Инженерия Т-клеток человека сделала революцию в онкологии. Разработка CAR-T терапии привела к значительному успеху в лечении В-клеточного лейкоза. Критическим этапом технологии является наработка in vitro из донорских аутологичных Т клеток CAR-T с заранее заданной антигенной специфичностью. Для разработки специфического улучшенного протокола экспансии CAR-T-клеток предложено использовать клеточные мембранные везикулы стабильно экспрессирующие поверхностно-связанные антигены CAR. В опытах in vivo продемонстрировано что антиген-специфические везикулы способны вызывать более сильную стимуляцию, пролиферацию и функциональную активность CAR-T-клеток. Новая методология значительно расширит возможности получения улучшенных популяций функциональных CAR-T-клеток для терапии рака.

Определено время полужизни убиквитина в клетках млекопитающих (4 часа)

Показано, что усреднённо в клетке белки конъюгированы с 6 остатками убиквитина

Выявлено, что молекула убиквитина участвует в среднем в 16 циклах конъюгации, а безвозвратные потери убиквитина составляют одна молекулу на 4 акта захвата полиубиквитинированного субстрата протеасомой

Аминокислотный остаток UbK27 является критичным в терминах внутриклеточной стабильности убиквитина в целом

Грамотрицательные бактерии представляют собой серьезную угрозу из-за их внутренней и приобретенной устойчивости к антибиотикам. Многие современные лекарственные препараты-кандидаты демонстрируют заметную антимикробную активность против грамположительных бактерий, но неэффективны против грамотрицательных.

Сверхвысокопроизводительные методы скрининга на основе микрофлюидики представляют собой новую парадигму для глубокого анализа антибактериальной активности и открытия антибиотиков. Ключевой этап этой технологии основан на совместном культивировании одной клетки из выбранного микробиома вместе с репортерным флуоресцентным патогеном в эмульсии и последующим отбором свободных от репортера капель с использованием технологии FACS.

В Лаборатории химии протеолитических ферментов была разработана панель репортерных штаммов грамотрицательных бактерий Escherichia coli для обеспечения живых биосенсоров для точного мониторинга антимикробной активности. Мы создали репортерные штаммы для стабильного, гомогенного, высокого уровня продукции зеленого флуоресцентного белка (GFP) в E. coli. Две альтернативные стратегии, основанные на (i) высокоэффективном конститутивном промоторе pJ23119 и (ii) ослабленном контроле промотора Т7, сделали возможным чувствительное флуоресцентное обнаружение роста и уничтожения бактерий. Разработанные живые биосенсоры были применены для скрининга почвенного микробиома, что в результате использование сверхвысокопроизводительного скрининга почвенного микробиома позволило отобрать штамма Paenibacillus polymyxa P4. Геномный и метаболомный анализ позволил идентифицировать антибиотик колистин (полимиксин E) и кластер генов его биосинтеза, опосредующий активность антибиотика. Таким образом, живые биосенсоры могут быть эффективно использованы для открытия антибиотиков / пробиотиков, мониторинга окружающей среды и синтетической биологии.

Сотрудниками группы молекулярной физиологии, лаборатории клеточной биологии рецепторов, лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии и лаборатории моделирования биомолекулярных систем, впервые проведены исследования роли трансмембранного домена в активации рецепторной тирозинкиназы IRR. Для этого использовали два подхода: сначала с помощью молекулярного моделирования мы определяли трехмерную структуру трансмембранной части рецептора IRR в липидной среде, что позволило нам интерпретировать результаты мутагенеза. Во-вторых, были получены мутантные формы рецептора IRR с заменами в трансмембранном домене и проведен анализ pH-чувствительности этих мутантов.

Было показано, что наибольший эффект имеют двойные замены аминокислотных остатков (V929E, G930R) и (A938E, A939R) (Рис. 1). Данные мутации могут стабилизировать гомодимер рецептора IRR в активной конформации и приводят к сильному базальному фосфорилированию рецептора при нейтральных значениях pH среды, что также сопровождается активацией внутриклеточных сигнальных путей.

Для эффективного лечения COVID-19 необходимо создание новых средств таргетной терапии, нацеленных непосредственно на вирус SARS-CoV-2. Основными кандидатами на роль таких средств являются препараты на основе антител. Помимо преимуществ – длительного времени действия после введения в кровоток и низкой иммуногенности – у моноклональных антител традиционной структуры есть и недостатки – слабая тканевая проницаемость, что затрудняет их воздействие на распространение вируса по легочному эпителию. Таких недостатков лишены фрагменты однодоменных антител – нанотела, получаемые из иммуноглобулинов животных семейства верблюдовых, обладающие компактным размером (~15 кДа), высокой стабильностью в различных средах и хорошей проникающей способностью. Мы иммунизировали двух животных (альпак) рекомбинантным шиповидным белком (Spike) SARS-CoV-2 и рецептор-связывающим доменом (RBD) этого белка, и провели селекцию нанотел из иммуноглобулиновых клонотек методом фагового дисплея. В результате селекции была получена панель нанотел, специфично связывающихся со Spike с аффинностью в диапазоне 10-7 – 10-10 М. В экспериментах in vitro, среди идентифицированных кандидатных нанотел 7 вариантов проявили способность блокировать взаимодействие Spike и рецептора ACE2, который используется вирусом для проникновения в клетку. В опытах с использованием репортерной системы – лентивирусного вектора, псевдотипированного белком Spike – 6 вариантов нанотел показали нейтрализующую активность, для пяти нанотел она была затем подтверждена в экспериментах по нейтрализации живого вируса SARS-CoV-2. Идентифицированные нейтрализующие нанотела могут быть использованы для терапии COVID-19, причем компактный размер и высокая стабильность таких молекул могут позволить их применение в виде ингаляционно-вводимого препарата. Такой путь введения позволяет достичь высоких концентраций действующего вещества непосредственно на слизистых оболочках легких, что необходимо для подавления внутрилегочного распространения вируса.

Была трансдуцирована каталитическая субъединица теломеразы человека (hTERT) в популяции и клональные культуры NK-клеток.

Условия трансдукции были оптимизированы для повышения эффективности за счет активации клеток фидерными клетками IL-2 и K562-mbIL21.

Сверхэкспрессия hTERT умеренно влияла на фенотип и дегрануляцию NK-клеток, увеличивала пролиферативный потенциал и увеличивала продолжительность жизни трансдуцированных культур NK-клеток, но не приводила к истинной иммортализации.

NK-клетки играют важную роль в борьбе с туберкулезной инфекцией: они не только способны убивать инфицированные клетки, но также контролировать активность макрофагов и развитие адаптивного иммунного ответа. Мы в сотрудничестве с Институтом туберкулёза и Институтом биологии развития обнаружили, что увеличение субпопуляции NK-клеток, экспрессирующих HLA-DR - подтип MHC класса II, в периферической крови туберкулезных больных ассоциировано с пролиферирацией этих клеток в ответ на стимуляцию in vitro суспензией разрушенных ультразвуком клеток Mycobacterium tuberculosis . Активированные HLA-DR+ NK-клетки имели менее дифференцированный фенотип и повышенную экспрессию рецепторов NKp30 и NKp46, а также интенсивнее продуцировали IFNγ в ответ на микобактериальные антигены. Кроме того, было продемонстрировано, что HLA-DR+ NK-клетки после предварительной инкубации с микобактериями способны стимулировать HLA-DR-опосредованную активацию аутологичных CD4+ Т-клеток. Таким образом, функционально активные HLA-DR+ NK-клетки могут быть важным связующим звеном между врожденным и адаптивным иммунитетом.

Повышенный уровень внеклеточного HSP70 был обнаружен в сыворотке периферической крови и мокроте пациентов с астмой, а также в жидкости бронхоальвеолярного смыва мышей с индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей. В представленном обзоре АТФ-азная и шаперонная активности HSP70 рассмотрены с точки зрения регуляции иммунного ответа при астме. Учитывая решающую роль хронического воспалительного ответа при астме, понимание эффектов HSP70 может открыть новые перспективы терапевтического контроля воспаления.

Проведена I фаза клинических испытаний инновационного радиофармпрепарата ^99mTc-DARPin G3, созданного на основе меченного ^99мтехнецием рекомбинантного адресного полипептида DARPin G3 и предназначенного для радионуклидной диагностики рака молочной железы с гиперэкспрессией HER2/neu. Показано, что визуализация экспрессии опухолевого маркера HER2/neu с использованием ^99mTc-DARPin G3 безопасна, обеспечивает низкую дозовую нагрузку на организм и хорошо переносится пациентами. Полученные изображения опухолей позволяют достоверно различать HER2-положительный и HER2-отрицательный рак груди, позволяя врачу выбрать обоснованный протокол лечения. Успешные результаты I фазы клинических испытаний служат основанием для дальнейшей клинической разработки диагностического радиофармпрепарата ^99mTc-DARPin G3.

Разработан магнитно-спектральный неинвазивный подход для прижизненного мониторинга циркуляции наночастиц в кровотоке и деградации магнитных частиц (МЧ) в организме экспериментальных животных. Впервые проведено комплексное исследование долговременной судьбы 17 типов частиц оксида железа в зависимости от 5 изменяемых параметров частиц. Показано замедление биотрансформации МЧ при увеличении их дозы, а также зависимость скорости деградации МЧ от их размера, внутренней структуры и типа внешнего покрытия. Разработано покрытие частиц для блокировки их элиминации системой мононуклеарных фагоцитов, что позволило продлить период полувыведения функциональных частиц из кровотока в 18 раз. Более глубокое понимание процессов биотрансформации и деградации частиц in vivo может способствовать рациональному дизайну нано- и микрочастиц с предсказуемой долгосрочной судьбой in vivo.

По сравнению с нормальными клетками внеклеточное пространство раковых клеток имеет пониженные показатели рН. C помощью методов генной инженерии в лаборатории были получены гибридные конструкции флуоресцентного белка (EGFP) и пептида (pHLIP), которые при понижении рН ниже 6.8 специфически связываются с мембраной клетки. Предполагается, что такие гибридные конструкции могут быть использованы при разработке новых подходов в диагностике и нацеленной терапии рака.

Толл-подобные рецепторы являются ключевыми участниками врожденного иммунитета. Несмотря на большое количество исследований и данных об этих белках, структурно-функциональные основы их работы до сих пор не до конца ясны. Было проведено комплексное исследование структуры TIR домена TLR1. Для этого пространственная структура домена была определена двумя методами - ЯМР-спектроскопии в растворе и рентгеноструктурного анализа в кристаллах. Сравнение структур выявило отличие в области, содержащей два остатка цистеина, что навело на мысль о существовании возможного взаимодействия домена рецептора с ионами цинка. Для проверки этой гипотезы была проведена серия экспериментов по изучению связывания TIR домена с ионами различных металлов, содержащихся в цитоплазме клетки. Выяснилось, что именно цинк связывается с TIR доменом специфически в наномолярных концентрациях. Кроме того, оказалось, что происходит образование двух конкурирующих комплексов TLR1/Zn. С использованем подходов на основе точечного мутагенеза белка и компьютерного моделирования удалось обнаружить ключевые остатки, участвующие во взаимодействии. Компьютерный эксперимент показал, что цинк может стабилизировать важный участок TIR домена в двух различных состояниях. Чтобы понять, насколько обнаруженное взаимодействие белка с цинком важно для работы рецептора, была изучена активность TLR1 в живых клетках. Оказалось, что изменение концентрации цинка влияет на активность TLR1, а мутация ключевого остатка цистеина приводит к полной потере активности рецептора.

