Пресс-центр / новости / Наука /

Информация о ходе выполнения проекта минобрнауки россии по соглашению № 14.607.21.0016 о предоставлении субсидии от 5 июня 2014 г. по теме: разработка биотехнологии получнения антимикробного пептида цекропина р1 на основе биобезопасных трансгенных ра

В результате выполнения работ по Соглашению № 14.607.21.0016 получены результаты:

• Проведен молекулярно-генетический и физиолого-биохимический анализ трансгенных безмаркерных растений каланхоэ перистого Kalanchoe pinnata.

В работе было получено 35 линий трансгенных растений, эффективность трансформации составила 25%. Наличие целевого гена СР1 в трансформированных растениях каланхоэ подтверждено методом ПЦР с праймерами, специфичными к этому гену. Молекулярная масса экспрессируемого пептида в трансгенных растениях была подтверждена методом масс-спектроскопии и была равна 3338, что соответствует теоретической молекулярной массе синтетического цекропина Р1. Экспрессия гена СР1 подтверждена методом вестерн-блот анализа. Иммунодетекция растительных экстрактов показала наличие полосы с молекулярной массой около 3.4 кДа, что соответствует полноразмерной зрелой форме пептида цекропина Р1. Показана антибактериальная активность экстрактов трансгенных растений методом радиальной диффузии. Экстракты контрольных растений не обладали заметной антибактериальной активностью. У полученных трансгенных растений исследована активность антиоксидантных ферментов в условиях заражения патогенными бактериями Erwinia carotovora. В качестве маркеров стресса исследовали активность супероксиддисмутазы (СОД) и уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ). Отмечено повышение уровня ПОЛ в 2 раза и уровня перекиси водорода в листья зараженных контрольных растений, в то время как у трансгенных растений эти параметры оставались на том же уровне, что и до стресса. Это свидетельствует о повышенной устойчивости СР1-растений к биотическому стрессу.

• Проведено тестирование полученных трансгенных растений каланхоэ на устойчивость к поражению бактериальными и грибными фитопатогенами: Erwinia carotovora и Sclerotinia sclerotiorum.

Трансгенные растения каланхоэ, содержащие синтетический ген цекропина Р1, проверяли на устойчивость к бактериальному E. carotovorа и грибному S. sclerotiorum штаммам фитопатогенов. Результаты проведенного анализа показали значительное повышение устойчивости трансгенных растений по сравнению с контрольными растениями. У трансгенных растений распространение зоны повреждения по всему листу было ограничено и более 90% растительной ткани оставалось зеленой в течение всего времени эксперимента. Линии с растения с разным уровнем экспрессии цекропина Р1 различались по устойчивости к фитопатогенам.

• Отработана методика поддержания культуры трансгенных растений каланхоэ путем вегетативного размножения, обеспечивающего устойчивость экспрессии трансгена.

Вегетативное размножение каланхоэ проводили 3-мя способами: стеблевыми черенками, листовыми черенками и листовыми пластинками. Для размножения каланхоэ стеблевыми черенками использовали верхушечные побеги, высотой 5-8 см, срезая их по диагонали. Готовый черенок помещали в грунт, в котором он прорастал при умеренном поливе и освещении. Для размножения листовых черенков их помещали в воду на несколько дней, после появления корней пересаживали лист в емкость с земляным субстратом. При размножении листовыми пластинками целый лист клали на влажную поверхность и через несколько дней по краю листа образовывались «детки» с уже образовавшимися корнями, которые можно пересаживать в грунт. Почву для пересадки использовали нейтральную или слабокислую (рН 5,5-6,5), состоящую из торфа и песка в соотношении 1:1 с добавлением минеральных удобрений. На дне горшка обеспечивали хороший дренаж. Эффективность вегетативного способа размножения листовыми пластинками в 10 раз выше по сравнению с другими способами. Экспрессия цекропина Р1 при вегетивном размножении использованными способами оставалась на стабильном уровне.

• Проведена сравнительная оценка специфического метилирования гена цекропина Р1 и его промоторной области в безмаркерных и маркерных трансгенных растениях каланхоэ перистого.

