Пресс-центр / новости / Наука /

Информация о ходе выполнения проекта Минобрнауки № 14.616.21.0009 по теме «Сочетание синхротронных излучателей с лазерами на свободных электронах для структурно-функционального изучения объектов молекулярной медицины как пример создания принципиально

В качестве стран поиска в соответствии с рекомендациями о проведении патентных исследований выбраны страны, принятые в экспертизе изобретений как обязательные страны поиска. Проанализировано более 500 документов РИД, из них для дальнейшего анализа отобрано 28 охранных документа, в том числе по странам: США –10, Япония – 3, Россия – 2, Мексика – 2, Южная Корея –1. Большая доля международных патентов (21 из отобранных) свидетельствует о значимости изобретений в данной области, заявители стремятся получить на свои технические решения монопольное право одновременно на территории нескольких государств. При этом стоит отметить, что, как правило, международные патенты дублируются национальными патентами, прежде всего патентами США. Динамика патентования в области хорошо отражается нарастанием числа патентов с ключевыми словами «каталитические антитела»»: 1990–2004 гг. – 89, 2004г. – 21, 2005г. – 13, 2006г. – 6, 2007г. – 6, 2008г. – 9, 2009г. – 11, 2010г. – 9, 2011г. – 9, 2012г. – 10, 2013г. – 9, 2014г. – 7.

Большинство запатентованных способов получения каталитических антител относится к созданию антител-ферментов против патологических молекул, оболочек вирусов, токсических инсектицидов. Также изучение патентных источников показало, что исследование каталитических антител с целью выявления особенностей механизма катализируемых реакций по отношению к молекулам-патогенам являются перспективной задачей. Таким образом, дальнейшие исследования и практические разработки в области рекомбинантных каталитических антител являются своевременными и перспективными, а патентование таких препаратов, способов их получения и методик модификации их биологической активности является целесообразным. Документов, препятствующих использованию практических разработок в области рекомбинантных каталитических антител, в ходе поиска не обнаружено.

Анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы, по теме современных представлений о создании и перспективах использования каталитических антител в медицине показал, что абзимы являются перспективной моделью для создания «каталитических вакцин» с заданными свойствами. Изучение структуры и механизмов действия каталитических антител является актуальной задачей и открывает пути направленного улучшения их функциональных свойств и поиска новых биокатализаторов. Принципиальное новые возможности, как для структурного анализа биологических объектов, так и изучения их функциональной структурной динамики открывает фемтосекундная кристаллография. В последнее время в кристаллографии появилась новая парадигма, свидетельствующая о возможности получения дифракции на микрокристалах, как на синхротронных источниках, так и на FELs источниках. При этом отдельные дифракционные картины наблюдаются на сотнях тысяч кристаллитов, протекающих в виде жидкой суспензии поперек пучка, а затем весь массив данных объединяется в трехмерную структуру. Развитие таких исследований позволит выявлять очень быстрые межмолекулярные взаимодействия и внутримолекулярные преобразования с атомарной степенью детализации. Динамические изменения в структурной организации биокатализаторов при осуществлении акта катализа являются ключом к понимаю их механизмов действия и управлению функциями. Количество использованных источников в литературном обзоре - 56, из них 26 публикации с 2009 г. по настоящее время.

В разработанном плане исследований представлены все этапы проведения проекта с 2014 по 2017 годы. Определены объекты исследований, дизайн эксперимента и ответственные исполнители. План представлен на 6 страницах.

В ходе работы по п.1.4 были созданы две суб-библиотеки активного центра каталитического антитела А17. Основная идея библиотек – (А) создание области с положительным зарядом с одной стороны органофосфатного лиганда (для связывания параоксона) и (В) области с отрицательным зарядом с другой стороны (для гидролиза ковалентного интермедиата). Библиотеки А и В созданы в виде одноцепочечного антитела – вариабельные фрагменты тяжелой и легкой цепи соединены серин-глициновым линкерным пептидом. В основе принципа создания библиотек лежит объединение аминокислот в группы. Для каждой группы аминокислот был написан вырожденный праймер, содержащий на месте аминокислот, подлежащих замене, вырожденные кодоны, кодирующие дикий тип плюс либо положительно заряженные аминокислоты (аргинин и лизин), либо отрицательно заряженные (глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота и гистидин). Представительность полученных библиотек составила: 2×10⁶ для библиотеки (А) и  4×10⁷ для библиотеки (Б).

