Лаборатория биофотоники

Отдел геномики и постгеномных технологий

Руководитель: Лукьянов Константин Анатольевич, чл.-корр. РАН
kluk@ibch.ru+7(495)995-55-57#2518

Флуоресцентные белки, фотоактивируемые флуоресцентные белки, генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры, мечение живых клеток, генетически кодируемые фотосенсибилизаторы

Лаборатория работает над созданием новых флуоресцентных меток и методов флуоресцентного мечения биологических объектов. Особый интерес для нас представляют флуоресцентные белки семейства GFP (Green fluorescent protein) и другие методы неинвазивного флуоресцентного мечения, которые позволяют наблюдать структуры и процессы в живых клетках. Такие методы находят широкое применение в биомедицинских исследованиях, помогая расшифровать молекулярные механизмы разнообразных нормальных и патологических процессов и упрощая проведение доклинических испытаний лекарственных препаратов.

Лаборатория оснащена всем необходимым для проведения генно-инженерных работ, ведения культур клеток млекопитающих, флуоресцентной и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и оптической спектроскопии.

Лаборатория активно сотрудничает со многими лабораториями и группами Института: группой синтеза природных соединений ИБХ по изучению физико-химических свойств хромофоров флуоресцентных белков и созданию методов флуоресцентного мечения на основе их аналогов; с лабораторией молекулярных технологий ИБХ по разработке новых флуоресцентных сенсоров; с лабораторией рентгеноструктурного анализа ИБХ по анализу пространственной структуры флуоресцентных белков и направленному изменению их спектральных свойств; с лабораторией молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ по применению флуоресцентных инструментов для изучения индивидуального развития.

Кроме того, Лаборатория работает над исследованиями совместно с Научно-исследовательским институтом биомедицинских технологий Нижегородской государственной медицинской академии по развитию методов флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, а также по применению флуоресцентного мечения в мышиных моделях опухолеобразования; с лабораторией физической биохимии Института биохимии им. А.Н.Баха РАН по развитию методов время-разрешенной микроскопии для анализа биологических объектов; с Кириллом Солнцевым (Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA) по время-разрешенной спектроскопии флуоресцентных белков и хромофоров; с лабораторией Анны Крыловой (University of Southern California, Los Angeles, CA) по изучению физико-химических процессов во флуоресцентных белках; с лабораторией Владислава Верхуши (Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY) по созданию новых флуоресцентных белков; с лабораторией Jens Meiler (Vanderbilt University, Nashville, TN) по компьютерному моделированию флуоресцентных белков.

Лаборатория была образована в 2009 году путем выделения из лаборатории молекулярных технологий для биологии и медицины под руководством Сергея Анатольевича Лукьянова. Коллектив работает с флуоресцентными белками с 1999 года.

Новые флуоресцентные белки

GFP и другие флуоресцентные белки широко применяются как генетически кодируемые метки для визуализации белков и клеточных популяций в живых системах. Мы используем направленный и случайный мутагенез для создания новых вариантов флуоресцентных белков. Такой подход позволяет получать белки с необычными спектральными свойствами, определяемыми новыми хромофорными группами или аминокислотным окружением хромофора. Кроме того, мы работаем над улучшением таких характеристик, как яркость и фотостабильность, важных для практического применения  флуоресцентных белков. 

Chudakov DM, et al. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 2010, 90, 1103-63.

Pletnev VZ, et al. Structure of the red fluorescent protein from a lancelet (Branchiostoma lanceolatum): a novel GYG chromophore covalently bound to a nearby tyrosine. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2013, 69, 1850-60.

Sarkisyan KS, et al. Green fluorescent protein with anionic tryptophan-based chromophore and long fluorescence lifetime. Biophys J. 2015, 109, 380-9.

Mishin AS, et al. Novel uses of fluorescent proteins. Curr Opin Chem Biol. 2015, 27, 1-9.

Sarkisyan KS, et al. Local fitness landscape of the green fluorescent protein. Nature. 2016, 533, 397-401.

Bozhanova NG, et al. Yellow and Orange Fluorescent Proteins with Tryptophan-based Chromophores. ACS Chem Biol. 2017 Jul 21;12(7):1867-1873.

