За отчетный период 2015 года в рамках выполнения соглашения были проведены следующие работы:

 

по направлению «Мастер-регуляторные белки и гены развития и канцерогенеза на  примере поджелудочной железы».

 

Проведен анализ более 150 печатных работ и баз данных, содержащих данные по генам и белкам, принимающим участие в морфогенезе и гистогенезе и в возникновении и развитии рака, включая метастатический процесс. Обобщены наиболее современные представления о  принципах мастер регуляции процессов эмбриогенеза и канцерогенеза. По результатам опубликовано восемь обзоров и статья. Систематизированы данные по белкам и генам, вовлеченным в развитие рака поджелудочной железы (ПЖ) и его метастазов, а также данные по белкам и генам, вовлеченным в развитие человеческой ПЖ поджелудочной железы при эмбриогенезе (всего более 50 генов). Составлены соответствующие каталоги. Начато создание коллекции хирургических образцов опухолевых и эмбриональных тканей ПЖ. Собрано 23 образца опухолей ПЖ, 2 образца условно нормальной ПЖ и 3 образца ткани ПЖ при панкреатите, 4 образца холангиоцеллюлярного рака. Начато создание коллекции эмбриональных тканей ПЖ. Собрано 10 образцов человеческой фетальной ПЖ. Все образцы гистологически охарактеризованы, собраны сведения о пациентах. Составлен каталог образцов. Создана коллекция клеточных линий рака ПЖ. Проведено сопоставление каталогизированных массивов данных и выявлены 43 потенциальные гены-кандидаты, вызывающие эмбриоподобное состояние раковых клеток. Анализ распределения суперэнхансеров (база данных dbSUPER) относительно этих генов, 

показал, что 33 гена (77 %) непосредственно перекрываются с суперэнхансерами. Это  усиливает вероятность их функционирования в качестве мастер генов в развитии ПЖ.

 

Методами биоинформатики определены критические транскрипционные системы, SNAI1 и SNAI2 – транскрипционные мастер регуляторы, вовлеченные в эпителиально-мезенхимальные и обратные переходы, происходящие в опухолях и метастазах рака ПЖ. Проанализированы транскриптомы мезенхимальных (стромальных) клеток опухолевой и нормальной ткани ПЖ, проведен функциональный поиск и анализ генов с измененной активностью как новых терапевтических мишеней в опухолевом микроокружении рака ПЖ. Полнотранскриптомный анализ кДНК библиотек трех первичных культур стромальных клеток ПЖ (нормальной ткани ПЖ, ткани ПЖ при панкреатите и опухолевой ткани ПЖ) дал данные об относительном уровне экспрессии 10976 различных генов. Данные позволяют 

предположить, что стромальный ответ мезенхимальных клеток при панкреатите в виде фиброзной стромы и при протоковой аденокарциноме в виде опухолевой стромы может иметь общие механизмы индукции и общие молекулярные мишени для таргетной терапии.

Продемонстрирована повышенная экспрессия терапевтически важных генов CXCL12, CX3CL1, AQP1, SUSD2 и IGFBP2 в опухолевой строме протоковой аденокарциномы ПЖ. Статья подготовлена к публикации. Проведен анализ собранных и каталогизированных данных, сопоставление каталогизированных массивов данных и выявлены потенциальные гены-кандидаты, 

вызывающие эмбриоподобное состояние раковых клеток. Для дальнейшей работы выбраны шесть потенциальных мастер генов: PDX1, PTF1a, SOX9, HNF1-beta, GATA4, GATA6. Кроме того в работу взят ген FAP, белок которого содержится в клетках CAF (cancer associated fibroblasts), составляющих основную массу (до 90%) стромального окружения опухолей эпителиального происхождения. CAF клетки характерны практически для всех карцином и FAP может быть перспективной мишенью для терапевтического воздействия. Из всех клеточных линий приготовлены РНК, кДНК и белковые экстракты, а также 

ДНК. Начато выделение РНК из хирургических образцов и синтез кДНК. Дизайнированы и синтезированы праймеры, подобраны условия и проведен анализ экспрессии отобранных кандидатных генов на панели кДНК клеточных линий. Начат экспериментальный анализ продуктов экспрессии отобранных кандидатных генов с использованием созданных панелей кДНК и белковых экстрактов из опухолевых и эмбриональных тканей ПЖ.

