный метод синтеза аргиопина, синтезировано 100 г. этого природного токсина. Найденный метод использовался в синтезе аналогов аргиопина.
  • Разработаны эффективные методы синтеза и получен представительный набор замещенных 2-тиазолил-1-алкил(арил)этанолов, перспективных шаблонов для получения новых фармакологических препаратов.
  • Разработаны синтетические схемы и проведен синтез гаптенов, необходимых компонентов в иммуноферментном анализе токсичных компонентов бытовых моющих средств, загрязняющих окружающую среду, современных пестицидов и антибиотиков.
  • Разработаны методы синтеза и получен фотопереключаемый фрагмент белка для создания управляемых элементов вторичной структуры; фотоактивируемые метки для исследования рецепторных систем; флуоресцентные метки для исследования строения и функционирования нуклеиновых кислот; фотосенсибилизирующие реагенты; флуоресцентные индикаторы.
  • В рамках Программ Президиума РАН «Происхождение и эволюция биосферы» проведен анализ с использованием методов компьютерного синтеза вариаций абиогенных условий образования аденина, а также конденсации аденина с рибозой и рибозофосфатом; сформирована библиотека моносахаридов, разработаны методики их определения методами хромато-масс-спектрометрии и ГЖХ.
  • Найден новый подкласс модифицированных нуклеозидов, обладающих высокой активностью в отношении оболочечных вирусов (см. рис. ниже). Cреди обнаруженного нами ранее (Биоорган. химия, 29 (3), 289–294 (2003), Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 24(5/7), 923–926 (2005), Tetrahedron, 62 (6), 1279–1287 (2006), Вопросы вирусологии, 2006 (1), 34–38, Org. Biomol. Chem.,4 (6), 1091–1096 (2006)) класса противовирусных соединений выявлена группа веществ с высокой активностью в отношении оболочечных вирусов. В частности, IC50 5-(перилен-3-ил)этинил-2′-дезоксиуридина составляет 50 нмоль/л для вируса простого герпеса типа 1 и 180 нмоль/л для вируса гепатита C. Характерной особенностью структуры активных нуклеозидов является присутствие остатка пентациклического ароматического углеводорода перилена, жестко присоединенного к нуклеиновому основанию с помощью тройной связи. Высказано предположение, что уникальная структура полученных соединений обусловливает их встраивание в оболочку вириона, в результате чего слияние вириона с клеткой (инфицирование) становится весьма невыгодным процессом. Новые соединения практически не цитотоксичны.

Избранные публикации

  1. Astakhova I.K., SanthoshKumar T., Campbell M.A., Ustinov A.V., Korshun V.A., Wengel J. (2013). Branched DNA nanostructures efficiently stabilised and monitored by novel pyrene-perylene 2'-α-l-amino-LNA FRET pairs. Chem. Commun. (Camb.) 49 (5), 511–3 [+]

    Novel pyrene-perylene α-l-LNA FRET pairs described herein effectively detect assembly of 2- and 3-way branched DNA nanostructures prepared by postsynthetic microwave-assisted CuAAC click chemistry. The fluorescent signalling of assembly by internally positioned FRET pairs is achieved with low to no fluorescence background signal, remarkably low limit of target detection values and stabilization of the resulting nanostructures.

    ID:754
  2. Kavanagh P., Grigoryev A., Savchuk S., Mikhura I., Formanovsky A. (2013). UR-144 in products sold via the Internet: identification of related compounds and characterization of pyrolysis products. Drug Testing and Analysis 5 (8), 683–92 [+]

    The synthetic cannabinoid, UR-144 ((1-pentyl-1H-indol-3-yl)(2,2,3,3-tetramethylcyclopropyl)methanone), was identified in commercial 'legal high' products (herbal, resin, and powder). Along with this, six related compounds were detected. The most abundant one (2.1) was identified as 4-hydroxy-3,3,4-trimethyl-1-(1-pentyl-1H-indol-3-yl)pentan-1-one, a product of the electrophilic addition of water to the cyclopropane moiety in UR-144. Compound 2.1 was found to be undergo cyclisation which leads to the formation of two additional interconvertable compounds (2.3, tentatively identified as 1-pentyl-3-(4,4,5,5-tetramethyl-4,5-dihydrofuran-2-yl)-1H-indole which is stable only in absence of water and also observed as GC artifact) and 2.2, a protonated derivative of 2.3 which is formed in acidic solutions. The remaining compounds were identified as possible degradation products of the group 2 compounds (4,4,5,5-tetramethyldihydrofuran-2(3H)-one and 1-pentylindoline-2,3-dione) and intermediates or by-products from the synthesis of UR-144 ((1H-indol-3-yl)(2,2,3,3-tetramethylcyclopropyl)methanone, 1-pentyl-1H-indole and 1-(1-pentyl-1H-indol-3-yl)hexan-1-one). Pyrolysis of herbal products containing the group 2 compounds or UR-144 resulted in the formation of 3,3,4-trimethyl-1-(1-pentyl-1H-indol-3-yl)pent-4-en-1-one (3). This was confirmed by separate pyrolysis of 2.1 and UR-144. Also, the two additional minor compounds, 1-(1-pentyl-1H-indol-3-yl)ethanone and 1-(1-pentyl-1H-indol-3-yl)propan-1-one, were detected. Pathways for these transformations are presented.