Povarova NV, et al. Functioning of Fluorescent Proteins in Aggregates in Anthozoa Species and in Recombinant Artificial Models. Int J Mol Sci. 2017 Jul 12;18(7). pii: E1503. doi: 10.3390/ijms18071503.

Bozhanova NG, et al. Protein labeling for live cell fluorescence microscopy with a highly photostable renewable signal. Chem. Sci., 2017, 8, 7138-7142.

 

Новые генетически кодируемые сенсоры

Мы ведем работу по созданию новых сенсоров на различные регуляторные активности на основе флуоресцентных белков, которые позволяют проводить количественную визуализацию целевых процессов в живых клетках. Например, недавно нами был разработан сенсор активности каскада нонсенс-опосредованной деградации мРНК (nonsense-mediated mRNA decay, NMD), а также дальнекрасный сенсор активности каспазы-3.

Gurskaya NG, et al. Analysis of alternative splicing of cassette exons at single-cell level using two fluorescent proteins. Nucleic Acids Res. 2012, 40, e57.

Pereverzev AP, et al. Method for quantitative analysis of nonsense-mediated mRNA decay at the single cell level. Sci Rep. 2015, 5, 7729.

Zlobovskaya OA, et al. Genetically encoded far-red fluorescent sensors for caspase-3 activity. Biotechniques. 2016, 60, 62-8.

Sergeeva TF, et al. Relationship between intracellular pH, metabolic co-factors and caspase-3 activation in cancer cells during apoptosis. Biochim Biophys Acta. 2017, 1864(3):604-611.

Kost LA, Nikitin ES, Ivanova VO, Sung U, Putintseva EV, Chudakov DM, Balaban PM, Lukyanov KA, Bogdanov AM. Insertion of the voltage-sensitive domain into circularly permuted red fluorescent protein as a design for genetically encoded voltage sensor. PLoS One. 2017 Sep 1;12(9):e0184225.

 

Фотоконверсии флуоресцентных белков

Фотоактивируемые флуоресцентные белки (ФАФБ) широко используются для слежения за движением белков, органелл и клеток в живых системах, а также во флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения. Ранее нашим коллективом были получены одни из первых ФАФБ, такие как KFP1, PS-CFP и Dendra. В настоящее время мы продолжаем работы по получению новых ФАФБ, а также созданию новых методов их применения.

В 2009 г нами была открыта окислительная фотоконверсия зеленых флуоресцентных белков, основанная на передаче электронов от хромофора на молекулу внешнего акцептора электронов. Мы продолжаем исследование механизмов данного явления и разработку методов его практического использования (например, для увеличения фотостабильн ости флуоресцентных белков).

В сотрудничестве с Нижегородской медицинской академией мы работаем над новыми метками и методами флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения на основе детекции единичных молекул (локализационная микроскопия единичных молекул PALM/STORM).

Chudakov DM, et al. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nat Biotechnol. 2003, 21, 191-4. 

Gurskaya NG, et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat Biotechnol. 2006, 24, 461-5.

Bogdanov AM, et al. Green fluorescent proteins are light-induced electron donors. Nat Chem Biol. 2009, 5, 459-61.

Bogdanov AM, et al. Cell culture medium affects GFP photostability: a solution. Nat Methods. 2009, 6, 859-60.

Mamontova AV, et al. Influence of cell growth conditions and medium composition on EGFP photostability in live cells. Biotechniques. 2015, 58, 258-61.

Bogdanov AM, et al. Turning On and Off Photoinduced Electron Transfer in Fluorescent Proteins by π-Stacking, Halide Binding, and Tyr145 Mutations. J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 4807-4817.

Acharya A, et al. Photoinduced Chemistry in Fluorescent Proteins: Curse or Blessing? Chem Rev. 2017 Jan 25;117(2):758-795.

Klementieva NV, et al. Green-to-red primed conversion of Dendra2 using blue and red lasers. Chem Commun (Camb). 2016 Nov 18;52(89):13144-13146.

Klementieva NV, et al. Intrinsic blinking of red fluorescent proteins for super-resolution microscopy. Chem Commun (Camb). 2017 Jan 10;53(5):949-951.