Для применения методов рационального изменения антитела необходимо достичь атомистического понимания механизма образования ковалентного конъюгата и его последующего гидролиза. Для решения этой задачи были использованы методы молекулярного моделирования, а именно QM/MM моделирование интересующих реакций. С помощью моделирования управляемой динамики и зонтичной выборки и был предложен примерный механизм реакции, который идет в два этапа. Для поиска альтернативных конформаций фософната в комплексе с антителом были использован метод докинга, который проводился с учетом подвижности боковых групп остатков, формирующих активный центр. В результате докинга был получен набор конформаций с довольно близкими значениями энергии связывания, из которых для дальнейшего анализа были отобраны те, у которых расстояние между фосфором и гидроксилом тирозина составляло не более 5 Å. Предварительные результаты апробации алгоритма предсказания аминокислотных замен методом QM/MM и MD компьютерных расчетов показали хорошее соответствие с экспериментальными данными.

В рамках пункта 1.6 на основе вектора pET28a(+) по сайтам XhoI и NcoI, были созданы следующие генетические конструкции:

1.       Лектиновый и EGF-подобный домены
Е-селектина человека

2.       Лектиновый и EGF-подобный домены
Р-селектина человека

3.       Лектиновый и EGF-подобный домены
Е-селектина мыши

4.       Лектиновый и EGF-подобный домены
Р-селектина мыши

5.       Транскрипционный фактор Fra-2 человека

Полученные плазмидные конструкции пригодны для дальнейших экспериментов по оптимизации процедуры наработки и очистки белков в препаративных количествах.

В ходе выполнения работ по этапу 1.7 проекта были проанализированы методы снижения фона: криогенное охлаждение кристалла предварительно помещенного в петлю, суспензии мелких кристаллов, микропленок и фибролитов, а также методы подготовки образцов толщиной субмикронных для криоэлектронной микроскопии. Основная задача – удалить остаточные следы влаги из образца перед криогенным замораживанием, что приводит к резкому снижению фона. Параллельно, проводили оптимизацию анализа отдельных моделей для улучшения оценки и коррекции фона. Методы обработки, применяемые в серийной кристаллографии, объединили данные от многих «хитов» взаимодействия, поскольку вследствие систематических ошибок накапливаются сигналы соответствующие фону. Мы оптимизировали систему анализа, что позволило нам оценивать фоновый сигнал смежных анализируемых образцов (то есть, используя информацию от некристаллических хитов), а также сравнивать собранные данные 3D-моделей с фоновым сигналом, полученным при обработке 2D моделей.

Современный протокол сбора данных при анализе данных с X-FEL требует 8 часов времени для концентрации пучка частиц в синхротроне и нескольких циклов оптимизации образца. На данном этапе работы удалось увеличить интенсивность рентгеновского излучения, а также использовать детекторы с высокой скоростью сбора данных. Проведена оптимизация анализа таким образом, что макисмально допустимая для всего образца биоматериала доза рентгеновского излучения фокусируется на каждом минимальном объеме этого образца. Таким образом, регистрировали полную дифракционную картину образца за меньшее время.

8 декабря 2014 года

<form action="" method="post" class="commentForm" id="commentForm-{0}"> <input type="hidden" name="pressId" value="1097" /> <input type="hidden" name="parentId" value="{1}" /> <input type="hidden" name="id" value="{2}" /> <txt name="comment_text" id="comment_text">{3}</txt> <input type="button" class="button" value="Комментировать" /> <a class="button" href="javascript:void(null)">Отмена</a> <span class="wait">Подождите немного...</span> <div class="clear"></div> </form>