Нейротрофины и их рецепторы участвуют в большом количестве жизненно важных процессов в нейронах. Каскады запускаемых ими реакций влияют на пролиферацию, дифференциацию, нейропластичность, программируемую смерть клетки и др. Такое большое разнообразие биологических ответов сложно объяснить наличием всего 4 рецепторов и 4 лигандов. Предполагается, что широкий спектр событий может объясняться за счет взаимодействия рецепторов нейротрофинов между собой. В рамках работы по изучению нейротрофиновых рецепторов TrkA и P75 было обнаружено взаимодействие между трансмембранными доменами этих белков и описаны интерфейсы гетеродимеризации. Кроме того, было показано, что константы гомо- и гетеродимеризации рецепторов сравнимы между собой, что говорит в пользу гипотезы о прямом взаимодействии рецепторов в клетке.

Болезнь Альцгеймера - самый распространенный в мире вид нейродегенеративного заболевания. В патогенезе болезни задействованы различные пептиды и белки, в том числе бета-амилоидный пептид (Aβ). Известно, что все изоформы Aβ склонны к ассоциации, и именно олигомеры играют решающую роль в патогенезе болезни Альцгеймера, оказывая токсическое действие на нейроны и их органеллы. Немецкими учеными был создан D-энантиомерный пептид D3, который участвует в разрушении цитотоксических малых олигомеров Aβ. В рамках работы по изучению этого белка было показано, что D3, стабилизирующий мономерный Aβ, динамически взаимодействует с прилегающей к мембране областью мембранного белка предшественника β-амилоида— трансмембранного фрагмента APP672-726 (Aβ1-55). На основе данных ЯМР и молекулярного моделирования было показано, что D3 нацелен на амилоидогенную область Aβ, тем самым ингибируя ранние стадии перехода пептида Aβ в β-конформацию, характерную для малых токсичных олигомеров. Было обнаружено, что D3 и Aβ1-55, являясь неупорядоченными белками, при взаимодействии образуют подвижный, но устойчивый комплекс, в котором конформации обоих полипептидов постоянно изменяются с изменением паттерна межмолекулярных контактов. Такие динамические межмолекулярные взаимодействия D3 пептидов лежат в основе их молекулярного механизма разрушения цитотоксических β-амилоидных олигомеров, а именно подавления контактов между Aβ пептидами и сохранения их в α-спиральной конформации, что предотвращает их переход в β-тяжи.

При исследовании белков, как правило, основной интерес представляют «hotspots» - их функционально-активные участки, которые ответственны за ключевые процессы в каскаде биологических реакций. Метод ЯМР-спектроскопии позволяет на атомном уровне взглянуть на эти процессы, однако, классические подходы неизменно включают стадию полного отнесения сигналов белка, что ресурсозатратно как в плане приборного, так и рабочего времени. Это зачастую является «узким местом» в драг-дизайн и существенным сдерживающим фактором для выполнения проекта в кратчайшие сроки. Разработанная методика FOSY (FOcused SpectroscopY) позволяет преодолеть данные ограничения, проводя отнесение сигналов интересующего участка в течение нескольких часов без последующего трудозатратного анализа полученных спектров. Апробация данного подхода была успешно проведена на Тау-белке (441 а.о.), для которого ранее не удавалось получить полного и достоверного отнесения сигналов, необходимого для обнаружения его функционально-активных сайтов посттрансляционных модификаций. Применения методики FOSY позволило достоверно определить два ключевых сайта фосфорилирования. А как известно, избыточное фосфорилирование Тау-белка при болезни Альцгеймера и Паркинсона приводит к образованию нейрофибриллярных клубков и патологиям стабилизации аксональных микротрубочек.

Ионный канал TRPV3 — один из представителей ванилоидного подсемейства термочувствительных каналов TRP (термо-TRP), экспрессирующийся преимущественно в клетках кожи (кератиноцитах). TRPV3 участвует в работе систем организма ответственных за кожную чувствительность, включая чувствительность к повышенным температурам (>31-39° C) и зуду, ноцицепцию (болевую чувствительность), поддержание кожного барьера, заживление ран, рост волос, эмбриональное развитие. Коллегами из Колумбийского университета (США) методом криоэлектронной микроскопии получены атомарные структуры белка в трех состояниях: закрытом, сенситизированном (переходном) и, впервые, - открытом при помощи температуры. На основании структурных данных был предложен механизм термоактивации канала, который сопровождается т.н. «конформационной волной» перестроек полипептидной цепи белка и его липидного окружения. Моделирование молекулярной динамики (МД) позволило охарактеризовать проводимость ионов и молекул воды через пору TRPV3 в различных состояниях и проследить за динамикой ключевого липида в т.н. «ванилоидном кармане». Эти липиды, по-видимому, играют роль своеобразных «плавких предохранителей», регулирующих перестройки белка в ответ на изменение температуры.

В сотрудничестве с учеными из Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова, Монреальского университета (Канада), Центрального научно-исследовательского института лекарственных средств (Индия) и Онкологического центра Фокс Чейз (США).

PARP1 - это фермент, участвующий в репарации ДНК, организации хроматина и транскрипции. С помощью микроскопии spFRET, молекулярной динамики и биохимических подходов было идентифицировано несколько различных комплексов PARP 1-нуклеосома и два типа связывания PARP1 с нуклеосомами.
Было обнаружено, что две или три молекулы PARP1 связываются с нуклеосомой в зависимости от наличия линкерной ДНК и индуцируют реорганизацию всей нуклеосомы не зависимо от каталитической активности PARP1.
Полученные данные свидетельствуют, что PARP 1 может индуцировать образование альтернативного состояния нуклеосомы, которое, вероятно, участвует в регуляции генов и репарации ДНК.

С помощью спектроскопии ЯМР была исследована структура вискотоксина А3 (VtA3) в мембраномоделирующих средах — мицеллах детергентов. Вискотоксин А3 относится с семейству тионинов — небольших (∼5 кДа) катионных пептидов, участвующих в процессах иммунного ответа у растений. Этот пептид выделен из полупаразитического растения омелы белой (Viscum album), являющейся традиционным рождественским украшением в Англии. Для VtA3 показана антимикробная и цитотоксическая активность против раковых клеток, а также способность связываться с мембранами, содержащими анионные липиды, и формировать ионные каналы. Пространственная структура VtA3, включающая спиральную шпильку и короткий β-лист, была стабильной и не претерпевала значительных изменений при связывании с мицеллой. Молекула VtA3 с высокой афинностью связывалась с поверхностью мицеллы цвиттерионного додецилфосфохолина (DPC) гидрофобным участком в спиральной шпильке. Олигомеризация VtA3 наблюдалась в анионных мицеллах додецилсульфата натрия (SDS). Прямых контактов между молекулами пептидов не наблюдалось, однако, полученные данные позволили предположить, что мембранная активность VtA3, в зависимости от концентрации, соответствует модели «тороидальной поры», либо «ковровому» механизму. Предложена модель комплекса, разрушающего мембрану, объясняющая образование ионных каналов в частично анионных мембранах.

В то время как наследственность в целом определяется последовательностью нуклеотидов в ДНК, конкретная реализация генетической информации в каждом типе клеток и в каждой отдельно взятой клетке — результат действия сложнейших эпигенетических механизмов, основанных на управлении экспрессией генов в зависимости от контекста, создаваемого на данном участке ДНК хроматином. Один из эпигенетических механизмов — система химической модификации гистонов, «помечающая» хроматин как активный или неактивный, с множеством нюансов, до конца еще не понятых исследователями. Обработкой и ремоделированием хроматина занимаются сложные белковые комплексы, отдельные субъединицы которых служат «системой наведения», распознающей те или иные типы хроматиновых модификаций. В этой работе, выполненной в кооперации с Институтом биологии гена, построена пространственная модель одной из таких «наводящих» субъединиц — белка PHF10 из комплекса PBAF; и проведен подробный структурный анализ «карманов», за счет которых он распознает модификации гистонов H3 и H4.

Низин — один из самых интересных антимикробных пептидов (АМП), избирательно действующий на молекулу липида II в мембране бактерий, тормозя синтез клеточной стенки и напрямую уничтожая мембрану. Хотя сам по себе он не может быть лекарством (из-за плохой фармакокинетики и давнего применения в качестве консерванта), механизм распознавания этим АМП своей мишени называют перспективным для разработки новых антибиотиков, не подверженных быстрому появлению резистентности у микроорганизмов. В предшествующем исследовании с помощью молекулярного моделирования мы расшифровали этот механизм: это система направленных в единый центр доноров водородной связи от полициклического каркаса низина, «захватывающая» пирофосфатную группировку — принципиальную структурную детерминанту липида II. В этой работе мы показали, что близкие к низину пептиды — эпидермин и галлидермин — работают примерно так же, несколько превосходя низин по связывающей способности. Также мы in silico предложили мутантный вариант низина, обладающий улучшенным связыванием с мишенью, заложив базу для теоретического дизайна новых антибиотиков с описанным механизмом действия.

Шапероны — это белки, которые ускоряют фолдинг других белков и предотвращают губительную для клетки агрегацию «неправильно» сложенных белков, помогая им принимать правильную пространственную структуру. Однако из этого правила есть исключение — полагают, что взаимодействие молекулярного шаперона GroEL с нормальной изоформой прионного белка PrPC может приводить к ее трансформации в патогенную, предрасположенную к агрегации форму PrPSc. Совмещая методы криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) и молекулярного моделирования, нам удалось впервые установить молекулярные основы взаимодействия GroEL—PrP. Известно, что в сворачивании белка-субстрата участвуют C-концевые фрагменты субъединиц GroEL, о которых, ввиду их неупорядоченной организации, очень мало структурной информации. Перед началом изучения механизма сворачивания белков в полости GroEL, мы получили с помощью крио-ЭМ 3D структуру апо-формы GroEL, дополнив ее теоретическими расчетами относительно положения С-концевых фрагментов. Далее, мы показали, что PrP асимметрично связывается с несколькими субъединицами GroEL на уровне их апикальных доменов. Согласно моделированию, любой из двух доменов PrP потенциально может формировать контакты с GroEL, однако неупорядоченный N-домен PrP образует энергетически более выгодный комплекс с GroEL, чем его C-домен. Интересно отметить, что при погружении в полость GroEL структурированного С-домена PrP, он частично терял свою вторичную структуру в ходе моделирования МД, тогда как неупорядоченный N-домен, напротив, содержал большее количество элементов вторичной структуры, по сравнению с N-доменом в воде.

Возможным способом подавления миграции опухолевых клеток может быть усиление адгезии между опухолевыми и стромальными клетками в первичных солидных опухолях. Ранее мы обнаружили, что эктопическая экспрессия эмбрионального регулятора поджелудочной железы PDX1 снижает in vitro и in vivo потенциал миграции раковых клеток поджелудочной железы. В новом исследование мы показали, что это происходит за счет увеличения их адгезивности и снижения чувствительности к TGFβ1-индуцированному эпителиально-мезенхимальному переходу. Был проведен транскриптомный анализ клеток двух линий рака поджелудочной железы PANC1 и Colo357 с эктопической экспрессией гена PDX1. Используя РНК-секвенирование (RNA-seq) мы впервые описали транскриптомный профиль линии Colo357. Были выявлены дифференциально экспрессирующиеся гены и функциональные категории генов в клетках линий рака поджелудочной железы при эктопической экспрессии гена PDX1. Анализ генов с пониженным уровнем экспрессии показал обогащение категориями генов, связанными с клеточной подвижностью, адгезией, мезенхимальной дифференцировкой, сигналингами от рецепторов на поверхности клеток. Гены с увеличенным уровнем экспрессии, были обнаружены в генных категориях, связанных с регуляцией транскрипции и клеточного цикла. Данные транскриптомного анализа подтвердили обнаруженный in vitro и in vivo эффект эктопической экспрессии гена PDX1 в клетках линий PANC1 и Colo357. Результаты анализа направленной и ненаправленной миграции клеток и результаты, полученные на организменной модели метастазирования (на эмбрионах Danio rerio), показали снижение миграционного потенциала клеток PANC1 и Colo357, экспрессирующих ген PDX1. Нами было продемонстрировано увеличение адгезивности раковых клеток, экспрессирующих PDX1, к белкам внеклеточного матрикса коллагену I типа и фибронектину, а также к полилизину, и показано, что эктопическая экспрессия PDX1 также снижает чувствительность клеток к TGFβ1.