 

Генетически кодируемые фотосенсибилизаторы

Фототоксичные флуоресцентные белки, первый из которых – KillerRed – был создан нами в 2006 году, продуцируют активные формы кислорода (АФК) при облучении светом. Мы продолжаем развитие данной оптогенетической технологии, которая дает возможность создавать окислительный стресс в целевых клеточных компартментах, инактивировать белки и вызывать клеточную гибель специфических клеточных популяций с помощью света.

Bulina ME, et al. A genetically encoded photosensitizer. Nat Biotechnol. 2006, 24, 95-9.

Lukyanov KA, et al. Fluorescent proteins as light-inducible photochemical partners. Photochem Photobiol Sci. 2010, 9, 1301-6.

Serebrovskaya EO, et al. Phototoxic effects of lysosome-associated genetically encoded photosensitizer KillerRed. J Biomed Opt. 2014,19, 071403.

Sarkisyan KS, et al. KillerOrange, a Genetically Encoded Photosensitizer Activated by Blue and Green Light. PLoS One. 2015, 10, e0145287.

2002—2006. Создана панель фотоактивируемых флуоресцентных белков с различным типом свето-индуцируемых спектральных переходов: нефлуоресцентный→красный (KFP1), голубой→зеленый (PS-CFP) и зеленый→красный (Dendra). Продемонстрирована применимость KFP1, PS-CFP и Dendra для прицельного фотомечения клеток, внутриклеточных органелл и белков и последующего слежение за их перемещениями, а также для мониторинга деградации целевых белков на уровне отдельных клеток в реальном времени с помощью флуоресцентной и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

2005—2006. Создан первый генетически кодируемый фотосенсибилизатор — фототоксичный красный флуоресцентный белок, названный KillerRed, который может быть использован для прицельного свето-индуцированного уничтожения клеток и белков.

2005—2007. Методами направленной молекулярной эволюции получены улучшенные флуоресцентные белки, адаптированные к практическому применению. В частности, получены красные и дальне-красные белки, превосходящие по яркости все известные аналогичные флуоресцентные белки, разработанные в других лабораториях мира. Яркие дальне-красные флуоресцентные белки открывают новые перспективы флуоресцентного мечения лабораторных животных на уровне целых организмов.

2005—2008. Впервые осуществлен синтез «красных» хромофоров природных GFP-подобных белков — asFP595, Kaede и их аналоги. Данная работа позволила выявить закономерности влияния различных заместителей на спектральные свойства хромофоров, а также предложить перспективные направления мутагенеза флуоресцентных белков с целью получения вариантов с новыми спектральными характеристиками.

Ф.И.О.ДолжностьКонтакты
Лукьянов Константин Анатольевич, чл.-корр. РАНрук. подр.kluk@ibch.ru+7(495)995-55-57#2518
Гурская Надежда Георгиевна, к. б. н.с.н.с.ngurskaya@ibch.ru+7(499)742-81-22
Мишин Александр Сергеевич, к. б. н.с.н.с.mishin@ibch.ru+7(495)995-55-57#2518
Ямпольский Илья Викторович, д. х. н.н.с.ivyamp@ibch.ru+7(499)724-81-22
Богданов Алексей Михайлович, к. б. н.н.с.noobissat@gmail.com+7(499)742-81-22
Рюмина Алина Павловнам.н.с.ryumina-07@mail.ru
Поварова Наталья Владимировнам.н.с.povarovanv@gmail.com+7(915)0447115
Злобовская Ольга Анатольевнам.н.с.olgazlob@yandex.ru+7()
Божанова Нина Георгиевнаасп.nbozhanova@gmail.com
Кост Любовь Александровнаасп.lu.kurkova@gmail.com
Мамонтова Анастасия Вячеславовнаасп.sphingozin@gmail.com
Гавриков Алексе Семеновичтех.-лаб.
Гладкова Любовь Николаевнаинженер+7(499)742-81-22
Колесов Данила Вадимовичинженерkolesov14@inbox.ru
Горбачев Дмитрий Андреевичинженер
Перфилов Максим Михайловичинженер
Шагин Дмитрий Алексеевич, к. б. н.ст. инж.shagdim@evrogen.ru