 

по направлению «Рецепторные и сигнальные белки. Анализ структуры и функции»

 

Для изучения молекулярных основ проведения биохимического сигнала через мембрану клетки осуществлен анализ имеющихся в литературе данных в области структурно-функциональных исследований и молекулярных механизмов биологической активности РТК, а также аналогичных мембранных рецепторов I-типа. Выявлены предварительные данные о взаимосвязи структуры и функции этих белков, а также их роли в возникновении и развитии социально-значимых заболеваний  человека.  Проведена сравнительная оценка возможных направлений исследования молекулярных механизмов функционирования РТК, с выявлением наиболее перспективных представителей рецепторов из различных семейств. В результате для структурных исследований методом гетероядерной спектроскопии ЯМР в мембраноподобных системах был сделан выбор 6-ти минимальных по размерам РТК, 

интересных с медицинской точки зрения. Разработаны высокоэффективные системы  бактериальной и бесклеточной экспрессии и очистки изотопно-меченых связок   трансмембранных доменов с функционально важными цитоплазматическими примембранными участками рецепторов. Были разработаны методики продукции белка MSP различного размера для сборки липид-белковых нанодисков (ЛБН) с высокими выходами  целевого белка, а также протоколы сборки ЛБН, содержащих связки доменов РТК и аналогичных белков. Образцы ЛБН различного размера и липидного состава, содержащие связку трансмембранного и цитоплазматического домена модельных рецепторов, были охарактеризованы методами ЯМР- спектроскопии, фотон-корреляционной спектроскопии  и   электронной микроскопии.

 

Исследовано сохранение нативной структуры цитоплазматического домена белка в различных мембраноподобных средах. Полученные  результаты помогут в дальнейшем выявить функциональные конформационные изменения в РТК при активации сигнального лиганд- рецепторного мембранного комплекса в мембранах.

 

по направлению «Пептидомика. Пептидные факторы системы врожденного иммунитета»

 

В ходе выполнения работ в рамках проекта была разработана эффективная технология экспрессии в прокариотической системе и очистки рекомбинантных антимикробных пептидов (аналогов тахиплезина и пептида Th, а также тритрптицина). С целью увеличения выхода гибридных белков, включающих целевые пептиды, и упрощения процедуры очистки были проведены эксперименты по оптимизации процесса, что позволило достичь относительно высокого уровня экспрессии (30% от суммарного белка клетки) и исключить стадию повторной очистки с помощью металлохелатной хроматографии. В результате были получены семь рекомбинантных пептидов, выход которых составил от 7 до 13 мг с литра культуры.

 

Структура пептидного антибиотика грамицидина А была исследована в липосомах фосфатидилхолина, модифицированного неионным детергентом Тритоном Х-100. Соотношение детергента и липида, при котором происходит насыщение липидной мембраны детергентом, было определено методом динамического лазерного светорассеяния. Равновесное 

конформационное состояние грамицидина А  в фосфолипидных липосомах было исследовано методом КД-спектроскопии.  Показано, что структура  этого канал-образующего антибиотика кардинально изменяется при переходе к более жидкой мембране, модифицированной Тритоном Х-100. 

 

В ходе выполнения работ в рамках проекта были обнаружены и выделены новые липид-

транспортирующие белки (LTP) укропа и гороха. Были определены полные аминокислотные последовательности данных белков и структуры полноразмерных кДНК, кодирующих их белки-предшественники. С помощью флуоресцентной спектроскопии для LTP укропа и гороха была выявлена специфичность связывания жирных кислот, лизофосфолипидов и жасмоновой кислоты - растительного гормона роста и развития растений. Для экспрессии в Е. coli белков-аллергенов пыльцы полыни Art v 3 и фундука Cor a 8, принадлежащих к классу растительных LTP, были получены генно-инженерные конструкции и штаммы-продуценты, позволяющие экспрессировать целевые белки с выходом не менее 3 мг/л культуры. 

 

В рамках проекта были выполнены исследования по оптимизации протокола выделения пептидов из плазмы/сыворотки крови человека.  Было предложено осуществлять выделение, используя крупнопористый слабый катионообменный сорбент типа CM Toyopearl 650 S и CM Bio-gel A. Разработан способ стабилизации пептидного пула в 0,1% БСА перед масс-спектрометрическим анализом. Исследована возможность повышения эффективности идентификации пептидов за счет оптимизации условий хроматографического разделения 

пептидных смесей. Показано, что для повышения эффективности хромато-масс-

спектрометрического анализа пептидных фракций, выделенных из плазмы/сыворотки крови, следует использовать 120-минутный градиент буфера В от 5 до 40%. С использованием разработанной технологии удалось идентифицировать около 3000 уникальных пептидов, выделенных из 100 мкл сыворотки крови. 