Полученные результаты дают дополнительные аргументы PDX1 как потенциальному антиметастатическому агенту.

Малая некодирующая РНК F6 присутствует в геномах всех микобактерий. На модельном объекте Mycobacterium smegmatis мы показали, что F6 контролирует процесс перехода бактерии в покоящееся состояние. Делеция F6 приводит к повышению экспрессии генов, вовлеченных в ответ на окислительный стресс, а также гена фактора ресусцитации RpfE2. Непосредственное взаимодействие F6 с мРНК гена rpfE2 подавляет синтез белка RpfE2, участвующего в гидролизе бактериальных пептидогликанов, что приводит к существенному снижению способности микобактерий переходить в состояние метаболического покоя.

Впервые исследована in vivo регуляция синтеза рибосомных белков у микобактерий Mycobacterium smegmatis и Mycobacterium tuberculosis на примере гена rpsO, кодирующего белок S15. Доказан механизм аутогенной репрессии на уровне инициации трансляции, в основе которого лежит связывание белком S15 регуляторной области на своей мРНК, формирующей структуру типа «псевдоузел», что указывает на поразительное сходство с механизмом регуляции S15 у E. coli несмотря на значительное филогенетическое расстояние между этими организмами.

В отличие от холоднокровных позвоночных (рыб, амфибий и пресмыкающихся), теплокровные (птицы и млекопитающие) не способны регенерировать конечности и хвост, в случае их потери. Ранее мы выдвинули гипотезу о связи между ослаблением регенеративных способностей у теплокровных и утратой у них некоторых генов, регулирующих регенерацию у холоднокровных. В поддержку данной гипотезы было показано, что среди немногочисленных генов, утраченных теплокровными позвоночными, действительно есть гены, активирующиеся при регенерации, в частности, ген секретируемой дисульфид изомеразы Ag1. На модельном объекте - головастиках шпорцевой лягушки Xenopus laevis - мы продемонстрировали, что в хорошем соответствие с гипотезой нокдаун ag1 снижает способность к регенерации хвоста. При этом добавление рекомбинантного белка Ag1 в среду с головастиками, находящимися в рефрактерном периоде (в это время способность к регенерации хвоста исчезает по естественным причинам), индуцирует регенерацию хвоста.

Сотрудники Группы геномного анализа сигнальных систем клетки провели системный анализ генов, чья экспрессия связана с прогрессией злокачественного рака мозга (глиобластомы).

В результате удалось обнаружить новый высокоэффективный маркер плохого прогноза этого заболевания – уровень экспрессии некодирующей РНК CRNDE, который обратно коррелировал с выживаемостью пациентов. Мутационные маркеры, по-видимому, в значительной мере исчерпали свой потенциал, тогда как маркеры, основанные на уровне экспрессии генов, являются новой «восходящей звездой» молекулярной онкологии. В исследование включили несколько сотен экспрессионных профилей образцов глиобластомы, связанных с информацией о выживаемости пациентов, из нескольких наборов данных, собранных для пациентов из России, США, Евросоюза и Китая. Потенциальные маркеры, обнаруженные при анализе публичных баз данных, валидировали на экспериментальном материале, полученном в рамках сотрудничества с Медицинским факультетом Университета Любляны, (Словения), МФТИ, Сеченовским университетом, Институтом Онкологии (Словения), компанией Омиксвей, а также Европейской организацией исследования и лечения рака (EORTC). В результате статистической фильтрации данных, был обнаружен единственный ген, демонстрирующий высокий биомаркерный потенциал во всех исследованных наборах данных: ген некодирующей РНК CRNDE.

Результаты исследования свидетельствуют о возможности его включения в клиническую практику наряду с немногочисленными уже существующими биомаркерами глиобластомы: мутациями генов IDH1-2, метилированием промотора гена MGMT и делециями некоторых хромосомных участков.

Рисунок 1. Показатели общей выживаемости в группах пациентов с глиобластомой с низким (синий) и высоким (красный) уровнем экспрессии некодирующей РНК CRNDE в наборах данных (A) CGGA_325, (B) CGGA_693, (C) TCGA и (D) в экспериментальном наборе пациентов из Словении. Результаты указывают на экспрессию CRNDE как надежный негативный прогностический маркер выживаемости при глиобластоме (p = 0.013–0.046 для трех сравнений из четырех; тренд также сохраняется в четвертом сравнении).

Использование селективных промоторов в составе противоопухолевых генотерапевтических препаратов способно снижать системную токсичность терапии. Клетки микроокружения опухоли, представленные в основном опухоль-ассоциированными фибробластами (ОАФ), могут выступать мишенью для противопухолевой генной терапии. Однако, малоизвестно какие промоторы могут быть использованы для контроля экспрессии терапевтических генов в ОАФ.

Мы предположили, что промоторы генов с повышенной экспрессией в ОАФ могут обеспечивать селективность экспрессии трансгена в ОАФ. Было выбран ряд ОАФ-специфичных генов. Активность экспрессии трансгенов, находящихся под контролем промоторов ОАФ-специфичных генов и конститутивных промоторов, была изучена в экспериментах in vitro на раковых и стромальных клетках человека и мыши, а также в опухолевой модели in vivo. Показано, что исследуемые промоторы не различаются по селективности экспрессии трансгена, но отличаются по силе. Показано, что экспрессия трансгена в фибробластах может быть обеспечена на высоком уровне при использовании универсальных промоторов (CMV, SV40, PCNA). Интересно, что профили активности промоторов относительно друг друга сохранялись как в клеточных линиях человека и мыши, так и в клетках опухоли. Полученные нами данные могут быть использованы для рационального дизайна противоопухолевых генотерапевтических препаратов.

Фосфолипазы А2 (ФЛА2) из змеиного яда защищают клетки Vero E6 от цитопатического эффекта SARS-CoV-2. ФЛА2 показали низкую цитотоксичность по отношению к клеткам Vero E6, которая проявлялась при микромолярных концентрациях, но сильную противовирусную активность, обнаруживаемую при наномолярных концентрациях. ФЛА2 гадюки Никольского (Vipera nikolskii) проявила особенно сильный вирулицидный и противовирусный эффекты, связанные с фосфолиполитической активностью, и ингибировала слияние клеток, опосредованное взаимодействием гликопротеина S SARS-CoV-2 c ангиотензин-превращающим ферментом (АСЕ2). Более того, ФЛА2 препятствуют связыванию анти-АСЕ2 антител с ACE2 на поверхности клеток, а также рецептор-связывающего домена гликопротеина S с ACE2, что было показано методами проточной цитометрии и поверхностного плазмонного резонанса. Таким образом ФЛА2 могут предотвращать проникновение вируса в клетку, ингибируя его связывание с ACE2.

Из яда африканской кобры Naja melanoleuca выделены три новых α-нейротоксина, близкие по аминокислотным последовательностям известным нейротоксинам 1 и 2 из этого яда. Исследование их взаимодействия с ионотропыми рецепторами γ-аминомасляной кислоты (ГАМК-А) и различными подтипами никотиновых холинорецепторов (нАХР) показало, что все токсины взаимодействуют с ГАМК-А намного слабее, чем с нАХР. Анализ их взаимодействия с нАХР Torpedo californica, α7 и α9α10 подтипами рецептора человека выявил наномолярное сродство к первым двум мишеням и аффинность в диапазоне 30-100 нМ – к последнему. При этом один из выделенных токсинов (Tx-NM2) проявлял разное сродство к двум сайтам связывания на нАХР, а также проявил самое высокое сродство к нАХР α9α10 типа. Это первый описанный змеиный токсин, который демонстрирует такое высокое сродство к рецептору α9α10 человека, и поэтому представляет собой ценную основу для выяснения критических детерминант селективности α9α10 нАХР и разработки избирательных зондов для изучения этого подтипа нАХР.

Впервые установлено, что докозагексаноилдофамин (DHA-DA) наряду с арахидоноилдофамином (AA-DA) является лигандом сиротского рецептора GPR55 из семейства неклассических каннабиноидных рецепторов, который активируется лизофосфатидилинозитом(LPI) и стимулирует пролиферацию раковых клеток. Активация этого рецептора ацилдофаминами, напротив, приводит к индукции апоптоза раковых клеток. С использованием панели раковых клеток и набора ингибиторов рецепторв и внутриклеточных сигнальных путей, а также с помощью измерения сигнальных молекул (Ca2+, NO, ROS )и экспрессии генов мы впервые показали что DHA-DA и AA-DA индуцируют апоптоз через сверхстимуляциюнейрональной синтазы оксида азота с последующей индукцией оксидативного стресса. При комбинированном воздействии DHA-DA и LPI, цитотоксический эффект DHA-DA оказываетсясильнее про-пролиферативного действия LPI на раковые клетки, что может иметьтерапевтическое значение.

Рецептор-специфический вариант DR5-B противоопухолевого цитокина TRAIL был конъюгирован с наночастицами на основе поли-N-винилпирролидона Amph-PVP. В цитокин вводили остаток цистеина на N-конец для ковалентного связывания с наночастицами, полученными из смеси 1:1 немодифицированных и модифицированных малеимидом полимерных цепей. Цитотоксичность полученных наночастиц P-DR5-B исследовали на клеточных линиях аденокарциномы молочной железы MCF-7 и колоректальных карцином HCT116 и HT29. Было обнаружено усиление цитотоксичности TRAIL DR5-B, конъюгированного с наночастицами, по сравнению со свободным лигандом как в 2D (монослойная культура), так и в 3D (опухолевые сфероиды) моделях in vitro, причем конъюгация DR5-B с Amph-PVP-наночастицами сенсибилизировала DR5-B-резистентные опухолевые сфероиды MCF-7 и HT29. Конъюгация гидрофильных терапевтических белковых молекул на поверхности Amph-PVP-наночастиц с помощью клик-химии открывает новые возможности получения систем для направленной доставки лекарств в опухолевые клетки.

Предложен новый формат иммуноцитокина, представляющий собой комплекс биспецифического антитела и ИФН-β для таргетной терапии ErbB2-позитивных опухолей. Биспецифическое антитело B16/Tz было получено на основе двух антител: терапевтического антитела трастузумаб против онкомаркера ErbB2 и химеризованного нейтрализующего антитела B16 к ИФН-β, несущих мутации «выступ во впадину» в Fc-фрагменте, необходимые для корректной сборки биспецифической молекулы. Выбранный формат соответствует структуре полноразмерного иммуноглобулина класса IgG1, что определяет его высокую биологическую активность, взаимодействие с системой комплемента, продолжительный период полувыведения из крови и низкую иммуногенность. Разработанная молекула обеспечивает доставку эндогенного и экзогенного ИФН-β к опухоли и обладает нейтрализующей способностью в отношении ИФН-β, что предотвращает взаимодействие цитокина с рецептором в процессе доставки и позволяет тем самым снизить частоту потенциальных побочных эффектов. Взаимодействие биспецифического антитела с ИФН-β и ErbB2 было подтверждено методом «сэндвич»-ИФА, оценена и определена ИФН-β-нейтрализующая способность на линии клеток HT29 (IC50 = 49,3 µg/ml).