Ранее здесь работали:

Матвеева Надежда Константиновнапом. дир.luk.officemanager@gmail.com
Саркисян Карен Сергеевичс.н.с.durshlak@gmail.com
Серебровская Екатерина Олеговна, к. б. н.н.с.katya_akts@ibch.ru
Маркина Надежда Михайловнам.н.с.markina.nadya@gmail.com
Белоусова Анна Алексеевнастуд.amb.ence@gmail.com

Избранные публикации

  1. Pennacchietti F, Serebrovskaya EO, Faro AR, Shemyakina II, Bozhanova NG, Kotlobay AA, Gurskaya NG, Bodén A, Dreier J, Chudakov DM, Lukyanov KA, Verkhusha VV, Mishin AS, Testa I (2018). Fast reversibly photoswitching red fluorescent proteins for live-cell RESOLFT nanoscopy. Nat Methods 15 (8), 601–604
  2. Осипова ЗМ, Щеглов АС, Ямпольский ИВ (2018). Новая биолюминесцентная система грибов: перспективы использования в медицинских исследованиях.  (0),
  3. Chen C, Liu W, Baranov MS, Baleeva NS, Yampolsky IV, Zhu L, Wang Y, Shamir A, Solntsev KM, Fang C (2017). Unveiling Structural Motions of a Highly Fluorescent Superphotoacid by Locking and Fluorinating the GFP Chromophore in Solution. J Phys Chem Lett 8 (23), 5921–5928
  4. Пуртов КВ, Осипова ЗМ, Петушков ВН, Родионова НС, Царькова АС, Котлобай АА, Чепурных ТВ, Гороховатский АЮ, Ямпольский ИВ, Гительзон ИИ (2017). Структура оксилюциферина грибов – продукта реакции биолюминесценции. 477 (2), 245–248
  5. Kaskova ZM, Dörr FA, Petushkov VN, Purtov KV, Tsarkova AS, Rodionova NS, Mineev KS, Guglya EB, Kotlobay A, Baleeva NS, Baranov MS, Arseniev AS, Gitelson JI, Lukyanov S, Suzuki Y, Kanie S, Pinto E, Mascio PD, Waldenmaier HE, Pereira TA, Carvalho RP, Oliveira AG, Oba Y, Bastos EL, Stevani CV, Yampolsky IV (2017). Mechanism and color modulation of fungal bioluminescence. Sci Adv 3 (4), e1602847
  6. Acharya A, Bogdanov AM, Grigorenko BL, Bravaya KB, Nemukhin AV, Lukyanov KA, Krylov AI (2017). Photoinduced chemistry in fluorescent proteins: Curse or blessing? Chem Rev 117 (2), 758–795
  7. Bozhanova NG, Baranov MS, Klementieva NV, Sarkisyan KS, Gavrikov AS, Yampolsky IV, Zagaynova EV, Lukyanov SA, Lukyanov KA, Mishin AS (2017). Protein labeling for live cell fluorescence microscopy with a highly photostable renewable signal. Chem Sci 8 (10), 7138–7142
  8. Мамонтова АВ, Григорьев АП, Царькова АС, Лукьянов КА, Богданов АМ (2017). БОРЬБА ЗА ФОТОСТАБИЛЬНОСТЬ: МЕХАНИЗМЫ ОБЕСЦВЕЧИВАНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ. 43 (6), 598–607
  9. Tsarkova AS, Kaskova ZM, Yampolsky IV (2016). A Tale of Two Luciferins: Fungal and Earthworm New Bioluminescent Systems. Acc Chem Res 49 (11), 2372–2380
  10. Kaskova ZM, Tsarkova AS, Yampolsky IV (2016). 1001 lights: Luciferins, luciferases, their mechanisms of action and applications in chemical analysis, biology and medicine. Chem Soc Rev 45 (21), 6048–6077
  11. (патент) Ямпольский ИВ, Петушков ВН, Пуртов КВ, Родионова НС, Баранов МС (2016). Метод и реактивы для детекции активности люциферазы. №2596398 (изобретение)
  12. Sarkisyan KS, Bolotin DA, Meer MV, Usmanova DR, Mishin AS, Sharonov GV, Ivankov DN, Bozhanova NG, Baranov MS, Soylemez O, Bogatyreva NS, Vlasov PK, Egorov ES, Logacheva MD, Kondrashov AS, Chudakov DM, Putintseva EV, Mamedov IZ, Tawfik DS, Lukyanov KA, Kondrashov FA (2016). Local fitness landscape of the green fluorescent protein. Nature 533 (7603), 397–401