    ID:1058
  3. Colpitts C.C., Ustinov A.V., Epand R.F., Epand R.M., Korshun V.A., Schang L.M. (2013). 5-(Perylen-3-yl)ethynyl-arabino-uridine (aUY11), an arabino-based rigid amphipathic fusion inhibitor, targets virion envelope lipids to inhibit fusion of influenza virus, hepatitis C virus, and other enveloped viruses. J. Virol. 87 (7), 3640–54 [+]

    Entry of enveloped viruses requires fusion of viral and cellular membranes. Fusion requires the formation of an intermediate stalk structure, in which only the outer leaflets are fused. The stalk structure, in turn, requires the lipid bilayer of the envelope to bend into negative curvature. This process is inhibited by enrichment in the outer leaflet of lipids with larger polar headgroups, which favor positive curvature. Accordingly, phospholipids with such shape inhibit viral fusion. We previously identified a compound, 5-(perylen-3-yl)ethynyl-2'-deoxy-uridine (dUY11), with overall shape and amphipathicity similar to those of these phospholipids. dUY11 inhibited the formation of the negative curvature necessary for stalk formation and the fusion of a model enveloped virus, vesicular stomatitis virus (VSV). We proposed that dUY11 acted by biophysical mechanisms as a result of its shape and amphipathicity. To test this model, we have now characterized the mechanisms against influenza virus and HCV of 5-(perylen-3-yl)ethynyl-arabino-uridine (aUY11), which has shape and amphipathicity similar to those of dUY11 but contains an arabino-nucleoside. aUY11 interacted with envelope lipids to inhibit the infectivity of influenza virus, hepatitis C virus (HCV), herpes simplex virus 1 and 2 (HSV-1/2), and other enveloped viruses. It specifically inhibited the fusion of influenza virus, HCV, VSV, and even protein-free liposomes to cells. Furthermore, aUY11 inhibited the formation of negative curvature in model lipid bilayers. In summary, the arabino-derived aUY11 and the deoxy-derived dUY11 act by the same antiviral mechanisms against several enveloped but otherwise unrelated viruses. Therefore, chemically unrelated compounds of appropriate shape and amphipathicity target virion envelope lipids to inhibit formation of the negative curvature required for fusion, inhibiting infectivity by biophysical, not biochemical, mechanisms.

    ID:852
  4. Osterman I.A., Ustinov A.V., Evdokimov D.V., Korshun V.A., Sergiev P.V., Serebryakova M.V., Demina I.A., Galyamina M.A., Govorun V.M., Dontsova O.A. (2013). A nascent proteome study combining click chemistry with 2DE. Proteomics 13 (1), 17–21 [+]

    To investigate the dynamic cellular response to a condition change, selective labeling of the nascent proteome is necessary. Here, we report a method combining click chemistry protein labeling with 2D DIGE. To test the relevance of the method, we compared nascent proteomes of actively growing bacterial cells with that of cells exposed to protein synthesis inhibitor, erythromycin. Cells were incubated with methionine analog, homopropargyl glycin, and their nascent proteome was selectively labeled with monosulfonated neutral Cy3 and Cy5 azides specially synthesized for this purpose. Following fluorescent labeling, the protein samples were mixed and subjected to standard 2D DIGE separation. The method allowed us to reveal a dramatic reduction of newly synthesized proteins upon erythromycin treatment, while the total proteome was not significantly affected. Additionally, several proteins, whose synthesis was resistant to erythromycin, were identified.

    ID:1063
  5. Korchagina E., Tuzikov A., Formanovsky A., Popova I., Henry S., Bovin N. (2012). Toward creating cell membrane glyco-landscapes with glycan lipid constructs. Carbohydr. Res. 356, 238–46 [+]

    Synthetic glycolipid-like constructs dispersible in biological media and capable of incorporating into cell membranes have the ability to create novel artificial glyco-landscapes on living cells. Using a variety of different glycans ranging from disaccharides to polysaccharides, together with different lengths and high hydrophilicity spacers, we created a series of synthetic glycolipid-like constructs. Contacting these constructs with live cells gave modified cells with controlled glycan density and/or altered biological function. The ability to also use these constructs as solutions to inhibit antibodies, toxins, and virions extends the potential diagnostic and therapeutic uses for these synthetic glycolipid-like constructs.

    ID:1059
  6. Ryazantsev D.Y., Tsybulsky D.A., Prokhorenko I.A., Kvach M.V., Martynenko Y.V., Philipchenko P.M., Shmanai V.V., Korshun V.A., Zavriev S.K. (2012). Two-dye and one- or two-quencher DNA probes for real-time PCR assay: synthesis and comparison with a TaqMan™ probe. Analytical and bioanalytical chemistry 404 (1), 59–68 [+]

    A typical TaqMan™ real-time PCR probe contains a 5'-fluorescent dye and a 3'-quencher. In the course of the amplification, the probe is degraded starting from the 5'-end, thus releasing fluorescent dye. Some fluorophores (including fluorescein) are known to be prone to self-quenching when located near each other. This work is aimed at studying dye-dye and dye-quencher interactions in multiply modified DNA probes. Twenty-one fluorogenic probes containing one and two fluoresceins (FAM), or a FAM-JOE pair, and one or two BHQ1 quenchers were synthesized using non-nucleoside reagents and "click chemistry" post-modification on solid phase and in solution. The probes were tested in real-time PCR using an ~300-bp-long natural DNA fragment as a template. The structural prerequisites for lowering the probe background fluorescence and increasing the end-plateau fluorescence intensity were evaluated and discussed.