1. A.A.Rybchenko et al., Biomolecules. 2021, 11, 1915. Bispecific Antibodies for IFN-β Delivery to ERbB2 (IF 4,879, Q2).

2. А.А.Панина и соавт. Рекомбинантные биспецифические антитела к рецептору ErbB2 и интерферону-β человека. Acta Naturae. 2020. Т.12, № 2(45), С. 95-104. (IF 1,84, Q3).

3. Т.К.Алиев и соавт. Патенты РФ 2 748 953 от 02.06.2021 и 2 729 391 от 06.08.2020. 4. Лицензионный договор между ИБХ РАН и ООО «ФАРМАПАРК» № 33-НИЛ/2021 от 31.03.2021 г.

При изучении функциональной активности мутантных вариантов белка человека SLURP-1 мы выдвинули предположение, что кроме никотинового ацетилхолинового рецептора a7 типа (a7-nAChR) мишенями SLURP-1 могут выступать также и другие поверхностные рецепторы, участвующие в регуляции внутриклеточной сигнализации. Для проверки этого предположения мы использовали метод аффинной экстракции и показали, что в клетках аденокарциномы легкого A549 рекомбинантный SLURP-1 образует комплекс не только с a7-nAChR, но также с PDGFRa и EGFR. Взаимодействие SLURP-1 с этими рецепторами приводит к подавлению сигнального пути PI3K/AKT/mTOR и как следствие, к снижению пролиферацию и миграции клеток A549. Используя химерные белки с пересаженными фрагментами SLURP-1, мы показали, что петля I является основным функциональным элементом SLURP-1. Синтетический пептид, имитирующий петлю I, проявлял активность близкую к активности нативного SLURP-1 и может считаться прототипом нового противоопухолевого препарата.

Lypd6 представляет собой GPI-связанный белок из семейства Ly-6/uPAR, экспрессируемый в головном мозге. Чтобы исследовать холинергическую активность Lypd6, был получен рекомбинантный водорастворимый вариант белка человека (ws-Lypd6). Эксперименты с различными подтипами nAChR, экспрессируемыми в ооцитах Xenopus, выявили отрицательную аллостерическую модулирующую активность ws-Lypd6 в отношении a3b4- и a7-nAChR. При этом ws-Lypd6 не вызывал токи через nAChR в отсутствие ACh. Инкубация с 1 мМ ws-Lypd6 значительно подавляла вызванный холином ток через a7-nAChR в срезах гиппокампа крысы. Подобно змеиному нейротоксину a-бунгаротоксину, ws-Lypd6 подавлял долгосрочную потенциацию (LTP) в срезах гиппокампа мышей. В первичных кортикальных нейронах и нейронах гиппокампа была показана солокализация эндогенного GPI-связанного Lypd6 с a3b4- и a7-nAChR. Построена компьютерная модель взаимодействия Ws-Lypd6 с внеклеточным доменом a7-nAChR. Полученные результаты позволяют рассматривать Lypd6 как эндогенный негативный модулятор, участвующий в регуляции холинергической системы головного мозга.

Мы показали, что закисление внеклеточной среды увеличивает пролиферацию, миграцию и инвазию клеток метастатической меланомы, полученных от пациентов, и регулирует экспрессию на клеточной поверхности протон-чувствительных каналов, содержащих субъединицы ASIC1a, α-ENaC и γ-ENaC. Рекомбинантный аналог трехпетельного токсина мамбалгина-2 отменял вызванную закислением пролиферацию, миграцию и инвазию клеток метастатической меланомы, способствовал апоптозу и подавлял экспрессию проонкогенных факторов CD44 и Frizzled 4 и фосфорилирование фактора транскрипции SNAI на поверхности раковых клеток. С помощью конфокальной микроскопии и аффинной экстракции было показано, что мамбалгин-2 взаимодействует с гетеротримерными каналами ASIC1a/α-ENaC/γ-ENaC на поверхности клеток меланомы.

Химерные каналы KcsA-Kv1, имитирующие внешний сайт связывания поровых блокаторов калиевых каналов Kv1, используются для изучения аффинности лигандов Kv1- каналов. Разработана новая аналитическая система для изучения взаимодействия KcsA-Kv1 с блокаторами, включающая:
- сферопласты клеток E.coli, экспрессирующих в плазматической мембране флуоресцентно-меченые химерные каналы TagRFP-KcsA-Kv1;
- флуоресцентные генокодируемые лиганды GFP-ChTx и GFP-AgTx2;
- метод проточной цитометрии;
- оригинальную методику анализа данных проточной цитометрии для определения констант диссоциации (Kd) комплексов лигандов с каналами.

Преимущества аналитической системы: быстрота получения и обсчета данных, возможность высокопроизводительного скрининга лигандов, возможность мультиплексного анализа нескольких каналов-мишеней. Система может быть использована для скрининга блокаторов Kv1 каналов, в том числе, в целях разработки новых лекарственных средств на основе пептидных блокаторов.

Работа выполнена совместно с Биологическим факультетом МГУ.

Повышение концентрации протонов в синаптической щели при выбросе нейромедиаторов считается одним из возможных способов сенсибилизации постсинаптической мембраны, что в конечном итоге может приводить к развитию нейродегенеративных заболеваний или к нарушению когнитивных способностей. Одним из основных сенсоров закисления являются представители семейства кислото-чувствительных ионных каналов (ASIC). Одна из изоформ – ASIC3, которая обильно представлена на постсинаптической мембране ноцицепторов относится к перспективным мишеням для разработки терапевтических средств. Несмотря на высокую степень идентичности между ортологами ASIC3 каналов млекопитающих, имеется ряд различий, что осложняет простой перенос регистрируемых эффектов в животных тестах на эффекты, ожидаемые в клинической практике. Наиболее проблемно то, что человеческий ASIC3 канал (hASIC3), в отличие от канала крысы (rASIC3) при физиологическом значении внеклеточного рН 7.4 находится в состоянии очень слабой чувствительности к протонам. Мутагенез С-концевого внутриклеточного домена канала выявил причину аномального поведения hASIC3. Элиминирование или, в меньшей степени, блокирование этого участка hASIC3 приводит к восстановлению профиля тока (как у грызунов), регистрируемого в эксперименте whole-cell на гетерологически экспрессированных каналах, при активации мутантных каналов протонами или агонистом. Полученные результаты демонстрируют особую важность роли внутриклеточной регуляции ASIC3 каналов посредством внутриклеточного домена, которую необходимо учитывать далее в разработке тестов на животных моделях или при дизайне лекарственных препаратов.

Роль внеклеточного матрикса головного мозга (ВКМ) в регуляции синаптической пластичности остаётся недостаточно хорошо изученной. Мы показали, что ферментативное разрушение ВКМ с помощью хондроитиназы ABC (ChABC) вызывает появление новых глутаматергических синапсов на пирамидных нейронах в области CA1 гиппокампа. При этом уменьшается как средняя амплитуда миниатюрных возбуждающих постсинаптических токов, так и соотношение AMPA/NMDA токов, свидетельствуя о том, что новые синапсы являются непотенциированными. Однако несмотря на увеличение числа непотенциированных синапсов мы наблюдали снижение величины долговременной потенциации (LTP). Это происходило за счёт увеличения проводимости кальций-активируемых калиевых каналов малой проводимости (SK каналы) и снижения, таким образом, возбудимости пирамидных нейронов. Блокирование SK каналов восстанавливало возбудимость клеток и усиливало LTP выше контрольных значений. Усиление LTP подавлялось при блокировании Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK), которая участвует в перестройке цитоскелета и формировании дендритных шипиков. Таким образом, разрушение ВКМ может вызывать появление новых синапсов, что потенциально может применяться в регенеративной медицине. Однако этот процесс компенсируется снижением возбудимости постсинаптических нейронов, предотвращая перевозбуждение сети в ущерб синаптической пластичности.

Были проанализированы пространственно-временные характеристики кальциевой динамики астроцитов в слое stratum radiatum области CA1 гиппокампальных срезов головного мозга молодых мышей возрастом 2–3 месяца. Животные контрольной группы потребляли пищу ad libitum. Животные из группы сокращения калорий (СК) в течение одного месяца потребляли 70% калорий от нормы контрольных животных. В результате у животных группы СК астроцитарные кальциевые события стали короче по длительности и меньше по размеру. Астроцитарные кальциевые сигналы у мышей группы СК имели более высокую амплитуду и более высокие скорости нарастания и затухания. Эти изменения можно объяснить морфологической перестройкой астроцитов, индуцированной диетой.

СК-индуцированные изменения параметров астроцитарной кальциевой динамики были частично нивелированы ингибированием щелевых контактов/гемиканалов карбеноксолоном. Эффект карбеноксолона на кальциевую активность у СК животных был неожиданным, поскольку диета уже снижает связь щелевых контактов в астроцитарном синцитии. Это может отражать блокаду гемиканалов, также чувствительных к этому препарату. Таким образом, индуцированное СК морфологическая перестройка астроцитов отвечает за изменения паттерна кальциевой активности в астроцитарной сети.

Возрастные изменения в структуре и функциях астроцитов и их влияние на снижение когнитивных функций в стареющем мозге на сегодняшний день недостаточно изучены. Используя двухфотонную микроскопию в сочетании с трехмерной реконструкцией, анализом по Шоллю и анализом объемной фракции неразрешённых астроцитарных отростков, мы показали значительное снижение площади территориальных доменов астроцитов, сокращение количества и длины оптически разрешённых астроцитарных отростков, снижение объёмной доли терминальных (оптически не разрешённых) отростков, снижение числа межастроцитарных клеточных контактов в стареющем мозге мышей С57Bl6. Исследование физиологии астроцитов с помощью фиксации астроцитарных токов методом патч-кламп и визуализации кальциевых сигналов выявили снижение калиевого тока и удаления глутамата, а также пространственно-временную реорганизацию кальциевых событий в астроцитах стареющих животных. Эти изменения происходили на фоне нарушения синаптической долговременной потенциации (LTP) в CA1 гиппокампа у стареющих мышей. Наши результаты могут объяснить астроглиальные механизмы возрастного снижения обучаемости и памяти.

Ранее для скаффолд-инженерии лигандов ионных каналов мы предложили использовать α-гарпининовую укладку, а метод белковой топографии — для улучшения их свойств. Теперь мы применили молекулярную динамику для анализа комплекса искусственного α-гарпинина и калиевого канала человека Kv1.3. Такой анализ позволил предложить дополнительные модификации структуры α-гарпинина и увеличить его аффинность к выбранной мишени.

Недавние исследования показали, что в растениях первичные транскрипты некоторых генов miRNA (pri-miRNA) способны экспрессировать короткие белки (пептиды) размером от 12–15 до 30–40 а.о. Эти пептиды, названные miPEP, могут участвовать в регуляции транскрипции собственных pri-miRNA и сохраняютбиологическую активность при экзогенном введении в растения через корневую систему. Используя биоинформатический сравнительный анализ последовательностей РНК-транскриптов и геномов растений, нами ранее была обнаружена новая группа miPEP (miPEP-156a), которая кодируется первичными транскриптами pri-miR156a у нескольких десятков видов из семейства Brassicaceae. Экзогенные химически синтезированные пептиды miPEP-156a способны эффективно проникать в проростки растений через корневую систему и распространяться по растению локально и системно в листьях молодых проростков. При этом наблюдается морфологический эффект, заключающийся в ускоренном росте основного корня проростка. Параллельно наблюдается позитивный эффект на уровне экспрессии pri-miR156a. Важно, что с эффектами на морфологическом и молекулярном уровнях коррелирует способность пептида быстро проникать в ядра клеток и связываться in vitro как с хроматином, так и с ДНК. В настоящей работе была экспериментально установлена вторичная структура пептида и показано изменение этой структуры в комплексе с ДНК.

