Молекулярно-биологические основы защиты картофеля от пектолитических бактерий с помощью бактериофагов

Для удовлетворения растущих пищевых запросов населения Земли существует глобальная необходимость реконструкции сельскохозяйственных систем для повышения их эффективности, экономичности, наукоемкости и уменьшения агрохимической нагрузки на окружающую среду [1] (список использованной литературы приводится в приложенном файле). Бактериальные патогены, вызывающие заболевания растений – третья по важности (после сорных растений и грибковых болезней) причина экономических потерь в сельскохозяйственном производстве [2]. Для сдерживания распространения бактериальных болезней растений требуется применение комбинированной стратегии, включающей совершенствование селекции и технологий культивирования растений, применение бактерицидов и активаторов защитных систем растений, а также своевременную диагностику патогенов и карантинные меры [3,4]. Одним из перспективных подходов биологического контроля патогенных бактерий в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве считается применение бактериофагов – вирусов бактерий, их естественных паразитов и регуляторов микробных популяций [5,6]. Разнообразие бактериофагов в природе чрезвычайно велико, равно как и число используемых ими биохимических стратегий инфицирования и уничтожения бактерий. Многочисленные эксперименты показали, что применение бактериофагов как при вегетации, так и при хранении урожая способно существенно снизить поражение растений бактериальными патогенами [1,7,8]. Несмотря на большое количество научных сведений о бактериях – патогенах человека и активных против них бактериофагах, информация о фитопатогенных бактериях и их фагах остаётся малочисленной и разрозненной, особенно по геномным, транскриптомным, протеомным и метаболомным данным, полученных с помощью исследовательских методов нового поколения. Поскольку геномные данные являются определяющими для точной диагностики патогена, а анализ транскриптома и протеома важен для установления механизма патогенеза и пригодности бактериофага для борьбы с возбудителями болезней растений [5,7,9,10], то развитие сельскохозяйственной фаготерапии встречает множество препятствий. Полевая культура растений включает множество факторов, влияющих на выживание фагов на поверхности растений и почвы, а видовой и штаммовый состав популяции пектолитических фитопатогенов может существенно видоизменяться в течении вегетационного сезона за счет привнесения новых генотипов с дождевой и поливной водой, ветром и переносчиками. Предлагаемый проект исследует возможность применения композиций бактериофагов, инфицирующих пектолитические (мягкогнилостные) патогены картофеля Pectobacterium atrosepticum (Pa), P.carotovorum subsp. carotovorum (Pcc) и Dickeya spp. (Dsp), для предотвращения инфекции и развития бактериальных заболеваний при хранении товарного и семенного картофеля, т.е. в более стабильных, по сравнению с полевыми, условиях. В ходе проекта планируется создание коллекций типовых и наиболее распространенных в России штаммов Ра, Рсс и Dsp, а также вирулентных против них бактериофагов. Планируется системное исследование штаммов и бактериофагов в коллекциях современными генетическими и молекулярно-биологическими методами. Выбранные штаммы бактерий будут изучены методом полногеномного секвенирования и последующего биоинформационного анализа. Полученные данные позволят изучить существующие методы молекулярной диагностики Ра, Рсс и Dsp, выбрать наиболее оптимальные с точки зрения специфичности. Сравнительный биоинформационный анализ новых и ранее полученных полных геномов позволит предложить новые гены-маркеры, в перспективе служащие основой для определения патогенов картофеля в биопробах и их штаммовой дифференциации диагностическими методами на основе анализа нуклеиновых кислот (ПЦР, RCA, NASBA, LAMP, PSR, ДНК-гибридизационные микрочипы и др.). Собранная в ходе проекта коллекция охарактеризованных литических бактериофагов будет служить основой для создания полифаговых составов (коктейлей). Композиции бактериофагов Ра, Рсс и Dsp, конструируемые против определенных сочетаний штаммов патогенов, выявленных в конкретных биоценозах, будут тестироваться на широком круге моделей (in vitro, срезы клубней, опытные образцы картофельных клубней в термостате и, наконец, склады хранения товарного и семенного картофеля группы компаний «Агропромышленный парк» (Рогачево Дмитровского р-на Московской обл.)). Полученные данные позволят оптимизировать процессы подбора, культивирования, очистки, стабилизации фагов в составе коктейля, методы приложения, изучить влияние различных природных факторов на взаимодействие бактерий и вирусов. В результате выполнения проекта планируется разработка единого концептуального алгоритма «диагностика патогена – подбор фагов – конструирование препарата – применение». Полученные подходы могут быть в перспективе применены как по отношению к другим сельскохозяйственным бактериальным патогенам, так и другим биологическим системам (защита семенного картофеля при посадке, обеззараживание поливной воды, профилактика бактериозов в гидропонной культуре защищенного грунта).