  13. Bogdanov AM, Acharya A, Titelmayer AV, Mamontova AV, Bravaya KB, Kolomeisky AB, Lukyanov KA, Krylov AI (2016). Turning on and off Photoinduced Electron Transfer in Fluorescent Proteins by π-Stacking, Halide Binding, and Tyr145 Mutations. J Am Chem Soc 138 (14), 4807–4817
  14. Балеева НС, Ямпольский ИВ, Баранов МС (2016). Борированные производные хромофора зеленого флуоресцентного белка как потенциальные флуоресцентные сенсоры. 42 (4), 501–504
  15. Плетнёв ВЗ, Плетнева НВ, Ефремов РГ, Горячева ЕА, Артемьев ИВ, Архипова СФ, Саркисян КС, Мишин АС, Лукьянов КА, Плетнев СВ (2016). Пространственная структура рН-зависимого зеленого флуоресцентного белка WASCFP с депротонированным хромофором на основе триптофана. 42 (6), 675–682
  16. Pletnev VZ, Pletneva NV, Efremov RG, Goryacheva EA, Artemyev IV, Arkhipova SF, Sarkisyan KS, Mishin AS, Lukyanov KA, Pletnev SV (2016). Three-dimensional structure of pH-dependent fluorescent protein WasCFP with the tryptophan based deprotonated chromophore. 42 (6), 612–618
  17. Mishin AS, Belousov VV, Solntsev KM, Lukyanov KA (2015). Novel uses of fluorescent proteins. Curr Opin Chem Biol 27 (0), 1–9
  18. Purtov KV, Petushkov VN, Baranov MS, Mineev KS, Rodionova NS, Kaskova ZM, Tsarkova AS, Petunin AI, Bondar VS, Rodicheva EK, Medvedeva SE, Oba Y, Oba Y, Arseniev AS, Lukyanov S, Gitelson JI, Yampolsky IV (2015). The Chemical Basis of Fungal Bioluminescence. Angew Chem Int Ed Engl 54 (28), 8124–8128
  19. Yampolsky IV, Lukyanov KA, Baranov MS (2015). Boron-containing 5-arylidene-3,5-dihydro-4H-imidazol-4-ones. 9 (133), 220
  20. Dubinnyi MA, Kaskova ZM, Rodionova NS, Baranov MS, Gorokhovatsky AY, Kotlobay A, Solntsev KM, Tsarkova AS, Petushkov VN, Yampolsky IV (2015). Novel Mechanism of Bioluminescence: Oxidative Decarboxylation of a Moiety Adjacent to the Light Emitter of Fridericia Luciferin. Angew Chem Int Ed Engl 54 (24), 7065–7067
  21. Mishina NM, Mishin AS, Belyaev Y, Bogdanova EA, Lukyanov S, Schultz C, Belousov VV (2015). Live-cell STED microscopy with genetically encoded biosensor. Nano Lett 15 (5), 2928–2932
  22. Petushkov VN, Dubinnyi MA, Tsarkova AS, Rodionova NS, Baranov MS, Kublitski VS, Shimomura O, Yampolsky IV (2014). A novel type of luciferin from the siberian luminous earthworm fridericia heliota: Structure elucidation by spectral studies and total synthesis. Angew Chem Int Ed Engl 53 (22), 5566–5568
  23. Shugay M, Britanova OV, Merzlyak EM, Turchaninova MA, Mamedov IZ, Tuganbaev TR, Bolotin DA, Staroverov DB, Putintseva EV, Plevova K, Linnemann C, Shagin D, Pospisilova S, Lukyanov S, Schumacher TN, Chudakov DM (2014). Towards error-free profiling of immune repertoires. Nat Methods 11 (6), 653–655
  24. Переверзев АП, Маркина НМ, Янушевич ЮГ, Городничева ТВ, Минасян БЭ, Лукьянов КА, Гурская НГ (2013). УСИЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ХИМЕРНЫХ ГЕНОВ ВКЛЮЧЕНИЕМ В ИХ 3’-НЕТРАНСЛИРУЕМУЮ ОБЛАСТЬ ИНТРОНА 2 ГЕНА БЕТА-ГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА. 40 (3), 293–296
  25. Lukyanov KA, Belousov VV (2012). Biophotonics: The slow fade of cell fluorescence. Nat Photonics 6 (10), 641–643