Рис. 1. Результаты кПЦР по измерению уровня экспрессии pri-miRNA156a в растениях семейства Brassicaceae. 1 – Брокколи (20-дневное растение, листья); 2 – брокколи (20-дневное растение, корень); 3 – проростки брокколи (4 дня) с добавлением пептида miPEP-156a (10 мкг/мл, выращивание при 20 °С); 4 – проростки брокколи (4 дня) с добавлением пептида (10 мкг/мл, выращивание при 24 °С); 5 – проростки брокколи (4 дня) на чашке Петри, контроль (вода, выращивание при 20 °С); 6 – проростки брокколи (4 дня) на чашке Петри, контроль (вода, выращивание при 24 °С); 7 – взрослые цветущие растения арабидопсиса (корни); 8 – взрослые цветущие растения арабидопсиса (листья); 9 – арабидопсис, проростки (4 дня при 20 °С) целиком (с корнями); 10 – арабидопсис, проростки (4 дня при 24 °С) целиком (с корнями); 11 –пекинская капуста (20-дневное растение, стебель); 12 – пекинская капуста (20-дневное растение, лист); 13 – пекинская капуста (20-дневное растение, корень). Для каждого из трех независимых повторов РНК выделяли из смеси пяти растительных проб. На рисунке указаны средние статистические значения в виде столбчатой диаграммы и стандартные отклонения. Статистическая значимость различий сумм значений в экспериментах 3 и 4 относительно экспериментов 5 и 6 составляла для этих двух выборок p < 0,05, согласно критерию Стьюдента (расчёт на основе программы GraphPad Prism 7.0 –ttps://graphpad_prism.software.informer.com/7.0/).

Тимол является вторичным метаболитом растений, для которого показана антифунгальная активность. Данное вещество обладает способностью разрушать клеточную стенку, а также оказывать эффект на синтез эргостерола. Кроме того, ранее было продемонстрирована способность тимола взаимодействовать и усиливать эффект соединений, ингибирующих токсигенез у плесневых грибов. Однако не вполне понятен был механизм действия тимола, в частности, эффект, оказываемый на экспрессию ключевых генов, ответственных за процессы роста и развития гриба, а также биосинтез токсинов.В настоящей работе объектом исследования стал штамм токсигенного гриба F. culmorum OR-02-37, выделенный из зерна пшеницы в Орловской области. Для оценки ингибиторного эффекта культуру гриба выращивали в жидкой среде Миро, стимулирующей токсигенез, в течение 7 суток при 25˚С. Для сравнительного анализа уровней относительной экспрессии генов тот же штамм культивировали на твердой среде Миро в течении 5 суток при аналогичных условиях. Рабочая концентрация тимола, использованная для оценки производимого эффекта, составила 50 ppm. Оценку относительной экспрессии токсиновых генов (трихотеценовый и зеараленоновый кластеры) проводили с использованием референсного гена, в качестве которого был выбран ген TEF1a. Оценку уровней накопления микотоксинов проводили методом ВЭЖХ с использованием системы Waters 1525 Breeze по методикам, описанным ранее.В результате проведённых исследований было продемонстрировано, что обработка тимолом не стимулирует экспрессию соответствующих генов, и, как следствие, не повышает накопление микотоксинов. И для ДОН, и для ЗЕН было выявлено некоторое понижение их уровней накопления в жидкой среде (снижение 10-25 %). Кроме того, показано снижение уровней относительной экспрессии ключевого гена трихотеценового биосинтеза (TRI5) и генов PKS4 и PKS13, связанных с синтезом зеараленона.

Рис. 1. Эффект, оказываемый тимолом в рабочей концентрации 50 ppm, на экспрессию генов трихотеценового кластера у F. culmorum OR-02-37: (А) – в жидкой среде, (Б) – на твердой среде. NT – необработанные образцы, T – обработанные тимолом.

Для профилактики и лечения поражений семенного и товарного картофеля мягкогнилостными бактериями Pectobacterium и Dickeya sp. были созданы методы видовой ПЦР-диагностики патогенов и коллекция охарактеризованных специфических бактериофагов. Эксперименты по обработке посевного материала и клубней в хранилище показали эффективность биозащиты.

Микробелки, кодируемые короткими рамками считывания, расположенными на длинных некодирующих РНК, традиционно остаются недооцененной частью протеома клетки. Мы провели исчерпывающий поиск транскриптов, кодирующих такие микробелки у мха P. patens, классифицировали, исследовали их консервативность и проследили эволюционные траектории в транскриптомах 479 видов растений. Для части выявленных микробелков была показана трансляция и для отдельных микробелков подтверждена биологическая активность. Отдельный интерес представляет эволюция пептидных семейств, регулирующих иммунный ответ. Мы исследовали разнообразие малых секретируемых пептидов у бриофитов и показали, что многие семейства таких пептидов общие у покрытосеменных и наиболее древних наземных растений, а отдельные пептиды цветковых растений индуцируют сходные физиологические реакции у бриофитов. Ещё одной линией защиты растения от патогенов является протеом. Мы выявили, что высокая устойчивость картофеля сорта Гала к заражению Yвирусом картофеля связана с активностью метионинового цикла и накоплением в растении отдельных его метаболитов. Таким образом, мы провели масштабное исследование эволюции микробелков и пептидов у растений и исследовали роль протеома и пептидома в ответе на биотический стресс.

Мирошниченко Дмитрий Николаевич Тимербаев Вадим Рафаилович, Клементьева Анна Александровна, Сидорова Татьяна Николаевна, Пушин Александр Сергеевич, Долгов Сергей ВладимировичC помощью технологии CRISPR/Cas9 впервые в России отредактирован геном мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) — главной зерновой культуры нашей страны. Целью геномного редактирования являлось получение новых нуклеотидных изменений в консервативной промоторной области гена яровизации VRN-A1, играющего важную роль в регуляции колошения у сортов яровой и озимой пшеницы. Наличие мутаций в этой области изменяет функциональную активность гена и ускоряет время колошения. Для получения растений с отредактированным геном применили ряд экспериментальных разработок: биоинформатический подбор различных гидовых РНК и тестирование их способности создавать разрывы ДНК in vitro в целевых участках, конструирования ряда экспрессиионных векторов, которые методом биобаллистики доставляли в клетки пшеницы и получили растения, содержащие различные изменения в целевой последовательности, включающие единичные нуклеотидные вставки или делеции, делеции из четырех или восьми нуклеотидов. Анализ последующего семенного поколения подтвердил успешное наследование новых мутантных вариантов VRN-А1. Показана возможность получения линий пшеницы, свободных от последовательностей «инструментов» геномного редактирования, а также выявлено изменение срока колошения у гомозиготной линии содержащей 8-ми нуклеотидную делецию в промоторной области VRN-А1 в сравнении с исходным сортом. Работа выполнена в сотрудничестве и при финансовой поддержке КГЦ-ВНИИСБ, Москва https://minobrnauki.gov.ru/press-center/news/?ELEMENT_ID=31804

Сидорова Татьяна Николаевна, Мирошниченко Дмитрий Николаевич Пушин Александр Сергеевич, Долгов Сергей Владимирович

У деревьев косточковых плодовых культур устойчивость к вирусу оспы сливы (PPV) можно достигнуть за счет специфической деградации вирусной РНК с помощью механизма РНК-интерференции (RNAi) благодаря экспрессии шпилечной конструкции, специфичной для белка оболочки PPV. При этом накопление siRNA в трансгенном растении сливы достигает более 2 % (от общего числа малых РНК) и обеспечивает многолетнюю невосприимчивость к вирусу. Биобезопасность трансгенных растений, однако, вызывает опасения из-за вставки чужеродных последовательностей. Плодовые деревья представляют собой комбинацию привоя (верх) и подвоя (низ), поэтому прививка коммерческих сортов на трансгенные вирусоустойчивые подвои (трансграфтинг) рассматривалась как возможный подход к смягчению проблем биобезопасности, однако эффективность этого способа требует экспериментального подтверждения . Нами были созданы различные варианты композитных деревьев, при этом повышенный уровень siRNA в трансгенных тканях обеспечивал устойчивость к PPV и блокировал перемещение вируса через ГМ-ткани в нетрансгенные ткани при инокуляции трансгенных тканей. Несмотря на передвижение большого числа малых РНК из подвоя в привой, транспорт siRNAs необходимых для инактивации PPV оказался низким (только 0.005% пула малых РНК). Поэтому при заражении нетрансгенных тканей (привитых на вирусоустойчивый трансгенный подвой), они по-прежнему оставались восприимчивыми к вирусной инфекции.

В составе S-белка всех SARS-вирусов имеется т.н. галектиновый фолд, то есть участок высокой гомологии с семейством гликан-связывающих белков семейства галектинов (Рис. 1). Однако, гликан-связывающей активности этого участка до появления SARS-CoV-2 никто не видел. С помощью гликанового эррея (>200 гликанов) мы изучили углевод-узнающую активность S-белка SARS-CoV-2 и обнаружили, что из нескольких позитивных гликанов максимальное связывание показывают именно те, которые являются классическими лигандами галектинов (Таблица, лиганды галектинов даны на сером фоне) (работа проведена совместно с НПО Вектор). Далее, работая уже с цельными вирионами и значительно расширив репертуар гликанов, мы подтвердили узнавание типичных галектиновых лигандов (работа проведена совместно с Институтом гриппа, С.-Пб.). Таким образом, коронавирус имеет потенциальный дополнительный рецептор, углеводной природы. Отметим, что нейраминидаза вируса гриппа, отщепляя от гликанов клетки сиаловую кислоту, тем самым создает очень высокую плотность именно тех структур, которые узнаются коронавирусом SARS-CoV-2

Были синтезированы 8 пептидов S-белка SARS-CoV-2, предсказанные как наиболее антигенные и не экранированные углеводными цепями; они оказались равномерно разбросанными по поверхности белка. Далее было изучено связывание с ними антител лиц, переболевших ковидом-19; оказалось, что единственный «диагностический» эпитоп (т.е. 90% дискриминирующий переболевших от наивных доноров), начинающийся а.к. 1147, расположен в стволовой части белка, то есть очень близко к мембране вириона (см. рисунок 1). Принципиально важной оказалась презентация пептида 1147. Если пептид просто иммобилизован на поверхности, он теряет диагностическую аккуратность. Но в липидированном виде (см. рисунок 2), встроенный в мембрану эритроцит или в искусственную мембрану, приобретает способность выявлять специфические для заболевания антитела. По-видимому, в упорядоченном слое пептид 1147 приобретает спиральную конформацию, близкую к той, что характерна для стволовой части белка.

Взаимодействия сывороточного альбумина с жидкофазными противоопухолевыми липосомами, несущими в мембране диолеоилглицеридный конъюгат мелфалана (Mlph-DG), исследованы методом ИК-спектроскопии с преобразованием Фурье. Показано, что фосфатидилинозит защищает мембрану липосом от проникновения белка. Высвобождение пролекарства Mlph-DG из липосом изучено с помощью метода фракционирования частиц в асимметричных потоках (AF4) — в системе, моделирующей взаимодействия с липопротеинами плазмы. Установлена высокая стабильность липосом. Предполагается, что фосфатидилинозит защищает липидный бислой за счет образования «компенсаторной» пары между объемистым отрицательно заряженным остатком мио-инозита и небольшим положительно заряженным остатком лекарства в молекуле Mlph-DG.