6 Января 2016 года — 31 Декабря 2020 года

Мирошников К.А. (рук.)

Лаборатория молекулярной биоинженерии

Грант, РНФ

Список публикаций по проекту

  1. Evseev P, Sykilinda N, Gorshkova A, Kurochkina L, Ziganshin R, Drucker V, Miroshnikov K (2020). Pseudomonas Phage PaBG—A Jumbo Member of an Old Parasite Family. Viruses 12 (7),
  2. Evseev PV, Lukianova AA, Shneider MM, Korzhenkov AA, Bugaeva EN, Kabanova AP, Miroshnikov KK, Kulikov EE, Toshchakov SV, Ignatov AN, Miroshnikov KA (2020). Origin and Evolution of Studiervirinae Bacteriophages Infecting Pectobacterium: Horizontal Transfer Assists Adaptation to New Niches. Microorganisms 8 (11), 1–27
  3. Ngoc Ha VT, Voronina MV, Kabanova AP, Shneider MM, Korzhenkov AA, Toschakov SV, Miroshnikov KK, Miroshnikov KA, Ignatov AN (2019). First report of pectobacterium parmentieri causing stem rot disease of potato in Russia. PLANT DIS 103 (1), 144
  4. Kabanova AP, Shneider MM, Korzhenkov AA, Bugaeva EN, Miroshnikov KK, Zdorovenko EL, Kulikov EE, Toschakov SV, Ignatov AN, Knirel YA, Miroshnikov KA (2019). Host Specificity of the Bacteriophage PP35 Is Directed by a Tail Spike Interaction With Bacterial -Antigen, Enabling the Infection of Alternative Non-pathogenic Bacterial Host. Front Microbiol 9 (JAN), 3288
  5. Voronina MV, Kabanova AP, Shneider MM, Korzhenkov AA, Toschakov SV, Miroshnikov KK, Miroshnikov KA, Ignatov AN (2019). First report of pectobacterium carotovorum subsp. Brasiliense causing blackleg and stem rot disease of potato in Russia. PLANT DIS 103 (2), 364
  6. Voronina MV, Bugaeva EN, Vasiliev DM, Kabanova AP, Barannik AP, Shneider MM, Kulikov EE, Korzhenkov AA, Toschakov SV, Ignatov AN, Miroshnikov KA (2019). Characterization of Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum Bacteriophage PP16 Prospective for Biocontrol of Potato Soft Rot. Microbiology 88 (4), 451–460
  7. Voronina MV, Lukianova AA, Shneider MM, Korzhenkov AA, Toschakov SV, Miroshnikov KA, Vasiliev DM, Ignatov A (2021). First Report of Pectobacterium polaris Causing Soft Rot and Black Leg of Potato in Russia. PLANT DIS 105 (6),
  8. Lukianova AA, Evseev PV, Stakheev AA, Kotova IB, Zavriev SK, Ignatov AN, Miroshnikov KA (2021). Development of qPCR Detection Assay for Potato Pathogen Pectobacterium atrosepticum Based on a Unique Target Sequence. Plants (Basel) 10 (2), 1–13
  9. Bugaeva EN, Voronina MV, Vasiliev DM, Lukianova AA, Landyshev NN, Ignatov AN, Miroshnikov KA (2021). Use of a specific phage cocktail for soft rot control on ware potatoes: A case study. Viruses 13 (6),
  10. Lukianova AA, Shneider MM, Evseev PV, Shpirt AM, Bugaeva EN, Kabanova AP, Obraztsova EA, Miroshnikov KK, Senchenkova SN, Shashkov AS, Toschakov SV, Knirel YA, Ignatov AN, Miroshnikov KA (2020). Morphologically Different Pectobacterium brasiliense Bacteriophages PP99 and PP101: Deacetylation of O-Polysaccharide by the Tail Spike Protein of Phage PP99 Accompanies the Infection. Front Microbiol 10, 3147
  11. Shirshikov FV, Korzhenkov AA, Miroshnikov KK, Kabanova AP, Barannik AP, Ignatov AN, Miroshnikov KA (2018). Draft genome sequences of new genomospecies. Genome Announc 6 (15), e00260–18
  12. Shneider MM, Lukianova AA, Evseev PV, Shpirt AM, Kabilov MR, Tokmakova AD, Miroshnikov KK, Obraztsova EA, Baturina OA, Shashkov AS, Ignatov AN, Knirel YA, Miroshnikov KA (2020). Autographivirinae Bacteriophage Arno 160 Infects Pectobacterium carotovorum via Depolymerization of the Bacterial O-Polysaccharide. Int J Mol Sci 21 (9),