 

В рамках изучения пептидома растений проанализированы пептидные пулы клеток мха Physcomitrella patens и выявлено свыше 28000 эндогенных пептидов – продуктов деградации функциональных белков. Предсказана потенциальная антимикробная активность некоторых фрагментов, образующихся в стрессовых условиях. Для того, чтобы идентифицировать гены, кодирующие пептиды, использовали биоинформатический анализ и выявили около 220 тысяч коротких рамок считывания. С помощью ПЦР в реальном времени оценили изменение уровня транскрипции некоторых генов, предположительно кодирующих пептиды, при разных стрессовых воздействиях. Обнаружено, что у отдельных генов уровень транскрипции повышается на порядок в условиях абиотического и биотического стресса.

 

по направлению «Белки биокаталитических систем»

 

Созданы генетические конструкции, обеспечивающие эффективное представление функционально-активных биокатализаторов с принципиально разной активностью и специфичностью на поверхности дрожжевых клеток. 

 

Получены генетические конструкции содержащие под контролем промотора гена AOX1 последовательности легкой цепи энтеропептидазы (EK), бутирилхолинэстеразы (BChE) и ДНКазы I (DNаse) человека объединенные с последовательностью SAG1 субъединицы 1 α-агглютинина (Aga1), позволяющей заякоривать рекомбинантные ферменты на поверхности клеточной стенки. 

 

Определено оптимальное сочетание генетических элементов, позволяющее эффективно экспонировать молекулы функционально-активных биокатализаторов, таких как ферменты и абзимы на поверхность дрожжевых клеток. 

 

Для высокоэффективного скрининга биокатализаторов были разработаны две принципиально различные платформы для получения искусственных биокатализаторов de novo. Подобраны условия, позволяющие доcтигать 70% выживаемости клеток после отбора. Создана библиотека Fab-фрагментов, презентированных на поверхности клеток дрожжей.

Собрана биомасса червя F. heliota. Из биомассы F. heliota в получены в индивидуальном (чистом) состоянии ряд структурных аналогов люциферина – его метаболических предшественников. Методами ЯМР, масс-спектроскопии и встречного синтеза установлены структуры аналогов люциферина (его метаболических предшественников). Определены функциональные группы люциферина, ответственные за восстановление молекулы кислорода, а также за излучение квантов света (light emitter). Установлено, что окислению кислородом подвергается карбоксильная группа остатка лизина, а также альфа-СН лизина, в то время как за излучение кванта света отвечает ароматический остаток CompX. Проведен синтез люциферина в количестве 1 грамм. Проведено секвенирование транскриптома F. heliota методом высокопроизводительного секвенирования нового поколения (NGS). Из биомассы F. heliota получен очищенный препарат люциферазы для секвенирования по Эдману (N-концевое секвенирование) и масс-спектрометрического секвенирования. С помощью масс-спектрометрического секвенирования установлены аминокислотные последовательности белков - -кандидатов новой люциферазы F. heliota. Также, с использованием полученных данных секвенирования транскриптома установлены нуклеотидные последовательности генов, кодирующих данные белки. С использованием синтетического люциферина изучен механизм его окисления кислородом и наработан оксилюциферин, структура которого была установлена методами ЯМР и МС как (Z)-4-(5-(3-(5 карбоксиформамидо)пентанамидо)-2-метокси-3-оксопроп-1-ен-1-ил)-2-гидроксибензамидо)бутаноая кислота.

 

Получена форма Ес-Lon-протеазы, утратившая инсерционный HI(CC)-домен (Ес-Lon-дельта(124-304)). Установлен вклад НI(СС)-домена в функционирование АТР-азного и пептидазного центров Ес-Lon-протеазы, доказана необходимость НI(СС)-домена для реализации протеолитической активности фермента и поддержания его конформационной стабильности.

 

Проведен сравнительный анализ первичных последовательностей бактериальных IgA протеаз из Neisseria meningitidis серогрупп А, В, С и  Е, рассчитана информационная структура IgA1протеазы, определены консервативные последовательности, содержащие В и Т эпитопы. На основе этих расчетов предложены три варианта структур иммуноактивных фрагментов белка. Для этих структур разработаны новые конструкции рекомбинантной плазмидной ДНК и на их основе созданы штаммы, продуцирующие фрагменты рекомбинантной IgA1 протеазы, содержащие потенциально активные участки IgA1 протьеазы.

