Целью данного проекта является создание аналитической методики 3D TERS для наномасштабной объемной визуализации и спектрального анализа широкого класса биоматериалов, а также разработка измерительных методик для применения данного метода в биомедицинских исследованиях. Одной из важнейших задач фундаментальных медико-биологических исследований является использование их результатов для предупреждения и лечения социально-значимых заболеваний. Доклинические медико-биологические исследования являются ключевым звеном, связывающим фундаментальную науку и клиническую практику. В доклинических исследованиях результаты) полученные in vitro, применяются на моделях in vivo. Поэтому чрезвычайно важно детально понимать молекулярные механизмы развития патологических процессов и уметь оценивать структурные изменения в тканях и клетках, как под действием патогенных факторов, так и в результате терапевтического воздействия. Указанная причина определяет высокую актуальность развития методик, позволяющих со сверхвысоким разрешением визуализировать и анализировать молекулярные и надмолекулярные структуры клеток, что дает понимание молекулярных механизмов, ответственных за множество процессов таких как, механизмы возникновения патологий или адресной доставки лекарств. Многие из ныне разработанных аналитических методов (электронная микроскопия (ЭМ), сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ), оптическая микроскопия сверхвысокого разрешения (STORM, STED и т.д.)) позволяют исследовать ультраструктуру клеточных компонентов с разрешением от единиц до десятков нанометров. Каждый из подобных методов обладает значительным потенциалом, однако основным их недостатком является отсутствие возможности химического анализа образцов которую предоставляют, например, методы оптической микроспектроскопии (ОМ). Кроме того, недостатком большинства подобных методик является отсутствие возможности полноценного 3D-анализа образцов. В свою очередь, основным недостатком ОМ является низкое пространственное разрешение, определяемое дифракционным пределом, и составляет величину сопоставимую с длиной волны света – сотни нанометров, даже в случае таких прогрессивны методов ОМ, как конфокальная или 4pi-микроскопия. Таким образом, становится очевидно, что наиболее перспективным направлением является комбинирование и мультиплицирование разных модальностей ОМ и различных методов высокоразрешающей микроскопии – корреляционная микроскопия. Одним из наиболее ярких примеров корреляционной микроскопии, объединяющей в себе наномасштабные морфологический (методики СЗМ) и спектральный анализы является сканирующая спектроскопия локально усиленного СЗМ-зондом комбинационного рассеяния (КР) или флуоресценции - TERS (Tip Enhanced Raman Spectroscopy). Однако, до сего момента эта методика реализуется исключительно для получения 2D-данных. Следовательно, основной научной проблемой в области разработки аналитических методов для биомедицинских исследований является отсутствие комбинированной аналитической методики способной на сопоставимом наномасштабном уровне одновременно визуализировать и химически анализировать (ОМ) молекулярные и надмолекулярные клеточные ультраструктуы. Предлагаемое в рамках данного проекта решение указанной проблемы основано на разработке аппаратно-методического комплекса для реализации нового инструментального метода наномасштабной объемной визуализации и спектрального анализа - 3D TERS. Предлагаемый метод основан на использовании комбинации TERS, СЗМ и методики восстановления 3D-ультраструктуры материалов методом ультрамикротомии (УМТ). За счет локализации электромагнитного поля вблизи острия СЗМ-зонда метод 3D TERS позволит получать спектральные изображения (каритрование) в режиме зондового усиления КР или флуоресценции исследуемых объектов с пространственным разрешениям на порядок ниже дифракционного предела. При этом данный подход сохраняет возможность использования всех основных режимов СЗМ. Получение комплементарных 3D-данных осуществляется за счет многократного последовательного применения методов TERS и СЗМ после очередного УМТ-среза на оставшейся после среза поверхности образца. Итоговым результатом применения разрабатываемой методики будет восстановленная 3D ультраструктура анализируемого образца – как морфологическая, так и спектральная. Ранее коллективом заявителей данного проекта были успешно выполнены работы по созданию уникальной научной установки (УНУ - http://ckp-rf.ru/usu/486825/) объединяющей методики конфокальной ОМ, СЗМ и УМТ - сканирующая корреляционная нанотомография (СКНТ). Однако чрезвычайно низкое разрешение конфокальной ОМ по сравнению с СЗМ ставит необходимость проведения существенных как конструкторских, так и методических работ для создания методики позволяющей сделать сопоставимыми пространственные разрешения спектрального и морфологического анализов. Естественным решением в данном случае является методика 3D TERS. Важно отметить, что разработанная ранее установка СКНТ является единственным прибором в мире способным реализовать такой вид корреляционной микроскопии и коллектив заявителей проекта на данный момент не имеет конкурентов. Соответственно, дальнейшее развитие авторской методики СКНТ до уровня 3D TERS автоматически обуславливает новизну результатов проекта. Кроме того, одной из важнейших задач предлагаемого проекта является разработка пакета измерительных методик для аппаратно-методического комплекса 3D TERS для его внедрения в биомедицинских исследованиях. В ходе данного проекта планируется разработать экспериментальные процедуры внутриклеточного наномасштабного 3D спектрально-морфологического картирования противоракового препарата доксорубицина или его производных как свободного, так и загруженного в различные наноносители, после эндоцитоза раковыми и здоровыми клетками в двух in vitro моделях - монослой и опухолевые сфероиды. Результаты выполняемого проекта могут быть востребованы не только в биомедицинских исследованиях, но также для анализа структурных, физических и химических свойств широкого класса полимерных, композитных, неорганических материалов и гибридных наноструктур.