Проведена оценка специфического метилирования промоторной области (35S РНК вируса мозаики цветной капусты) гена цекропина Р1 в безмаркерных и маркерных трансгенных растениях каланхоэ перистого. Анализ проводился методом бисульфитного секвенирования ДНК, при этом при обработке одноцепочечной ДНК раствором бисульфита натрия и последующей щелочной десульфонации, неметилированые остатки цитозина конвертируются в урацил. Картина метилирования гена цекропина Р1 характеризуется выраженной мозаичностью. Отмечено снижение уровня метилирования 35S промотора гена цекропина Р1 в условиях культивирования трансгенных маркерных растений в присутствии канамицина по сравнению с растениями, культивируемыми на среде без канамицина. Это изменение может указывать на повышение уровня экспрессии цекропина в присутствии антибиотика и координированное участие генов неомицинфосфотрансферазы и цекропина Р1 в интегрированной системе защиты растений.

• Проведено исследование устойчивости поддержания метилирования гена цекропина Р1 в условиях вегетативного размножения трансгенных растений каланхоэ перистого.

Трансгенные растения проявили устойчивость поддержания метилирования промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и структурной области гена цекропина Р1 на стабильном уровне в условиях размножения тремя вегетативными способами.

• Подготовка промежуточного отчёта о результатах НИР

Промежуточный отчет о результатах НИР был подготовлен в соответствии с установленной формой для отчетов о выполнении проекта и о целевом использовании средств по Соглашению № 14.607.21.0016.

• Подготовка научных публикаций.

В рамках проекта 1 статья была опубликована, 2 приняты и 1 сдана в печать в рецензируемых журналах, индексируемых в базе данных Web of Science:

1. 1. Захарченко H.C., Стрижов Н.И., Школьная Л.A., Пиголева С.В., Лебедева А.А., Рукавцова Е.Б., Фурс О.В., Шевчук Т.В., Дьяченко О.В., Бурьянов Я.И. Новая экспрессионная система для повышенного синтеза антимикробного пептида цекропина Р1 в растениях. Физиология растений. 2015. Т. 62. № 4. С. 571-578.
2. Захарченко H.C., Лебедева A.A., Фурс O.B., Рукавцова Е.Б., Шевчук T.B., Родионов И.Л., Бурьянов Я.И. Получение безмаркерных растений каланхоэ (Kalanchoe pinnata L.), экспрессирующих ген антимикробного пептида цекропина Р1. Физиология растений. 2016. Т. 63, № 2. С. 290-299.
3. Н.С. Захарченко, Е.Б. Рукавцова, Т.В. Шевчук, О.В. Фурс, С.В. Пиголева, А.А. Лебедева, И.А. Чулина, Л.К. Байдакова, Я.И. Бурьянов. Получение и характеристика растений Kalanchoe pinnata L., экспрессирующих искусственный ген антимикробного пептида цекропина Р1. Прикладная биохимия и микробиология. 2016. № 4.
4. Т.В. Шевчук, Н.С. Захарченко, С.В.Тарлачков, О.В. Дьяченко, С.В. Пиголева, Е.Б. Рукавцова, О.В. Фурс, Я.И. Бурьянов. Метилирование 35S в канамицин-устойчивых растениях, экспрессирующих трансген антимикробного пептида цекропина Р1. Физиология растений. 2016.

• Подготовлены 2 патентные заявки по теме ПНИ.
• Индустриальным партнером (ООО «ЭдиВак») и ФИБХ РАН проведено материально-техническое обеспечение выполнения экспериментальных работ этапа за счет привлекаемых внебюджетных средств, при выполнении прикладных научных исследований (проекта).

Все результаты выполнены в установленные сроки в соответствии с планом графиком исполнения обязательств и условиями технического задания Соглашения № 14.607.21.0016 о предоставлении субсидии от 5 июня 2014 г.

25 декабря 2015 г.

25 декабря 2015 года

<form action="" method="post" class="commentForm" id="commentForm-{0}"> <input type="hidden" name="pressId" value="1507" /> <input type="hidden" name="parentId" value="{1}" /> <input type="hidden" name="id" value="{2}" /> <txt name="comment_text" id="comment_text">{3}</txt> <input type="button" class="button" value="Комментировать" /> <a class="button" href="javascript:void(null)">Отмена</a> <span class="wait">Подождите немного...</span> <div class="clear"></div> </form>