    ID:753
  7. Astakhova I.V., Ustinov A.V., Korshun V.A., Wengel J. (2011). LNA for optimization of fluorescent oligonucleotide probes: improved spectral properties and target binding. Bioconjug. Chem. 22 (4), 533–9 [+]

    Mixmer LNA/DNA fluorescent probes containing the 1-(phenylethynyl)pyrene fluorophore attached to 2'-arabino-uridine were synthesized and studied. The conjugates displayed significantly higher hybridization affinity to target DNA, increased fluorescence quantum yields of single-stranded oligonucleotides and their duplexes, and improved ability to form an interstrand excimer compared to analogous non-LNA probes.

    ID:755
  8. Smorodin E.P., Kurtenkov O.A., Sergeyev B.L., Branovets J.S., Izotova J.G., Formanovsky A.A. (2011). Specificity of serum anti-A(di) IgG antibodies from patients with gastrointestinal cancer. J Immunoassay Immunochem 32 (3), 170–90 [+]

    Changes in the glycosylation in cancer may lead to an aberrant expression of A, B incompatible or xenogeneic blood group related antigens. To characterize the specificity of IgG antibodies to A, B, and related glycans in sera of gastrointestinal cancer patients, serum probes and affinity-isolated antibodies were analyzed in the indirect and competitive ELISA using a set of homogenous polyacrylamide (PAA) glycoconjugates. Monoreactive antibodies recognizing A(di) (I) and cross-reactive antibodies to A(di)/B(di)/B(tri) (II) or A(di)/A(tri)/Fs(di)/Core5 (III) were affinity-isolated on A(di)-PAA-Sepharose. The population I showed a higher affinity to A(di)-PAA than cross-reactive antibodies. The antibodies II were more specific to B(di) and may belong to the core alpha-Gal reactive antibodies but are also capable of recognizing A(di). The antibodies III were more specific to A(tri); they agglutinated A-erythrocytes and belong to anti-A isoantibodies reactive to xenogeneic oligosaccharides. The purified antibody samples were non- or faintly reactive to Tn. The IC(50) values of PAA glycoconjugates ranged from 6 × 10(-8) to 7 × 10(-6) M. No or weak binding of antibodies to the unrelated antigens used in the detection of polyreactivity (ferritin, casein, and DNA) was observed.

    ID:1060
  9. StVincent M.R., Colpitts C.C., Ustinov A.V., Muqadas M., Joyce M.A., Barsby N.L., Epand R.F., Epand R.M., Khramyshev S.A., Valueva O.A., Korshun V.A., Tyrrell D.L., Schang L.M. (2010). Rigid amphipathic fusion inhibitors, small molecule antiviral compounds against enveloped viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (40), 17339–44 [+]

    Antiviral drugs targeting viral proteins often result in prompt selection for resistance. Moreover, the number of viral targets is limited. Novel antiviral targets are therefore needed. The unique characteristics of fusion between virion envelopes and cell membranes may provide such targets. Like all fusing bilayers, viral envelopes locally adopt hourglass-shaped stalks during the initial stages of fusion, a process that requires local negative membrane curvature. Unlike cellular vesicles, however, viral envelopes do not redistribute lipids between leaflets, can only use the energy released by virion proteins, and fuse to the extracellular leaflets of cell membranes. Enrichment in phospholipids with hydrophilic heads larger than their hydrophobic tails in the convex outer leaflet of vesicles favors positive curvature, therefore increasing the activation energy barrier for fusion. Such phospholipids can increase the activation barrier beyond the energy provided by virion proteins, thereby inhibiting viral fusion. However, phospholipids are not pharmacologically useful. We show here that a family of synthetic rigid amphiphiles of shape similar to such phospholipids, RAFIs (rigid amphipathic fusion inhibitors), inhibit the infectivity of several otherwise unrelated enveloped viruses, including hepatitis C and HSV-1 and -2 (lowest apparent IC(50) 48 nM), with no cytotoxic or cytostatic effects (selectivity index > 3,000) by inhibiting the increased negative curvature required for the initial stages of fusion.

    ID:757
  10. Михура В., Формановский А., Шашков С. (2010). Строение 2(5)-алкилзамещенных 4-гидрокси-3,4-дифенилциклопент-2-ен-1-онов. Журнал органической химии. 46 (8), 1118–1122 ID:1061
  11. Prokhorenko I.A., Astakhova I.V., Momynaliev K.T., Zatsepin T.S., Korshun V.A. (2009). Phenylethynylpyrene excimer forming hybridization probes for fluorescence SNP detection. Methods Mol. Biol. 578, 209–22 [+]

    Excimer formation is a unique feature of some fluorescent dyes (e.g., pyrene) which can be used for probing the proximity of biomolecules. Pyrene excimer fluorescence has previously been used for homogeneous detection of single nucleotide polymorphism (SNP) on DNA. 1-Phenylethynylpyrene (1-1-PEPy), a photostable pyrene derivative with redshifted fluorescence, is able to form excimers (emission maximum about 500-510 nm) and is well suitable for nucleic acid labeling. We have shown the utility of 1-1-PEPy in the excimer-forming DNA probes for detection of 2144A/G and 2143A/G transitions, and 2143A/C substitution in the 23S ribosomal RNA gene of Helicobacter pylori strains resistant to clarithromycin. The phenylethynylpyrene pair can be generated either from 1-1-PEPy pseudonucleoside 4-[4-(pyren-1-ylethynyl)phenyl]-1,3-butanediol or from 2'-O-(1-PEPy) modified nucleosides--2'-O-[3-(pyren-1-ylethynyl)benzyl]uridine and 2'-O-[4-(pyren-1-ylethynyl)benzyl]uridine.

