Структурно-функциональная взаимосвязь новых флуоресцентных биомаркеров с необычными свойствами. Рентгеноструктурные исследования на атомном уровне.

Флуоресцентные белки (ФБ) разного спектрального диапазона из морских организмов и их генно-инженерные варианты нашли широкое применение в клеточной биологии, биотехнологии и биомедицине в качестве биомаркеров для визуализации процессов в живых организмах, мониторинга экспрессии генов, многоцветного мечения белков, клеточных органелл и целых клеток, определения жизненно важных внутриклеточных характеристик таких как рН, концентрация ионов и др. Фототоксичные ФБ, вырабатывающие активные формы кислорода, являются перспективными инструментами для фотоиндуцированной терапии онкологических заболеваний. Задачей настоящего проекта является установление методом рентгеноструктурного анализа высокого разрешения пространственной структуры и ее взаимосвязи с фотофизическими характеристиками для новых перспективных флуоресцентных биомаркеров разного спектрального диапазона. В качестве объектов исследования выбраны новые генно-инженерные варианты, обладающие улучшенными фотофизическими характеристиками -- зеленый BrUSLEE (эмиссия в зеленой области спектра - Lem ~509 nm) и красный FusionRed2 (генно-инженерный вариант - mKate2-K67R-R197H; эмиссия в красной области спектра - Lem ~603 nm). Отличительной особенностью зеленого BrUSLEE является высокая яркость флуоресценции при исключительно коротком времени жизни (субнаносекундный диапазон ~0.7 ns), выходящим за пределы временных параметров большинства остальных зеленых ФБ (2.3-3.5 ns). Эти свойства делают его уникальным биомаркером в экспериментах с применением время-разрешающей флуоресцентной микроскопии (FLIM). Красный генно-инженерный вариант FusionRed2 характеризуется исключительно высокой яркостью, в 1.6 раза превосходящей яркость его дальне-красного предшественника - mKate2 (известного коммерческого биомаркера). Полученные результаты по структурно-функциональной взаимосвязи исследуемых белков будут использованы при разработке подхода к конструированию новых биомаркеров с улучшенными фотофизическими характеристиками.

6 Января 2023 года — 31 Декабря 2024 года

Плетнёва Н.В. (рук.)

Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов

Грант, РНФ

Список публикаций по проекту

  1. Goryacheva E, Efremov R, Krylov N, Artemyev I, Bogdanov A, Mamontova A, Pletnev S, Pletneva N, Pletnev V (2023). Crystal Structure of Bright Fluorescent Protein BrUSLEE with Subnanosecond Fluorescence Lifetime; Electric and Dynamic Properties. Int J Mol Sci 24 (7), 6403
  2. Goryacheva EA, Artemev IV, Arkhipova SF, Rossokhin AV, Gilvanov AR, Pletnev VZ, Pletnevа NV (2023). Alternative Chromophore Binding Sites in Noncovalent Fluorescent Complexes of Bacterial Lipocalin. Russ. J. Bioorganic Chem. 49 (5), 1159–1163
  3. Rossokhin AV, Goryacheva EA, Artemyev IV, Arhipova SF, Gilvanov AR, Pletneva NV, Pletnev VZ (2024). Three-Dimensional Structure of the Triple Mutant DiB3-F53L/F74L/L129M of the Fluorescent Complex of Bacterial Lipocalin with a Chromophore. Russ. J. Bioorganic Chem. 50 (3), 778–783
  4. Goryacheva EA, Rossokhin AV, Ruchkin DA, Bogdanov AM, Artemyev IV, Pletneva NV, Plenev VZ (2024). mKate2-K67R/R197H—Extra-Bright Red Fluorescent Biomarker of New Generation. X-Ray Structure and Molecular Dynamic Properties. Russ. J. Bioorganic Chem. 50 (4), 1306–1313
  5. Ruchkin DA, Gavrikov AS, Kolesov DV, Gorokhovatsky AY, Chepurnykh TV, Mishin AS, Maksimov EG, Pletneva NV, Pletnev VZ, Pavlova AM, Nikitin VA, Bogdanov AM (2025). Two Key Substitutions in the Chromophore Environment of mKate2 Produce an Enhanced FusionRed-like Red Fluorescent Protein. Acta Naturae 17 (2), 110–117