Пресс-центр / новости / Наука /
Информация о ходе выполнения проекта Минобрнауки № 14.604.21.0069 по теме «Создание новых рекомбинантных биокатализаторов с потенциальными фармакологическими свойствами методами комбинаторной биологии»
За отчетный период 2014 года в рамках выполнения проекта были проведены следующие работы:
выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, по теме современных представлений получения биокатализаторов de novo и технологий высокопроизводительного скрининга.
разработан план исследований по созданию новых рекомбинантных биокатализаторов с потенциальными фармакологическими свойствами методами комбинаторной биологии.
выполнены патентные исследования в соответствии с ГОСТ Р 15.011-96.
проведены исследования по созданию новых рекомбинантных биокатализаторов и получены оригинальные вектор-генетические конструкции (конструкции) для экспрессии генов ферментов (БуХЭ, ЭК, ДНКазаI) и каталитического антитела A17 на поверхности дрожжевой клетки. При создании конструкций учтена проблема эквимолярности экспрессии рекомбинантных продуктов.
разработана лабораторная методика экспрессии генов биокатализаторов на поверхности дрожжевых клеток.
проведено исследование наличия специфической активности биокатализа-торов на поверхности клеток.
разработана микрофлюидная технология для упаковки клеток с биокатализа-торами на поверхности в состав двукратной эмульсии вода/масло/вода, позволяющая определять каталитическую активность ферментов и антител.
привлечены и израсходованы внебюджетные средства на материально-техническое обеспечение выполнения экспериментальных исследований по этапу.
Анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы, по теме современных представлений получения биокатализаторов de novo и технологий высоко-производительного скрининга показал, что комбинаторный подход, основанный на скрининге фаговых или клеточных библиотек, можно рассматривать в качестве эффективной стратегии для получения искусственных биокатализаторов de novo. Полученные ферменты можно ис-пользовать в качестве матрицы для дальнейшего рационального дизайна на основе анализа трехмерной структуры белка. Виртуальный скрининг мутантов с новой / улучшенной функциональностью может быть произведен путем сочетания метода молекулярной динамики и метода квантовой механики / молекулярной механики. Количество использованных источников 51, из них 22 публикации с 2009 г. по настоящее время.
В разработанном плане исследований представлены все этапы проведения проекта с 2014 по 2016 годы. Определены объекты исследований, дизайн эксперимента и ответственные исполнители. План представлен на 6 страницах.
В качестве стран поиска в соответствии с рекомендациями о проведении патентных исследований выбраны страны, принятые в экспертизе изобретений как обязательные страны поиска. На данном этапе патентного поиска обнаружено и просмотрено свыше 500 источников патентной информации, из них для дальнейшего анализа отобрано 38 охранных документа, в том числе по странам: США –15, Россия – 4, Израиль – 2, Южная Корея –1. Большая доля международных патентов (16 из отобранных) свидетельствует о значимости изобретений в данной области, заявители стремятся получить на свои технические решения монопольное право одно-временно на территории нескольких государств. Патентный анализ показал, что дальнейшие исследования и практические разработки в области рекомбинантных биокатализаторов являются своевременными и перспективными, а патентование таких препаратов, способов их получения и методик модификации их биологической активности является целесообразным. Абсолютное большинство запатентованных способов получения биокатализаторов относится к синтезу в клетках лини CHO в виде полноразмерных или «урезанных» вариантах, предлагаемые методы модификации опираются на химическую или ферментативную конъюгацию белковых препаратов с гидрофильными полимерами, такими как полиэтиленгликоль или аналог, или полисиаловая кислота.
В рамках этапа 1 были созданы генетические конструкции для экспрессии генов ферментов (БуХЭ, ЭК, ДНКазаI) и каталитического антитела A17 на поверхности дрожжевой клетки. Каждая конструкция содержат: (i) ген, кодирующий флуоресцентный белок mCherry с внутриклеточной локализацией; (ii) ген, кодирующий фермент, соединенный с якорной последовательностью SED1 и разделенные самопроцессирующим пептидом F2A. Таким образом, при создании конструкций учтена проблема эквимолярности экспрессии целевого фермента и внутреннего маркера (флуоресцентного белка), что позволяет проводить селекцию клонов с наибольшим уровнем экспрессии фермента на поверхности дрожжевой клетки. Гены, кодирующие биокатализаторы экспрессируются экстрацеллюлярно под контролем лидерного пептида HSA.
Для экспрессии антител на поверхности дрожжевой клетки были созданы две генетические конструкции. Генетическая конструкция кодирующая тяжелую цепь антитела A17, содержала следующие элементы: (i) ген, кодирующий флуоресцентный белок mCherry с внутриклеточной локализацией; (ii) ген, кодирующий VH и CH1 домены антитела A17, соединенный с лидерным пептидом HSA и якорной последовательностью SAG1 и разделенные самопроцессирующим пептидом F2A. Генетическая конструкция кодирующая легкую цепь антитела A17, содержала следующие элементы: (i) ген, кодирующий VL и CL домены антитела A17, соединенный с лидерным пептидом alpha-short.
Была разработана лабораторная методика экспрессии генов биокатализаторов на поверхности дрожжевых клеток, с уровнем экспонирования целевого белка до 12-15 тыс. молекул на одну клетку.
Эксперименты по исследованию специфической активности биокатализаторов на поверхности клеток, показали, что ферменты и каталитическое антитело A17, сохраняют реакционную способность по отношению к своим субстратам.
В ходе выполнения работ по этапу 1 удалось создать микрофлюидную систему для высокопроизводительной генерации стабильной монодисперсной двойной эмульсии. Полученная в результате методика позволяет осуществить компарментализацию индивидуальных клеток Pichia Pastoris сохраняя их выживаемость и обеспечивая возможность протекания реакции, катализируемой биокатализатором, экспонированным на поверхности живой клетки.
8 декабря 2014 года