    ID:759
  12. Liakina A.Y.u., Formanovsky A.A., Popova I.S., Mikhura I.V. (2005). Use of metallation reaction to obtain substituted 2-(5-methyl-2-thiazolyl)ethanols. Chemistry of Heterocyclic compounds 41 (7), 877–882 [+]

    В публикации рассказывается о замещенных 2-тиазолил-1-этанолах, полученных взаимодействием анионов, генерируемых при обработке бутиллитием 2,4,5-триметилтиазола и 2,5-диметил-4-фенилтиазола, с алифатическими и ароматическими альдегидами. Установлено, что реакция металлирования проходит по 2-метильной группе тиазолов.

    ID:46
  13. Popova I.S., Formanovsky A.A., Mikhura I.V. (2002). Synthesis of 2- and 3-pyridinyl(aryl)methanones. Russ. Chem.Bull. Int.Ed. 3, 540–543 [+]

    В статье предложен метод получения 2- и 3-пиридинил(арил)метанонов взаимодействием ариллития с метиловыми эфирами пиридинкарбоновой и замещенных фенилкарбоновых кислот.

    ID:45
  14. Mikhura I.V., Formanovsky A.A., Bovin N.V. (1999). One-pot scale synthesis of trifluoroacetamidopropyl 2-O-acetyl-4,6-O-benzylidene-beta-D-galactopyranoside. Carb. lett. 3 (5), 305–308 [+]

    В публикации показано, что в зависимости от выбранной схемы и реагентов можно избирательно защищать гидроксильные группы во 2-ом либо 3-ем месте спейсерированного 4,6-О-бензилиден-β-D-галактопиранозида. Во втором случае три стадии реакции проводятся без выделения.

    ID:44
  15. Formanovsky A.A., Mikhura I.V. (1996). One-Stage Monosubstitution in Cyclen — Two Novel Examples. Synthetic Commun. 26 (8), 1595–1603 [+]

    Предложен оригинальный метод избирательного замещения одного из четырех атомов азота в 1,2,3,4-тетраазациклононане. С превосходными выходами синтезированы изомерные 10-трис(гидрокси)бутил-1,4,7-трис(карбоксиметил)циклены.

    ID:43

Формановский Андрей Альфредович

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 34, комн. 325
  • Тел.: +7(495)335-39-30
  • Эл. почта: formanovsky@yandex.ru

Метод дериватизации низкомолекулярных аминов для высокочувствительного определения с помощью ВЭЖХ-МС (2016-11-22)

Синтезированы новые производные трифенилциклопропенилиевого карбокатиона, исследованы их масс-спектрометрические свойства. На их основе синтезирован дериватизирующий реагент, который использовался для детекции летучих аминов с высокой чувствительностью до 30 аттомоль. Используя метод внутреннего стандарта, показана возможость количественного определения аминов в их смесях. В процессе исследования химическихсвойств карбокатиона, показана ранее неописанная перегруппировка трифенилциклопропенилиевого карбокатиона с первичными аминами и анионом дималононитрила.

(2016-03-30)

Цель работы – разработка методик их получения, исследование их свойств и возможностей применения. В процессе работы проводились исследования применимости различных методов для синтеза и модификации биоактивных молекул. В результате работы по теме получены различные типы био- и фотоактивных молекул. Основные конструктивные, технологические и технико-эксплуатационные характеристики: получены соединения с заданными свойствами. Степень внедрения: опубликованы статьи с описанием. Рекомендации по внедрению или итоги внедрения НИР: дальнейшие испытания с целью создания диагностических тест-систем. Область применения: биодиагностика (детекция антигенов и генетического материала). Экономическая эффективность или значимость работы может быть оценена после полномасштабного внедрения. Потенциально весьма высока. Прогнозные предположения о развитии объекта исследования: следует продолжать исследования в данной области, совершенствовать структуру биоактивных молекул и их флуоресцентных производных.  

Ключевые слова: флуоресценция, пептиды, аминогликозидные антибиотики, олигонуклеотиды, налоксон, хиноксикаин, 3-ацилиндолы. Объектом исследования являются биоактивные молекулы и флуоресцентные красители.

ВВЕДЕНИЕ В исследованиях 2015 г решался ряд задач по синтезу различных биологически активных соединений и их производных, флуоресцентных красителей и флуоресцентных биоконъюгатов.  

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

11-Фенилэтинилпирен (PEPy) – новый «голубой» краситель для ПЦР-анализа

Был разработан новый флуоресцентный краситель для «голубого» канала амплификаторов (460±20 нм). Ряд коммерчески-известных красителей для этого канала, такие как 7-аминокумарин и Alexa fluor 350 имеют ряд ограничений, связанных в первую очередь с низким коэффициентом экстинкции и неустойчивостью в условиях деблокирования олигонуклеотидов. Получено азидопроизводное содержащее фенилэтинилпиреновый флуорофор путем медь(I)-катализируемого циклоприсоединения к терминальной тройной связи конъюгировали с олигонуклеотидами. Регистрировались фото-физические характеристики олигонуклеотидов одинаковых последовательностей с фенилэтинилпиреном и 7-аминокумарином. Квантовые выходы флуоресценции лежали в одном диапазоне 40-50 % в среднем, при том, что коэффициент экстикции для нашего красителя оказался почти в 3 раза выше чем у аминокумарина (45000 против 19000). Наблюдается значительно более слабое тушение флуоресценции для фенилэтинилпирена на олигонуклеотидах с ростом температуры чем у производного кумарина. Также были синтезированы флуоресцентные зонды - TaqMan включающие оба красителя, и протестированы в ПЦР в реальном времени. Т.о. детекция происходит на более ранних циклах ПЦР в случае фенилэтинилпирена при более высоком уровне флуоресценции. Предложенный краситель с лучшими фото-характеристиками может стать важным преимуществом для исследований, использующих мультиканальные приборы с «голубым» видимым диапазоном детекции [1]. 