Сотрудниками ИБХ РАН совместно с коллегами из Лаборатории фотобиологии Института биофизики (ИБФ СО РАН, г. Красноярск) впервые были выделены продукты фотоинактивации 2-гидропероксицелентеразина из рекомбинантного фотопротеина Beroe abissycola — беровина. Методами ЯМР и масс-спектрометрии было показано, что продукты фотоинактивации представлены изомерными соединениями, имеющими ту же массу, что и исходный хромофор, однако сильно отличающимися по спектральным свойствам. Сотрудники Лаборатории химии метаболических путей методом встречного синтеза окончательно подтвердили структуру выделенных природных соединений — необычных продуктов деградации целентеразина гидантоиновой природы — и предложили механизм, при котором в ходе фотоинактивации происходит расщепление С-С связи в пиразиновом кольце 2-гидропероксицелентеразина. Похожий механизм расщепления был ранее обнаружен при окислении хромофоров GFP-подобных флуоресцентных белков (Ivashkin et al., 2011). Склонность беровина к фотоинактивации позволяет предполагать, что 2-гидропероксицелентеразин в белке, в отличие от гидроидных фотопротеинов, координирован в форме аниона. Результаты работы были опубликованы в журнале Organic letters.

Целью работы явилось изучение возможности колонизации трансгенных растений масличного рапса (Brassica napus L.), экспрессирующих ген антимикробного пептида цекропина P1 (cecP1), ассоциативными микроорганизмами Methylobacterium mesophilicum и Pseudomonas aureofaciens. Продемонстрирована устойчивость растений к фитопатогенам Erwinia carotovora B15, Pseudomonas syringae, Fusarium oxysporum и Botrytis cinerea. Анализ жирнокислотного состава семян трансгенных растений показал увеличение доли ненасыщенных жирных кислот. Растения показали повышенную фотосинтетическую активность при окислительном стрессе, вызванном паракватом, а не при окислительном стрессе и УФ-излучении по сравнению с контролем. Колонизация растений метилобактериями привела к увеличению скорости роста, образования корней и адаптации к тепличным условиям. CecP1-растения, колонизированные бактериями P. aureofaciens с устойчивостью к нафталину, смогли стабильно расти на среде, содержащей это химическое соединение. Исследование взаимодействия трансгенных растений с ассоциативными микроорганизмами показало, что бактерии локализованы во всех первоначально колонизированных растениях, а также в растениях, полученных после нескольких пассажей микропролиферации. Таким образом, трансгенные растения, содержащие ген cecP1, активно заселялись ассоциативными бактериями, что указывает на их безопасность для полезных микроорганизмов.

Предложен эффективный метод определения свободного α-2-макроглобулина (α-2-MG) в сыворотке крови человека, основанный на его реакции с трипсином, приводящей к отщеплению короткого пептида (VGFYESDVMGR). Для количественного определения содержания этого пептида был развит масс-спектрометрический метод, основанный на изотопно-меченного (¹⁸O) стандарта.

Изучено взаимодействие человеческого α-2-MG с пептидами Альцгеймера (Аβ-пептидs). Впервые обнаружен эффект блокировки отщепления пептида VGFYESDVMGR от α-2-макроглобулина в присутствии пептидов Альцгеймера и исчезновение этого эффекта в случаях модификации последних. Выявлен участок в пептидах Альцгеймера, разрыв пептидной связи в котором или его модификация приводит к потере их способности ингибировать реакцию трипсина с α-2-макроглобулином.

Обнаружено, что нитро-соединения из класса азолоазинов способны выступать в качестве регуляторов агрегации природных пептидов, склонных к самоассоциации, на примере фрагментов β-амилоидного пептида Альцгеймера. Показано, что в зависимости от типа производного азолоазина, происходит либо ассоциация пептида с образованием нерастворимой формы, либо подавление ассоциации, вплоть до растворения ранее образовавшегося ассоциата.

(1) Разработана методика формирования зондов для зондово-усиленной КР спектроскопии. Решена задача получения воспроизводимых практически одинаковых, с воспроизводимыми характеристиками, механически устойчивых зондов с высокой эффективностью получения сигнала КР от молекул, локализованных вблизи вершины зонда.

(2) Решена проблема доставки электромагнитного излучения к кантилеверу сканирующего зондового микроскопа. Реализованная схема позволила существенно уменьшить расстояние между объективом и образцом, что увеличило числовую апертуру объектива. При реализации методики зондово усиленного КР это обеспечивает почти двукратное увеличение эффективности системы возбуждение/сбор вторичного излучения.

В работе представлены результаты исследования физико-химических свойств молекул тетраанилина с концевыми фенильными группами (ТАНИ), которые являются проводящими производными полианилина (ПАНИ) с наименьшей молекулярной массой по сравнению с ПАНИ, а также пленок на основе ТАНИ. Самоорганизованные тонкопленочные структуры ТАНИ с четко определенной морфологией получали путем переноса пленок Ленгмюра, сформированных на границе раздела вода-воздух. На примерах разделения смесей нуклеиновых кислот и белков методом спектрально-корреляционной интерферометрии было показано, что поведение ТАНИ в качестве биосепарационного материала аналогично поведению ПАНИ. ТАНИ-поверхность демонстрирует сорбционную инертность по отношению к двунитевым нуклеиновым кислотам («негативная селекция») и связывает белки в зависимости от их изоэлектрических точек и гидрофобности («позитивная селекция»). Обнаруженные свойства ТАНИ позволяют рассматривать данный материал как перспективную альтернативу ПАНИ-содержащим покрытиям для создания хроматографических материалов с контролируемыми сорбционными свойствами по отношению к макромолекулам нуклеиновых кислот и белков.

В Лаборатории биомедицинских материалов (рук. Марквичева Е.А.) был разработан новый подход к созданию ветеринарной вакцины, защищающей крупных домашних животных от тяжелого вирусного заболевания- лихорадки долины Рифт. В работе были получены амфифильные наночастиц на основе поливинилпирролидона (ПВП), которые были загружены ДНК плазмидами, кодирующими Gn and Gc гликопротеины вируса. ДНК-плазмиды были защищены от расщепления внеклеточными нуклеазами путем их включения в наночастицы из производных ПВП с аминокислотами β-аланин или глицин. При этом наночастицы были получены простым оригинальной методом самосборки полимерных макромолекул. Гуморальный ответ на включенные в наночастицы плазмиды был изучен in vivo. Показано усиление гуморального ответа в мышах, которые были иммунизированы наночастицами, по сравнению с ответом, полученным в животных при введении им нативных плазмид. ПВП наночастицы, загруженные плазмидами, перспективны для разработки на их основе различных инкапсулированных ДНК вакцин.

Bacillus cereus – патогенная, грамположительная, обитающая в почве бактерия, вызывающая пищевые отравления и другие типы инфекций, является одной из наиболее распространенных причин внутрибольничных инфекций. Одним из главных факторов патогенности B. cereus является гемолизин II (HlyII) – β-пороформирующий токсин, который отличается от других β-пороформирующих токсинов наличием на С-конце молекулы аминокислотной избыточности из 94 остатков, условно обозначаемой как HlyIICTD (С-терминальный домен). Этот белок продуцируется бактерией как мономер, но в присутствие мембраны клеток инфицированного организма, мономеры токсина соединяются, встраиваются в клеточную мембрану и образуют пору, нарушая целостность клетки. Анализ панели моноклональных антител к рекомбинантному белку HlyIICTD выявил способность антитела HlyIIC-20 ингибировать гемолиз HlyII. Методами фагового дисплея и направленного мутагенеза генов природных токсинов близких штаммов определен конформационный эпитоп нейтрализующего антитела HlyIIC-20. Эпитоп локализован в N-концевой части HlyIICTD. Показано, что HlyIIC-20 связывается с HlyII в мономерной форме до начала стадии пороформирования, предотвращая олигомеризацию, необходимую для образования мембранной поры. Эффективность подавления гемолиза, вызванного различными штаммами B. cereus, была различной и зависела от аминокислотного состава эпитопа. Замены L324P и P324L в гемолизинах штаммов ATCC14579T и B771, соответственно, выявили роль лейцина, локализованного в эпитопе, в подавлении гемолиза антителом. Нейтрализующая способность антитела подтверждена экспериментами как in vitro, так и in vivo. Предварительная инкубация HlyIIC-20 с HlyII предотвращала гибель мышей вплоть до эквимолярного соотношения. Стратегия обнаружения и нейтрализации токсической активности HlyII может предоставить инструмент для мониторинга и снижения патогенности B. cereus.

Изучение микробных сообществ является современным подходом для профилактики и терапии многих заболеваний. На современном этапе широко используются комплексные омиксные технологии, позволяющие исследовать полный состав флоры и сделать предположения о связи объекта и запускаемого им процесса.

Проблема мастита крупного рогатого скота остается актуальной на сегодняшний день, как с экономической, так и с ветеринарной стороны. Целью работы было провести анализ изменений в составе микробиоты молока коров при заболевании маститом на фермах Российской Федерации.

Проведен микробиомный анализ образцов молока здоровых коров и коров с различными формами мастита. Выявлено значительное преобладание нескольких операционных таксономических единиц, соответствующих преимущественно группам Staphylococcus aureus, Aerococcus spp. и Streptococcus spp. Кроме того, S. thermophilus был идентифицирван в нескольких образцах. Показано, что в Центральной России мастит связан с большим разнообразием возбудителей. Величина эффекта линейного дискриминантного анализа подтвердила наличие нескольких индикаторных родов в хозяйствах Москвы и Тульской области. Эти результаты подтверждают сложную бактериальную этиологию мастита крупного рогатого скота на территории РФ

В настоящее время во всем мире большое внимание уделяется исследованию недавно обнаруженным наноматериалам, называемых углеродными квантовыми точками (УТ), которые наряду с естественной биосовместимостью обладают стабильной интенсивной флуоресценцией, чувствительной к изменениям окружающей среды. Эти свойства открывают широкие перспективы использования УТ в качестве оптических сенсоров различных примесей в жидких и газовых средах, а также как тераностические нанокомплексы, действующие одновременно как люминесцентные биомаркеры и носители лекарств. Однако природа УТ, в частности их молекулярный размер и степень чистоты (т.е. доля различных нефлуоресцирующих компонентов) практически не известны. Нами впервые была разработана методика высокоэффективной эксклюзивной жидкостной хроматографии (ЭХ-ВЭЖХ) в сочетании с мультиволновыми детекторами флуоресценции и абсорбции для разделения и оценки молекулярных размеров УТ, полученных окислением нанографена, и рассчитан квантовый выход отдельных индивидуальных фракций УТ. Впервые было обнаружено, что лишь небольшая часть исходного оксида нанографена обладает флуоресценцией. Предложенный метод позволяет получать наборы УТ с характеристическими спектрами поглощения и флуоресценции и высоким квантовым выходом. Метод позволяет эффективно отделять флуоресцирующие фракции УТ от не флуоресцирующих примесей, что принципиально важно для практического использования УТ в качестве биомаркеров в медицине.

Показано, что нормировка цитотоксической сигнатуры на степень инфильтрации опухоли иммунными клетками драматически увеличивает точность предикции ответа на анти-PD-L1 иммунотерапию.

Показано, что соотношение IgG1/IgA экспрессии в опухолевым окружении является важным и независимым прогностическим и предиктивным маркером ответа на анти-PD-L1 иммунотерапию.

Разработан предиктор ответа анти-PD-L1 иммунотерапию, позволяющий надежно идентифицировать респондеров среди пациентов с инвазивной уротелиальной карциномой, включая подгруппу с низкоинфильтрированным “desert” фенотипом опухоли.

