Пресс-центр / новости / Наука /
Времяразрешенный флуоресцентный GFP-индикатор для точных измерений рН в щелочном диапазоне
Мониторинг внутриклеточного pH в живых клетках с высокой точностью в режиме реального времени представляет собой важную методологическую задачу. Хотя генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы предпочтительны для таких измерений, они в основном неспособны определить абсолютное значение рН и/или обладают узким динамическим диапазоном ответа, что делает их неэффективными для регистрации небольших изменений рН, которые обычно происходят в клеточных органеллах.
Сотрудники Лаборатории генетически кодируемых молекулярных инструментов ИБХ РАН изучили pH-чувствительность индикатора на основе зеленого флуоресцентного белка (GFP) (EGFP-Y145L/S205V) с pKa хромофора со щелочным сдвигом и продемонстрировали, что в диапазоне pH 7,5-9,0 время жизни его флуоресценции в клетках млекопитающих изменяется квазилинейным образом примерно в 3,5 раза. Учитывая относительно сильное изменение времени жизни флуоресценции в узком диапазоне рН, в качестве мишени для измерения рН в живых клетках авторы предложили митохондрии, которые, как известно, имеют слабощелочную среду. Используя микроскопию визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM) для визуализации клеток HEK293T, экспрессирующих митохондриально направленный EGFP-Y145L/S205V, учёным удалось определить абсолютное значение pH матрикса митохондрий и зарегистрировать сдвиг pH после стимуляции разобщителем ЭТЦ с точностью до 0,1 единицы. Таким образом, было показано, что мутант GFP с щелочным сдвигом pKa является высокоточным индикатором, который можно использовать в определенном диапазоне pH.
Работа опубликована в журнале International Journal of Molecular Sciences.
Рисунок 1. Данные FLIM, полученные для клеток HEK293T, экспрессирующих EGFP-Y145L/S205V, после добавления смеси монензин/нигерицин, предварительно инкубированных в буферах с различным рН (pH 5,5–9,0). (A) Гистограммы, показывающие среднее распределение времени жизни, рассчитанное на основе FLIM-измерений при различных значениях pH (цветовая легенда находится на вставке). (B) График, описывающий зависимость среднего времени жизни от pH. (C) FLIM-измерения с цветовой кодировкой, иллюстрирующее значения времени жизни в цитоплазме клеток HEK293T (цветовая легенда находится под галереей изображений). Шкала составляет 30 мкм. Для возбуждения флуоресценции использовали двухфотонный (2P) лазер с λem = 750 нм.
17 ноября 2022 года