2.  2-Этинилперилен и усовершенствованный синтез 3-этинилперилена.

3-Этинилперилен, важный предшественник флуоресцентных красителей, флуоресцентных нуклеозидов и перспективных нуклеозидных антивирусных препаратов, был получен в препаративных количествах в три стадии из перилена с общим выходом 55 % . Также был разработан простой метод синтеза неизвестного ранее 2-этинилперилена из перилена, включающий пять стадий и приводящий к целевому продукту с общим выходом 20 % [2].

3. Дериватизация первичных аминов катионом трис(2,6- диметоксифенил)метилия для анализа методом масс-спектрометрии МАЛДИ.

Трис(2,4,6-триметоксифенил)метильный катион способен реагировать с первичными и вторичными аминами по пути нуклеофильного замещения метокси-группы в пара-положении бензольного кольца. Впоследствии эта реакция была применена для дериватизации аминокислот и пептидов в масс-спектрометрии. Интересно, что похожий катион, трис(2,6-диметоксифенил)метильный, реагирует с аминами по-другому: с первичными аминами при комнатной температуре образуется акридиниевый катион. Изучены возможности применения этой реакции для дериватизации первичных аминов с последующим определением продуктов методом МАЛДИ-МС. Предложенный способ дериватизации аминов трис(2,6-диметоксифенил)метилий катионом с последующей регистрацией масс-спектров МАЛДИ является удобным, быстрым и чувствительным методом анализа первичных аминов различной природы. Реакция дериватизации проходит при комнатной температуре, не требует специальной обработки и выделения продуктов, может протекать в различных средах. Метод позволяет не только выводить сигналы аналитов из области матричных шумов, но и увеличивать способность вещества к ионизации, и, следовательно, снижать порог обнаружения целевых соединений методом МАЛДИ-МС, а также дает возможность анализа продуктов дериватизации методом ЛДИ. Реакция катиона 1 с аминами протекает при комнатной температуре в течение нескольких минут. В модельных условиях (в присутствии избытка амина) степень превращения катиона 1 в Q+ (т.е. скорость реакции) контролируется визуально по изменению цвета реакционной смеси от фиолетового к красному. Для дериватизации аминов в малых концентрациях, наоборот, используют избыток катиона 1. Достоинством предлагаемого метода является и то, что легкое протекание реакции позволяет проводить дериватизацию как в водных (в случае аминокислот и их производных), так и в неводных растворах [3].

4 Дериватизация аминогликозидных антибиотиков трис(2,6- диметоксифенил)метилием.

Детекция аминогликозидных антибиотиков как методами масс-спектрометрии, так и высокоэффективной жидкостной хроматографии, представляет собой серьезную проблему, поскольку а) углеводная природа молекул снижает их способность к ионизации по сравнению с другими органическими молекулами, особенно в методе МАЛДИ-МС; б) отсутствие в молекулах ароматических фрагментов и амидных связей делает невозможным применение обычных УФ-детекторов в ВЭЖХ. Разработанный нами ранее подход для дериватизации аминов с использованием трис(диметоксифенил)метилиевых солей успешно применен для селективной модификации аминогликозидных антибиотиков. Модификация происходит по аминогруппе при первичном атоме углерода; присоединяемый остаток имеет ароматическую природу и несет перманентный положительный заряд, что позволяет легко детектировать аминогликозидные антибиотики методами масс-спектрометрии и обращенно-фазовой ВЭЖХ, как в индивидуальном виде, так и в смесях. Для исследования возможности дериватизации аминогликозидных антибиотиков нами были выбраны следующие препараты: канамицин, сисомин, паромомицин, тобрамицин.  Была изучена дериватизация простейшего аминоуглевода, аминоглюцитола, который в свободном виде невозможно определить методом масс-спектрометрии МАЛДИ из-за небольшой молекулярной массы (181 Да) и затрудненной ионизуемости молекулы. Контролируя исчезновение пятна исходного аминоспирта при действии на него избытка дериватизирующего агента, методом ТСХ было установлено, что реакция проходит за 30 минут при комнатной температуре, и в спектре МАЛДИ-МС виден четкий сигнал, соответствующий ожидаемой массе конъюгата (см. рисунок). Таким образом, был разработан качественный метод детекции дериватизированных неотщепляемой масс-спектрометрической меткой аминогликозидных антибиотиков с помощью масс-спектрометрии и ВЭЖХ. Предложенный метод дериватизации аминосодержащих углеводов позволяет детектировать их с помощью масс-спектрометрии МАЛДИ и ОФ-ВЭЖХ с УФ-детектором. Показано, что модификация идет по аминогруппе, связанной с первичным атомом углерода. Дериватизация позволяет увеличить чувствительность масс-спектрометрической детекции аминогликозидов на несколько порядков. Преимуществами метода являются экспрессность, экспериментальная простота и доступность реагентов [4].