Мы применили масированное секвенирование Т-клеточных рецепторов (TCR) для отслеживания изменений в репертуаре Т-клеток после двух легких случаев COVID-19. У обоих доноров мы идентифицировали клоны CD4 + и CD8 + Т-клеток с высокой клональной экспансией после заражения. Антигенная специфичность CD8 + TCR к эпитопам SARS-CoV-2 была подтверждена как связыванием с тетрамером рMHC, так и структур найденных нами TCR с TCR, присутствующих в международных базах данных SARS-CoV2-специфичных TCR. Мы описываем характерные мотивы в CDR3-последовательностях TCR T-клонов, реагирующих на COVID-19. Мы показываем, что у обоих доноров большинство инфекционно-реактивных клонотипов приобретают фенотипы памяти. Определенные клоны Т-клеток были обнаружены во фракции памяти в момент времени до заражения, что свидетельствует об участии ранее существовавших перекрестно-реактивных Т-клеток памяти в иммунном ответе на SARS-CoV-2.

Биоконъюгация антител с различными лигандами находит разнообразное применение, например, для доставки лекарств и визуализации. Флуоресцентные иммуноконъюгаты представляют собой перспективный инструмент для диагностики рака благодаря своей высокой яркости, специфичности, стабильности и сродству к мишени. Флуоресцентные антитела широко используются в проточной цитометрии для быстрой и чувствительной идентификации клеток, экспрессирующих целевой поверхностный антиген. Современные подходы к флуоресцентному мечению антител чаще всего используют случайную модификацию, а также несколько довольно сложных сайт-специфических методов. Целью нашей работы была разработка процедуры флуоресцентного мечения иммуноглобулина G посредством периодатного окисления гликанов антитела с последующим оксимным лигированием с флуоресцентными оксиаминами. Мы представляем новую методику, основанную на оксимном лигировании in situ этоксиэтилиден-защищенных аминооксисоединений с окисленными гликанами антител. Этот подход позволяет легко модифицировать любой иммуноглобулин G, при этом антигенсвязывающие домены остаются интактными, что открывает возможности для конструирования флуоресцентных зондов. Этот метод был использован для мечения антитела к PRAME, белку раковой опухоли, сверхэкспрессируемому при ряде раковых заболеваний. Моноклональное антитело 6H8 к белку PRAME было модифицировано защищенными оксиаминовыми производными красителей типа флуоресцеина (FAM, Alexa488, BODIPY FL). Полученные иммунофлуоресцентные конъюгаты были применены для анализа образцов костного мозга пациентов с онкогематологическими заболеваниями и продемонстрировали высокую эффективность при количественной оценке методом проточной цитометрии. Данный подход может быть применен для разработки различных иммунофлуоресцентных зондов для выявления диагностических и прогностических маркеров, которые могут быть полезны в противораковой терапии.

Молекулы человеческих лейкоцитарных антигенов (HLA) класса I играют решающую роль в развитии специфического иммунного ответа на вирусные инфекции, представляя вирусные пептиды на поверхности клетки, где они в дальнейшем распознаются Т-клетками. Мы изучили, могут ли генотипы HLA класса I быть связаны с критическим течением COVID-19 путем поиска возможных связей между генотипами умерших пациентов и их возрастом на момент смерти. Генотипы HLA-A, HLA-B и HLA-C были определены с помощью секвенирования следующего поколения у 111 умерших пациентов с COVID-19 (Москва, Россия) и 428 добровольцев. Умершие пациенты были разделены на две группы в зависимости от возраста на момент смерти: 26 пациентов в возрасте до 60 лет и 85 пациентов старше 60 лет. Используя генотипы HLA класса I, мы разработали индекс риска (ИР), который был связан со способностью представлять пептиды коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) по набору молекул HLA класса I индивидуума. Полученный показатель ИР был значительно выше в группе умерших пациентов до 60 лет по сравнению с умершими пациентами старше 60 лет [p = 0,00348, площадь под ROC-кривой (AUC) = 0,68)]. В частности, наличие аллеля HLA-A*01:01 было связано с высоким риском, в то время как HLA-A*02:01 и HLA-A*03:01 в основном способствовали низкому риску. Анализ пациентов с гомозиготностью ярко подчеркнул эти результаты: гомозиготность по HLA-A*01:01 сопровождалась ранней смертью, в то время как только один пациент, гомозиготный по HLA-A*02:01, умер в возрасте до 60 лет. Применение построенной ИР-модели к независимой когорте испанских пациентов (n = 45) показало, что ИР также ассоциировался с тяжестью заболевания. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли презентации пептидов HLA класса I в развитии специфического иммунного ответа на COVID-19.

Быстро появляющиеся мутации SARS-CoV-2 могут влиять на эпитопы Т-клеток, что может помочь вирусу уклониться от ответа CD8 или CD4 Т-клеток. Мы разработали Т-клеточный атлас COVID-19 - комплексный веб-портал, который позволяет проанализировать, как мутации SARS-CoV-2 изменяют презентацию вирусных пептидов молекулами HLA. Данные представлены для распространенных вариантов вируса и наиболее частых аллелей HLA класса I и класса II. Сродство связывания молекул HLA и вирусных пептидов было оценено с помощью точных методов in silico. Полученные результаты подчеркивают важность учета разнообразия HLA-аллелей: опосредованные мутациями изменения в HLA-пептидных взаимодействиях сильно зависят от HLA-аллелей. Например, мы обнаружили, что пептиды, прочно связывающиеся с HLA-B*07:02 для референсного уханьского варианта вируса, перестали быть прочно связывающимися для индийского (Дельта) и британского (Альфа) вариантов.

Эпителиальные клетки кишечника существуют в условиях физиологической гипоксии, что приводит к активации гипоксия-индуцибельного фактора (HIF) и поддерживает барьерную функцию и клеточный метаболизм кишечного эпителия. В противоположность этому, патологическая гипоксия является общей чертой некоторых хронических заболеваний, включая воспалительные заболевания кишечника (ВЗК). Мы изучили HIF-ассоциированные изменения в кишечном эпителии при ВЗК. На первом этапе в модели клеток кишечника in vitro с помощью секвенирования РНК был получен список генов, реагирующих на химическую активацию гипоксии. Обработка хлоридом кобальта (II) и производным оксихинолина как недифференцированных, так и дифференцированных клеток Caco-2 активировала HIF-сигнальный путь, согласно анализу обогащения групп генов. Основной набор генов, реагирующих на стимуляцию химической гипоксии в модели кишечника, включал 115 генов с повышенной экспрессией и 69 - с пониженной. Из этого набора белковый продукт был обнаружен при анализе протеома для 32 генов, а кратность изменения экспрессии по данным протеома и секвенирования РНК значительно коррелирует. Анализ общедоступного набора секвенирования РНК эпителиальных клеток кишечника пациентов с ВЗК подтвердил активацию сигнального пути HIF-1 в сигмовидной кишке пациентов с язвенным колитом и терминальной части подвздошной кишки пациентов с болезнью Крона. Из набора основных генов, полученных на модели гипоксии кишечника, в образцах ВЗК была обнаружена активация экспрессии генов ITGA5 и PLAUR, кодирующих интегрин α5 и рецептор активатора плазминогена урокиназного типа (uPAR). Взаимодействие этих молекул может активировать миграцию клеток и регенеративные процессы в эпителии. Анализ транскрипционных факторов с помощью ранее разработанного инструмента miRGTF показал возможную роль HIF1A и NFATC1 в регуляции экспрессии генов ITGA5 и PLAUR. Обнаруженные гены могут служить маркерами прогрессирования ВЗК и гипоксии кишечника.

Отсутствие высокопроизводительных методов скрининга (HTS) малых молекул, которые стабилизируют ДНК i-мотивы (iM), ограничивает их разработку в качестве потенциальных кандидатов в лекарственные препараты. Мы показали, что регистрация изменения сигнала флуоресценции для исследования влияния лигандов на стабильность iM, применяя стандартную пару FAM – BHQ1, дает неверные результаты из-за дополнительных взаимодействий, связанных с красителем/тушителем. Мы разработали альтернативную систему с флуоресцентными феноксазиновыми псевдонуклеотидами в петлях, которые не влияют на «разворачивание» iM. В то же время флуоресценция феноксазиновых остатков чувствительна к «разворачиванию» iM, что позволяет точно оценить вызванные лигандом изменения стабильности iM. Полученные результаты могут послужить основой для новых HTS подходов к профилированию лигандов, взаимодействующих с iM.

Хромофор зеленого флуоресцентного белка (GFP) и его аналоги привлекают значительное внимание в основном как элемент систем биоимиджинга. В данной работе мы исследовали эти соединения в качестве противовирусных агентов. Мы выбрали ДНК LTR-III G4, основной G-квадруплекс (G4), присутствующий в промоторной области длинного концевого повтора (LTR) вируса иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), в качестве мишени для первичного скрининга и разработки кандидатов в противовирусные препараты. Ранее было показано, что стабилизация данного G4 подавляет экспрессию и репликацию вирусных генов. Высокопроизводительный FRET скрининг 449 соединений, аналогов хромофора GFP, выявил ряд лидерных соединений, имеющих общие структурные особенности. Изучение взаимосвязи структура-активность (SAR) для наиболее эффективных стабилизаторов позволили нам установить структурные фрагменты, важные для связывания с данным G4. Синтетические соединения, разработанные на основе SAR анализа, показали высокий уровень стабилизации LTR-III G4. ЯМР-спектроскопия и молекулярное моделирование показали возможное образование комплекса LTR-III G4 с одним из наиболее селективных производных ZS260.1, расположенным внутри полости между двумя модулями, таким образом подчеркивая привлекательность LTR-III G4 мишени для направленного воздействия. Отобранные соединения показали умеренную активность против ВИЧ-I (EC50 1,78–7,7 мкМ) in vitro, но активность сопровождалась заметной цитотоксичностью.

Новые и вновь появляющиеся вирусы периодически вызывают вспышки и эпидемии во всем мире, что в конечном итоге приводит к глобальным проблемам, таким как нынешняя пандемия новой коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 COVID-19. Таким образом, совершенно очевидна острая необходимость в новых противовирусных препаратах. Мы осуществили синтез и провели оценку противовирусной активности феноксазиновых нуклеозидных аналогов, разделенных на три группы: (1) 8-алкоксизамещенные, (2) ациклические и (3) карбоциклические. Противовирусная активность оценивалась на структурно и филогенетически разнообразной панели РНК и ДНК вирусов из 25 видов. Четыре соединения ингибировали 4 ДНК/РНК вируса с EC50 ниже 20 мМ. Токсичность соединений для клеточных линий, используемых для культивирования вирусов, в большинстве случаев была незначительной. Кроме того, ранее полученные и новые производные феноксазина были оценены на активность в отношении SARS-CoV-2, и некоторые из них показали многообещающее ингибирование репродукции со значениями EC50 в низком микромолярном диапазоне, хотя это и сопровождалось соразмерной цитотоксичностью.

Использование наноструктур различного состава перспективно для множества применений от укрепления полимеров и металлов до нано-детекторов и медицинских покрытий. Многие из этих приложений предполагают непосредственное взаимодействие наноматериалов с человеком, животными или окружающей средой. Анализ его действия на биологические объекты становится важным для дальнейшего развития этих приложений.

Ранее нами было обнаружено негативное действие углеродных нанотрубок на бактериальные клетки. Но механизм этого эффекта был неясен. В этом году мы проанализировали взаимодействие 6 типов наноматериалов (алмаз, графит, гексагональный BN, кубический BN, BN и C нанотрубки) с люминесцентными бактериями Escherichia coli K12 TGI. Материалы были выбраны так, чтобы образовать пары схожей кристаллической структуры: алмаз и cBN; графит и hBN; Нанотрубки C и BN; и группы одинакового состава. Таким образом, мы могли измерить влияние состава и кристаллической организации наноструктур на живые клетки.