 

На основании анализа информационной структуры PSP предложены три варианта укороченных белков PSP (Glu109 – Glu677, His279 – Glu677 и Met1 – Ser108 ---- His279 – Glu677). Получен укороченный вариант PSP (101-677) экспрессией соответствующего гена в E. coli (PSPΔ100) и ограниченным протеолизом полноразмерного рекомбинантного фермента с помощью химотрипсина.  Последний образец, сохраняя активность в отношении низкомолекулярного субстрата PSP – BAPNA, был активен также в отношении белкового субстрата – азоказеина  в отличие от исходного  PSP.

 

Получены две мутантные формы протеазы ВИЧ (ПВ): ПВ-L10I/L31I/M46I/I54V/L63I/V82A/I84V/L90M и ПВ- L10I/M36I/S37D/M46I/R57K/L63P/A71V/G73S/I84V/L90M/I93L, устойчивые к ингибиторам I-го поколения – индинавиру и саквинавиру, соответственно.

 

Показана возможность осуществления нового каскадного биосинтеза биологически важных нуклеотидов, при использовании трехстадийного каскадного превращения D-пентоз в пуриновые нуклеотиды - превращения в одном реакционном объеме (1) D-пентоз в 5-фосфаты под действием рибокиназы, из которых затем синтезируются (2) 5-фосфо-α-D-пентофуранозо-1-пирофосфаты под действием фосфорибозилпирофосфатсинтетазы (PRPP-cинтетазы), (3) конденсация последних с гетероциклическими пуриновыми основаниям в присутствии 

аденинфосфорибозилтрансферазы (APR-трансферазы) дает желаемые нуклеотиды.

 

Осуществлено клонирование синтетического гена рибокиназы из термофильного микроорганизма Thermus species 2.9, двух разных генов PRPP-cинтетазы из Thermus thermophilus и APR-трансферазы Thermus thermophilus HB27 в экспрессионных векторах, получены высокопродуктивные штаммы-продуценты E. coli, продуцирующие указанные выше ферменты в растворимой форме. Разработаны методы выделения рибокиназы, PRPP-cинтетазы и APR-трансферазы. Наработаны партии препаратов ферментов высокой степени чистоты и концентрации более 10 мг/мл для кристаллизации и кинетических исследований.

 

Подобраны начальные условия кристаллизации генно-инженерных ферментов: рибокиназы, PRPP-cинтетазы и APR-трансферазы, данные условия адаптированы и  оптимизированы применительно к методу встречной диффузии в капиллярах для последующего проведения рентгеноструктурного анализа.

 

Проведен комплекс работ по определения субстратной специфичности и оптимальных условий максимально эффективной работы всех ферментов.

 

по направлению «Белок и гликан-опосредованные клеточные  взаимодействия в динамических условиях»

 

1. Осуществлен синтез гликанов и гликоконъюгатов, необходимых для выполнения намеченных биологических исследований: пробы для вирусологических исследований (в том числе для иммобилизации вируса на кантилевере АСМ), гликолипиды для проведения SPR-

экспериментов и для исследования формирования глико- паттернов в биологической мембране. 

Разработана общая методология синтеза гликолипидов с заранее заданными свойствами, в том числе способностью встраиваться в мембрану живой клетки. Синтезированы аффинные сорбенты для выделения нескольких видов естественных антител человека; новые лиганды для гликоэррея.

 

2. Методом молекулярной динамики (МД) исследовалась структурная организация мембранного фрагмента, в состав которого входит около 100 липидов, в том числе 10 гликолипидов Gb3. Показано, что конформация гликана в составе Gb3 относительно плоскости мембраны такова, что один из его субсайтов доступен для внешнего узнавания, а второй – для 

сближения с фосфолипидами, а это дает ключ к пониманию его необычного взаимодействия с 

углевод-связывающими белками. 

 

3. Синтезирована группа молекул, содержащих Neu5Ac, в том числе рецепторы птичьих и человеческих вирусов гриппа; а также конкурентный ингибитор нейраминидазы вируса гриппа и ее суицидный субстрат. Получены соответствующие гликоконъюгаты. 

 

4. Найдены неразрушающие для вируса гриппа условия его изучения с помощью АСМ, получены сканы АСМ хорошего разрешения. 

 

5. Идентифицированы естественные антиуглеводные антитела, ассоциированные с липопротеинами низкой плотности. Уровень некоторых из них при атеросклерозе был выше, 

 

чем у здоровых доноров. Эпитопная специфичность выявленных антител позволила предположить их участие в преэклампсии, оказалось, что уровень антител к гиалуроновой кислоте коррелирует с общими антителами к белкам эндотелиальных клеток. По-видимому, эти  антитела маскируют компоненты гликокаликса в динамических условиях.