5. Синтез светочувствительных соединений с заданным комплексом физико-химических и фото-физических свойств.

Данная научно-исследовательская работа предпринята с целью разработки удобных методов синтеза новых высокоплавких органических соединений, удовлетворяющих ряду требований, в частности обратимой или необратимой фотоизомеризации под воздействием ближнего УФ-излучения (~ 360 нм). В настоящей работе мы предлагаем новый метод синтеза соединений, обладающих необходимым набором свойств. На основе реакции конденсации ангидрида дикарбоновой кислоты с разнообразными ароматическими аминами. Данная реакция представляет собой двухстадийный процесс, в котором на первой стадии происходит раскрытие ангидридного цикла с образованием соотвествующей амидокислоты, а на второй стадии циклизация амидокислоты в циклический имид. Нами разработаны оптимальные условия проведения обеих стадий без проведения промежуточной амидокислоты. Выходы циклических имидов достигают обычно 90 %. В ходе работы были разработаны методы синтеза и синтезированы в препаративных количествах 40 ранее неописанных спироциклических гетороциклических соединений.

6. Установление строения экзогенного вещества с молекулярной массой 238 а. е. м. в биообъекте.

Цель данной работы – установление строения неизвестного соединения, обнаруженного в останках эксгумированного трупа. Малое количество обнаруженного вещества позволило провести анализ только лишь масс-спектрометрическим и газохроматографическим методами. Для этого вещества известны масс-спектр, время удерживания, молекулярная масса и брутто-формула, однако такому набору экспериментальных данных не соответствует ни одно вещество ни в одной из масс-спектрометрических библиотек. Результаты идентификации по библиотечному поиску показали, что спектр этого вещества отсутствует в масс-спектрометрических библиотеках PMW2011, NIST 2011, W8N9, а также в целевых библиотеках на наркотические и сильнодействующие вещества.C помощью Web-библиотеки СhemSpider было установлено, что веществу с брутто-формулой С13Н22N2O2 и моноизотопной массой m/z = 238,1675 а. е. м. соответствуют 1171 структурные формулы. Окончательное заключение о структуре вещества, его физико-химических и биологических свойствах можно сделать только после проведения встречного синтеза и сравнения полученных данных масс-спектрометрии и газовой хроматографии с данными неизвестного вещества. Для синтеза было выбрано шесть вероятных кандидатур. Синтез первого из них - 6-метил-1-октил-2,4(1Н,3Н)-пиримидиндиона - был проведен из легкодоступных предшественников в две стадии: последовательной обработкой малоновой кислоты уксусным ангтидридом и тиоцианатом калия с получением 5-ацетил-4-гидрокси-2Н-1,3-тиазин-2,6(3Н)-диона (Предложенный метод позволяет получить с хорошим выходом урацилы, не содержащие примеси 3-замещенных изомеров, в отличие от ряда других существующих методов). После чего полученный тиазиндион кипятили с октиламином в ДМФА. Общий выход целевого соединения составил 25 %. Синтез второго кандидата - 2,6-бис[(диметиламино)метил]-4-метоксифенола - проводили в соответствии с разработанной схемой. Общий выход конечного соединения составил 45 %. Три изомерных N'-(диметоксибензил)-N,N-диметилэтан-1,2-диамина получали из соответственно замещенных бензальдегидов, которые были превращены в имины взаимодействием с алкиламинами в этаноле и последующим восстановлением оснований Шиффа борогидридом натрия. Выход целевых продуктов составил: ― N'-(2,3-диметоксибензил)-N,N-диметилэтан-1,2-диамин – 71%, ― N'-(2,4-диметоксибензил)-N,N-диметилэтан-1,2-диамин – 69%, ― N'-(3,4-диметоксибензил)-N,N-диметилэтан-1,2-диамин – 84%. а Аналогично был получен 2-({[3-диметиламино)пропил]амино}метил)-6-метоксифенол с выходом 78%: Структуры и чистота всех полученных соединений доказаны методами тонкослойной хроматографии, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. К сожалению, все синтезированные соединения по спектральным и хроматографическим параметрам не соответствовали выделенному из биологического объекта экзогенному веществу с молекулярной массой 238 а. е. м.

7. Липофильные производные налоксона.

В настоящее время существуют два лекарственных препарата, используемых для лечения наркоманий (прежде всего, морфийной и героиновой зависимостей) — налоксон и налотрексон. Кратковременность действия налоксона ограничивает возможность его применения для терапии наркоманий, поэтому возникает острая необходимость создания пролонгированных форм таких препаратов. Для решения этой задачи были предприняты а) синтез серии сложных эфиров жирных кислот налоксона, обладающих липофильными свойствами, и б) поиск условий растворимости этих эфиров налоксона с получением маслорастворимых лекарственных форм. Налоксон содержит в своей структуре бензольное кольцо с фенольной гидроксильной группой в третьем положении, которая легко может быть проэтерифицирована с образованием сложного эфира. В качестве ацилирущий агентов мы выбрали следующие соединения: хлорангидриды метиладипината, метилсукцината, миристиновой и стеариновой кислот. Также были синтезированы эфиры налоксона с биологически активными кислотами, которые в ходе метаболизма в организме человека могут распадаться до налоксона и кислоты, обладающей физиологической активностью. В качестве таких кислот были выбраны липоевая (тиоктовая) кислота и 6–(ацетиламино)капроновая кислота.  Выходы полученных сложных эфиров составили 60-91%. Строение и чистота полученных соединений подтверждены методами тонкослойной хроматографии и ЯМР-спектроскопии. Для решения проблемы, возникшей при отнесении сигналов в протонном спектре налоксона, были сняты спектры COSY. С этой же целью (отнесение сигналов в протонном спектре) был снят спектр 13С–ЯМР спектр и проведен эксперимент HMQC.