  26. Baranov MS, Lukyanov KA, Borissova AO, Shamir J, Kosenkov D, Slipchenko LV, Tolbert LM, Yampolsky IV, Solntsev KM (2012). Conformationally locked chromophores as models of excited-state proton transfer in fluorescent proteins. J Am Chem Soc 134 (13), 6025–6032
  27. Gurskaya NG, Staroverov DB, Zhang L, Fradkov AF, Markina NM, Pereverzev AP, Lukyanov KA (2012). Analysis of alternative splicing of cassette exons at single-cell level using two fluorescent proteins. Nucleic Acids Res 40 (8), e57
  28. Shcherbo D, Shemiakina II, Ryabova AV, Luker KE, Schmidt BT, Souslova EA, Gorodnicheva TV, Strukova L, Shidlovskiy KM, Britanova OV, Zaraisky AG, Lukyanov KA, Loschenov VB, Luker GD, Chudakov DM (2010). Near-infrared fluorescent proteins. Nat Methods 7 (10), 827–829
  29. Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S, Lukyanov KA (2010). Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev 90 (3), 1103–1163
  30. Bogdanov AM, Bogdanova EA, Chudakov DM, Gorodnicheva TV, Lukyanov S, Lukyanov KA (2009). Cell culture medium affects GFP photostability: A solution. Nat Methods 6 (12), 859–860
  31. Serebrovskaya EO, Edelweiss EF, Stremovskiy OA, Lukyanov KA, Chudakov DM, Deyev SM (2009). Targeting cancer cells by using an antireceptor antibody-photosensitizer fusion protein. Proc Natl Acad Sci U S A 106 (23), 9221–9225
  32. Bogdanov AM, Mishin AS, Yampolsky IV, Belousov VV, Chudakov DM, Subach FV, Verkhusha VV, Lukyanov S, Lukyanov KA (2009). Green fluorescent proteins are light-induced electron donors. Nat Chem Biol 5 (7), 459–461
  33. Schostak N, Pyatkov K, Zelentsova E, Arkhipova I, Shagin D, Shagina I, Mudrik E, Blintsov A, Clark I, Finnegan DJ, Evgenev M (2008). Molecular dissection of Penelope transposable element regulatory machinery. Nucleic Acids Res 36 (8), 2522–2529
  34. Cox LJ, Hengst U, Gurskaya NG, Lukyanov KA, Jaffrey SR (2008). Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat Cell Biol 10 (2), 149–159
  35. Богданов АА, Иванов ЮВ, Косьяненко НА, Потехин СА, Суржик МА, Тимковский АЛ, Феофанов СА, Хусаинова РС, Яковлев КИ (2008). Дестабилизация и стабилизация структуры поли(А)-поли(У) соединениями двухвалентной платины. 53 (5), 740–743
  36. Shcherbo D, Merzlyak EM, Chepurnykh TV, Fradkov AF, Ermakova GV, Solovieva EA, Lukyanov KA, Bogdanova EA, Zaraisky AG, Lukyanov S, Chudakov DM (2007). Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat Methods 4 (9), 741–746
  37. Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA (2007). Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nat Protoc 2 (8), 2024–2032
  38. Merzlyak EM, Goedhart J, Shcherbo D, Bulina ME, Shcheglov AS, Fradkov AF, Gaintzeva A, Lukyanov KA, Lukyanov S, Gadella TWJ, Chudakov DM (2007). Bright monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime. Nat Methods 4 (7), 555–557
  39. Lukyanov SA, Lukyanov KA, Gurskaya NG, Bogdanova EA, Buzdin AA (2007). Selective suppression of polymerase chain reaction and its most popular applications.  (0), 29–51
  40. Shcheglov AS, Zhulidov PA, Bogdanova EA, Shagin DA (2007). Normalization of cDNA libraries.  (0), 97–124