Используя методы электронной и атомно-силовой микроскопии, мы охарактеризовали исследуемые материалы и бактерии до и после инкубации с наноструктурированными порошками. Мы продемонстрировали, что структуры с кубической и гексагональной кристаллографической организацией не оказывают отрицательного воздействия на клетки. Нанотрубки, как углеродные, так и нитрид борный, являются токсичными. Изменения проявляются как в структуре клеток, что регистрируется методами электронной и атомно-силовой микроскопии, так и в снижении светимости люминесцентных бактерий и количестве колониеобразующих единиц.

Совместно с коллегами из Института Молекулярной Биологии им. В.А. Энгельгардта произведено исследование фрагментированных по кольцу С производных ангуциклинонов. Разработан подход к химическому синтезу Элменолов А и Б и ряда родственных соединений. На основании литературных данных и оригинальной гипотезы пересмотрен путь биосинтеза и потенциальная функция данных соединений. Результаты исследования позволяют взглянуть по-новому на большую группу метаболитов данного класса антибиотиков.

Совместно с группой химии гетероциклических соединений на основе реакции 1,5-гидридного сдвига/циклизации разработан универсальный подход к синтезу труднодоступных несимметричных производных юлолидина - потенциальной платформы для создания новых биологически активных соединений. Ключом к успешной реализации подхода стала возможность прямого формилирования тетрагидрохинолинов в положение 8 с помощью реакций Вильсмейера-Хаака или С-H активации.

Ишемический инсульт является одной из главных причин смертности и инвалидизации населения в мире. Патофизиология инсульта активно исследуется на самых разных уровнях и моделях, однако до сих пор существуют серьезные пробелы в понимании метаболических изменений, сопровождающих данное заболевание. Особенно плохо изучены процессы, которые происходят в ткани мозга на самых ранних стадиях ишемии и реперфузии. В сотрудничестве с коллегами из Федерального центра мозга и нейротехнологий ФМБА России, Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова и других российских и зарубежных институтов мы разработали технологию, позволяющую регистрировать биохимические события в тканях мозга лабораторных животных in vivo.

Путем вирусной доставки в мозге крыс линии SHR были экспрессированы разработанные ранее в нашем институте генетически кодируемые флуоресцентные биосенсоры SypHer3s для регистрации динамики рН (Ermakova et al. Chem. Commun. 2018 doi:10.1039/C7CC08740C) и HyPer7 для регистрации пероксида водорода (H2O2) (Pak et al., Cell Metabolism 2020 doi:10.1016/j.cmet.2020.02.003). Флуоресцентный рациометрический сигнал биосенсоров считывался с помощью специально разработанной системы двухканальной фотометрии через имплантированные в мозг оптические волокна. Ишемический инсульт вызывался путём перекрытия средней мозговой артерии животного (MCAO). Мы зарегистрировали мощный ацидоз в ишемизированной ткани мозга, возникающий с первых секунд развития патологии. Вопреки ожиданиям, значительного образования H2O2, одного из главных представителей активных форм кислорода в клетках, в острой фазе ишемии/реперфузии обнаружено не было. Существенное увеличение концентрации H2O2 в митохондриях нейронов в поврежденной ткани наблюдалось лишь на следующие сутки.

Сравнение результатов экспериментов in vivo с исследованиями на культивируемых нейронах в условиях гипоксии/реоксигенации продемонстрировало, что динамика окислительно-восстановительных процессов в этих моделях значительно различается. Это в очередной раз подтверждает, что культура клеток является плохой прогностической моделью метаболических событий, происходящих внутри организма.

Проведено сравнительное изучение возможностей использования каскадов ферментов рибокиназа → фосфопентомутаза → нуклеозидфосфорилаза в синтезе модифицированных нуклеозидов. Показано, что каскадные синтезы модифицированных нуклеозидов можно осуществлять как мезофильным, так и термофильным путем из D-пентоз: рибозы, 2-дезоксирибозы, арабинозы, ксилозы, 2-дезокси-2-фтор-арабинозы. С использованием ферментативного каскада количественно наработаны из D-рибозы и D-арабинозы четыре нуклеозида. Синтезированы рибозиды 8-азагуанозина (термофильный каскад) и аллопуринола (мезофильный каскад). Впервые синтезированы D-арабинозиды 2-хлор-6-метоксипурина и 2-фтор-6-метоксипурина с использованием мезофильного каскада. Несмотря на сравнительно небольшую разницу в температурах при постановке каскадных реакций (50 и 80 °С), скорость образования продуктов в реакциях с ферментами E. coli значительно выше. В мезофильном каскаде достигается более высокий выход продукта, поэтому его целесообразнее использовать для полиферментативного синтеза модифицированных нуклеозидов.

Сотрудниками лаборатории совместно с коллегами из Института молекулярной биологии Энгельгардта была впервые синтезирована серия флексимерных пиразол-содержащих 8-аза-7-дезаза-аналогов аденозина – соединений, у которых пуриновое кольцо разделено на две ароматические системы. Было проведено сравнение эффективности химического, ферментативного и биотехнологического подходов синтеза. Показано, что ферментативный подход обладает регио- и стерео селективностью, экологичен и эффективен. Иллюстрация нашей работы была напечатана на обложке номера Organic & Biomolecular Chemistry, в котором вышла статья.

С целью изучения механизма протеолитического гидролиза пептидогликана эндолизинами некоторых бактериофагов был осуществлено конструирование и химический синтез искуственного субстрата указанных ферментов, поскольку применение природного пептидогликана имеет значительные трудности в проведении экспериментальной работы. Синтезированное вещество является миметиком фрагмента пептидогликана и представляет собой N-ацетилглюкозаминил-β-(1-4)-N-ацетилмурамоил-L-аланил-γ-D-глутамил-L-аланил-D-аланин. Гидролиз миметика литическими L-аланил-γ-D-глутаматными пептидазами бактериофагов T5, RB43 и RB49 изучали методом ЯМР. Было показано, что ферменты распознают синтезированый миметик в качестве субстрата, а его гидролиз протекает по связям L-аланил-γ-D-глутамат, как это имеет место быть в природном пептидогликане. Проведена оценка кинетических параметров реакций гидролиза рядом эндолизинов.

Целый спектр физических методов (ядерный магнитный резонанс, круговой дихроизм, дифференциальная сканирующая калориметрия) использованы для сравнительного анализа активных центров трех цинк-зависимых металлопептидаз – эндолизинов псевдо Т-четных миовирусов (RB43 и RB49) и сифовируса (T5). Показана аминокислотная и структурная консервативность сайта связывания цинка и ключевая роль этого иона в стабилизации пространственной укладки белка. Мы продемонстрировали, что связывание Zn²⁺ в активном центре пептидазы EndoRB49 вызывает конформационные перестройки, аналогичные тем, что происходят в молекуле EndoT5 при связывании двух ионов – каталитического Zn²⁺ и регуляторного Ca²⁺ – и приводят к формированию каталитически активной формы фермента.

Дальнекрасный флуоресцентный белок mKate2 способен к формированию зеленой формы под действием интенсивного облучения. Мы исследовали его фотоповедение и обнаружили также переход белка в синее флуоресцентное состояние. Более того, выявлено влияние на кинетику фотоконверсии концентрации белка, удельной мощности облучения и наличия редокс-активных молекул в среде. Стационарная и времяразрешенная флуоресцентная спектроскопия позволила определить, что наблюдаемая эволюция спектральных форм не является истинной фотоконверсией, а происходит в основном вследствие «демаскировки» незрелых форм хромофора типа GFP при обратимом фотовосстановлении красного хромофора типа DsRed.

Обонятельные рецепторы насекомых семейства OR представляют собой гетеромерные молекулы, состоящие из лиганд-специфической (OrX) и регуляторной (Orco) субъединиц. Предполагается, что гетеромеры OR способны и к ионотропной, и к метаботропной активации. Мы исследовали функционирование двух гетеромерных обонятельных рецепторов дрозофилы в клетках млекопитающих. Рецепторы нативного состава (OrX/Orco) показывают различия по чувствительности к лиганду в ~100 раз, по кинетике электрического ответа в 25-30 раз (на рисунке (А) сверху показаны кинетические характеристики гетеромеров Or49/Orco и Or59/Orco, снизу – их чувствительность к лигандам. Замена регуляторной субъединицы на модифицированную, не связывающую цАМФ (т.н. Orco-PKC), не повлияла на работу рецептора метилацетата (Or59), но резко изменила проводимость рецептора о-крезола (Or49; на рисунке Б приведены вольтамперные характеристики рецептора с нативной и модифицированной субъединицами). Мы заключили, что рецепторы одного семейства могут существенно отличаться по своей настройке, в т.ч., механизмами трансдукции сигнала.

Рентгеноструктурным методом установлена пространственная структура и изучены биохимические свойства EYFP-F165G - варианта яркого желтого биомаркера EYFP. Структура EYFP-F165G выявила два независимых пути посттрансляционной модификации, отвечающих двум состояниям полипептидной цепи - с интактной хромофор-образующей триадой (~85%) и зрелым хромофором (~15%). На основе пространственной структуры EYFP-F165G осуществлен дизайн новых генно-инженерных вариантов. Наиболее совершенный вариант EYFP-F165H с 2.2 -кратным увеличением яркости эмиссии по отношению к желтому предшественнику EYFP входит в десятку известных самых ярких биомаркеров.

Подпись к Рисунку: Карта электронной плотности 2Fo-Fc (синий цвет) в ближайшем окружении хромофора. Карта разностной электронной плотности FoFc (зеленый цвет) для созревшего хромофора (коричневый цвет) и интактной хромофоробразующей) триады GYG (желтый цвет).

Флуороген-активирующие белки – это новейшие системы обратимого флуоресцентного мечения, состоящие из генетически кодируемого белка и флуорогена, добавляемого извне. Доступный исследователям набор таких меток крайне ограничен, а разработка новых вариантов происходит медленно. Мы применили компьютерное моделирование лиганд-рецепторных взаимодействий и компьютерный редизайн лиганд-связывающего кармана для создания улучшенного флуороген-активирующего белка.

Разработанный белок DiB-RM демонстрирует большую молекулярную яркость в сверхразрешающей локализационной микроскопии protein-PAINT по сравнению с белком-предшественником DiB1. На основе белка DiB-RM также создана эффективная сплит-система, а во флуоресцентной микроскопии DiB-RM показал увеличенную фотостабильность мечения. Сопоставление экспериментальных данных, кристаллических структур и результатов компьютерного моделирования улучшили понимание взаимосвязи структура-функция во флуороген-активирующих белках на основе бактериального липокалина.

Флуоресцентные белки - важнейший инструмент в современных биологических исследованиях. Однако такие белки обладают рядом выраженных недостатков: им требуется кислород и некоторое время для созревания, их цветовое разнообразие ограничено хромофорами сформированными из природных аминокислот, после фотообесцвечивания они не могут более выступать в роли метки, а также все они имеют достаточно большой размер, что сказывается на поведении изучаемого объекта. Отличной алтернативой таким белкам стали в последние годы так называемые флуороген-активирующие белки. Флуороген-активирующие белки не имеют собственного флуорофора, а принимают его из раствора. Этот механизм заметно повышает фотсотстабильность такой метки, а также позволяет индуцировать сигнал строго при необходимости. Подобный комплекс не требует времени и кислорода для созревания, цветовое разнообразие флуорогенов потенциально ничем не ограничено, а размер таких белков как правило заметно меньше.
В ходе работ 2021 года в нашей группе совместно с Группой молекулярных меток для оптической наноскопии была создан целая серия новых флуорогенов для известного флуороген-активируюещго белка FAST. Также совместно с этой же группой, Лабораторией биомолекулярной ЯМР-спектроскопии и коллегами из МФТИ мы разработали флуороген-активирующий белок nanoFAST размером всего 98 аминокислот, и это наименьший размер среди всех генетически кодируемых флуоресцентных меток.