Для решения второй задачи необходимо было выбрать ряд липофильных растворителей. В качестве растворителей мы использовали метилолеат, этилолеат, изопропилмеристат, смеси вышеупомянутых растворителей с сульфоланом (до 30% по объему), рафинированное подсолнечное масло, рафинированное кукурузное масло, рафинированное рапсовое масло, амарантовое масло. Практически во всех растворителях полученные эфиры при нагревании растворяются полностью, но при охлаждении растворов до комнатной температуры часть растворенного вещества выпадает в виде масла. Таким образом, приготовить раствор требуемой 20%–ной концентрации не удалось.

8. Синтез хиноксикаина и его аналогов.

Были начаты работы по разработке метода синтеза хиноксикаина (гидрохлорида диэтиламиноэтиламида 4-гидрокси-2-оксо-1-пропил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты) – нового препарата, обладающего ярко выраженным местноанестетическим действием. Его химические модификации не оказывают токсического действия, он обладает такими полезными свойствами, как, например, высокая специфичность, отсутствие нефротоксичности и сосудосуживающего действия, что говорит о широких перспективах применения данного препарата в хирургии. Был отработан метод синтеза метилового эфира пропилантраниловой кислоты (выход - 98%). Получение метилового эфира N-пропилантраниловой кислоты проводили восстановительным аминированием в системе Zn/AcOH. Синтез диэтиламиноэтиламида 4-гидрокси-2-оксо-1-пропил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты из метилового эфира N-пропилантраниловой кислоты проводили по разработанной схеме. Общий выход составил 80,8%. Строение и чистота полученного диэтиламиноэтиламида 4-гидрокси-2-оксо-1-пропил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты доказаны методом тонкослойной хроматографии и 1H-ЯМР-спектроскопии. Кроме того, с выходами 51-90% были получены соли диэтиламиноэтиламида 4-гидрокси-2-оксо-1-пропил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты - гидрохлорид (собственно хиноксикаин), метансульфонат и L-тартрат. Для разработки препаративного метода синтеза химического аналога хиноксикаина – хиназолона - были исследованы три синтетические схемы: а) взаимодействие метилового эфира антраниловой кислоты с метилхлорформиатом с последующим алкилированием полученного метил-2-(метоксикарбонил)бензоата изобутилбромидом и конденсацией продукта с N,N-диэтиламиноэтиламином; б) взаимодействие метилового эфира с метилхлорформиатом с последующей конденсацией метил-2-(метоксикарбонил)бензоата с N,N-диэтиламиноэтиламином и алкилированием изобутилбромидом; в) восстановительное аминирование метилового эфира антраниловой кислоты 2-метилпропаналем с последующей реакцией с метилхлорформиатом и конденсацией полученного продукта с N,N-диэтиламиноэтиламидом. Ни одна из них не привела к желаемому результату. Поэтому была разработана еще одна схема синтеза хиназолона со следующей последовательностью реакций: восстановительное аминирование метилового эфира антраниловой кислоты с последующим получением N-изобутилизатового ангидрида взаимодействием с фосгеном, из которого реакцией с N,N-диэтиламиноэтиламидом может быть получен антраниламид, который, в свою очередь, конденсируясь с метилхлорформиатом должен дать целевой продукт.

9. Синтез N-алкилированных 3-ацилиндолов.

9.1. Производные N-этиламида 3-индолкарбоновой кислоты. Для разработки методов инструментального и иммунохимического анализа запрещенных 1-замещенных амидов индол-3-карбоновой кислоты были синтезированы 1-этил- и 1-(3-карбоксипропил)-N-этиламиды индол-3-карбоновой кислоты, представляющие собой разрешенные производные 3-ацилиндола. Прямой способ получения N-этиламида индол-3-карбоновой кислоты (из метилового эфира соответствующей кислоты) не увенчался успехом, поэтому был выбран трехстадийный путь, включавший омыление сложного эфира до кислоты, получение с количественным выходом хлорангидрида обработкой оксалилхлоридом, и перевод полученного хлорангидрида в N-этиламид индол-3-карбоновой кислоты взаимодействием с избытком этиламина ( выход составил 88 %). Искомые производные получали: обработкой этилбромидом, выход N-этиламида 1-этилиндол-3-карбоновой кислоты составил 85 % и 4-броммасляным эфиром в диметилформамиде в присутствии гидрида натрия с последующим щелочным гидролизом, выход N-этиламида 1-(3-карбоксипропил)индол-3-карбоновой кислоты составил 80 %, считая на две стадии. Структуры всех полученных соединений охарактеризованы необходимым набором физико-химических данных.

9.2. Синтез 4-(3-циклогексилкарбонилиндол-1-ил)бутановой и 4-(3-циклопентилкарбонилиндол-1-ил)бутановой кислот .

Для разработки тест-систем определения дизайнерских наркотиков ряда 3-ацилиндолов необходимо в первую очередь синтезировать возможные аналоги психоактивных веществ. Было решено разработать методику получения 4-(3-циклогексилкарбонилиндол-1-ил)бутановой и 4-(3-циклопентилкарбонилиндол-1-ил)бутановой кислот, которые могут служить миметиками синтетических каннабиноидов, но не входят в список запрещенных препаратов. Структурно данные вещества имеют общие черты с многими JWH, куда в состав входит сам индол.Синтез проводили по разработанной схеме с использованием реактива Гриньяра. Вещества получены с хорошими выходами, строение и чистота доказаны методом тонкослойной хроматографии и 1H-ЯМР-спектроскопии. Для синтеза готовых к последующей работе трейсеров необходимо к структуре полученных веществ привязать флуоресцирующую метку. В работе был использован этилендиаминфлуоресцеинтиокарбамат (ЭДФ). Были получены меченые соединения (трейсеры), очищенные после синтеза от примесей методом тонкослойной хроматографии. Молекулярные структуры полученных соединений были подтверждены методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием.  Показателем связывания антител и вещества с трейсером является резкое (на 70-100 единиц) повышение поляризации флуоресценции. Были произведены исследования на связывание полученных в ходе работы трейсеров с антителом Anti-IAA-TG IC 7/3c10 к индолуксусной кислоте методом поляризационно-флуоресцентного иммуноанализа. Проведенные опыты показали, что связывания с имеющимися антителами не происходят. Работы будут продолжены.

10. Способ получения замещенных диангидридов 1(4)-замещенных-7,8- дифенилбицикло[2.2.2]окт-7-ен-2,3,5,6-тетракарбоновых кислот.

Был разработан и защищен патентом способ получения замещенных диангидридов 7,8-дифенилбицикло[2.2.2]окт-7-ен-2,3,5,6-тетракарбоновых кислот, путем конденсации 2,5 мольного избытка малеинового ангидрида с 2(5)-замещенным 4-гидрокси-3,4-дифенилциклопент-2-ен-1-оном при температуре 200-2250С с последующим выделением целевого продукта. В качестве предшественника диена используется замещенный 4-гидрокси-3,4-дифенилциклопент-2-ен-1-он, в качестве диенофила – малеиновый ангидрид, конденсацию проводят без растворителя и при температуре 200-2250С, а выделение целевого продукта проводят обработкой реакционной смеси кипящей уксусной кислотой [6].  

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предложены красители с голубой флуоресценцией для мечения ДНК. Они применены во флуоресцентных ДНК-зондах. Разработан простой метод синтеза неизвестного ранее 2-этинилперилена и усовершенствован синтез 3-этинилперилена. Изучены возможности применения катиона трис(2,6-диметоксифенил)метилия для дериватизации первичных аминов и аминогликозидных антибиотиков с последующим определением продуктов методом МАЛДИ-МС. Разработаны методы получения светочувствительных соединений с заданным комплексом физико-химических и фото-физических свойств. Для установления строения экзогенного вещества с молекулярной массой 238 а.е.м. в биообъекте были разработаны методы синтеза шести вероятных кандидатных структур. Синтезированы липофильные производные налоксона, изучалась возможность получения пролонгированных малорастворимых форм сложных эфиров налоксона для лечения тяжелой опиатной зависимости. Начаты работы по разработке метода синтеза хиноксикаина; получены три соли диэтиламиноэтиламида 4-гидрокси-2-оксо-1-пропил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты - гидрохлорид (собственно хиноксикаин), метансульфонат и L-тартрат. Разрабатывется препаративный метод синтеза химического аналога хиноксикаина – хиназолона. Для разработки методов инструментального и иммунохимического анализа запрещенных 1-замещенных амидов индол-3-карбоновой кислоты были синтезированы 1-этил- и 1-(3-карбоксипропил)-N-этиламиды индол-3-карбоновой кислоты, Для разработки тест-систем определения дизайнерских наркотиков ряда 3-ацилиндолов разработаны методики получения 4-(3-циклогексилкарбонилиндол-1-ил)бутановой и 4-(3-циклопентилкарбонилиндол-1-ил)бутановой кислот, получены меченые соединения с ЭДФ (трейсеры), начаты работы по разработке методов ПФИА. Разработан и защищен патентом способ получения замещенных диангидридов 7,8-дифенилбицикло[2.2.2]окт-7-ен-2,3,5,6-тетракарбоновых кислот.

Публикации

  1. Aparin I.O., Farzan V.M., Veselova O.A., Chistov A.A., Podkolzin A.T., Ustinov A.V., Shipulin G.A., Formanovsky A.A., Korshun V.A., Zatsepin T.S. (2016). 1-Phenylethynylpyrene (PEPy) as a novel blue-emitting dye for qPCR assay. Analyst 141 (4), 1331–1338 [+]

    An alkyl azide derivative of 1-phenylethynylpyrene (PEPy) dye was prepared and used in the functionalization of oligonucleotides via click chemistry. Spectral and photo-physical properties of the PEPy-modified oligonucleotides as a single strand, and in perfect or mismatched duplexes, have been studied. A series of PEPy-Dabcyl fluorogenic TaqMan probes were synthesized and tested in qPCR. PEPy proved to be a superior substitute for AMCA as a short wavelength fluorescent dye for qPCR probes. PEPy probes were shown to significantly reduce Cq (a fractional PCR cycle used for quantification) vs. AMCA labeled probes, thus improving on the reliability of detection. Moreover, a larger increase of fluorescence during amplification was observed in the case of PEPy probes that makes this dye very suitable for an end-point PCR technique. This study broadens the panel of fluorescent dyes suitable for the use in probes for quantitative real-time PCR.

    ID:1351