  41. Evdokimov AG, Pokross ME, Egorov NS, Zaraisky AG, Yampolsky IV, Merzlyak EM, Shkoporov AN, Sander I, Lukyanov KA, Chudakov DM (2006). Structural basis for the fast maturation of Arthropoda green fluorescent protein. EMBO Rep 7 (10), 1006–1012
  42. Bulina ME, Lukyanov KA, Britanova OV, Onichtchouk D, Lukyanov S, Chudakov DM (2006). Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nat Protoc 1 (2), 947–953
  43. Gurskaya NG, Verkhusha VV, Shcheglov AS, Staroverov DB, Chepurnykh TV, Fradkov AF, Lukyanov S, Lukyanov KA (2006). Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat Biotechnol 24 (4), 461–465
  44. Belousov VV, Fradkov AF, Lukyanov KA, Staroverov DB, Shakhbazov KS, Terskikh AV, Lukyanov S (2006). Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods 3 (4), 281–286
  45. Bulina ME, Chudakov DM, Britanova OV, Yanushevich YG, Staroverov DB, Chepurnykh TV, Merzlyak EM, Shkrob MA, Lukyanov S, Lukyanov KA (2006). A genetically encoded photosensitizer. Nat Biotechnol 24 (1), 95–99
  46. Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA (2005). Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends Biotechnol 23 (12), 605–613
  47. Lukyanov KA, Chudakov DM, Lukyanov S, Verkhusha VV (2005). Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol 6 (11), 885–891
  48. Chudakov DM, Verkhusha VV, Staroverov DB, Souslova EA, Lukyanov S, Lukyanov KA (2004). Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. Nat Biotechnol 22 (11), 1435–1439
  49. Zhulidov PA, Bogdanova EA, Shcheglov AS, Vagner LL, Khaspekov GL, Kozhemyako VB, Matz MV, Meleshkevitch E, Moroz LL, Lukyanov SA, Shagin DA (2004). Simple cDNA normalization using kamchatka crab duplex-specific nuclease. Nucleic Acids Res 32 (3), e37
  50. Shagin DA, Barsova EV, Yanushevich YG, Fradkov AF, Lukyanov KA, Labas YA, Semenova TN, Ugalde JA, Meyers A, Nunez JM, Widder EA, Lukyanov SA, Matz MV (2004). GFP-like Proteins as Ubiquitous Metazoan Superfamily: Evolution of Functional Features and Structural Complexity. Mol Biol Evol 21 (5), 841–850
  51. Verkhusha VV, Lukyanov KA (2004). The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins. Nat Biotechnol 22 (3), 289–296
  52. Chudakov DM, Belousov VV, Zaraisky AG, Novoselov VV, Staroverov DB, Zorov DB, Lukyanov S, Lukyanov KA (2003). Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nat Biotechnol 21 (2), 191–194
  53. Shagin DA, Rebrikov DV, Kozhemyako VB, Altshuler IM, Shcheglov AS, Zhulidov PA, Bogdanova EA, Staroverov DB, Rasskazov VA, Lukyanov S (2002). A novel method for SNP detection using a new duplex-specific nuclease from crab hepatopancreas. Genome Res 12 (12), 1935–1942
  54. Labas YA, Gurskaya NG, Yanushevich YG, Fradkov AF, Lukyanov KA, Lukyanov SA, Matz MV (2002). Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. Proc Natl Acad Sci U S A 99 (7), 4256–4261
  55. Rebrikov DV, Britanova OV, Gurskaya NG, Lukyanov KA, Tarabykin VS, Lukyanov SA (2000). Mirror orientation selection (MOS): a method for eliminating false positive clones from libraries generated by suppression subtractive hybridization. Nucleic Acids Res 28 (20), E90
  56. Panchina Y, Kelmanson I, Matz M, Lukyanov K, Usman N, Lukyanov S (2000). A ubiquitous family of putative gap junction molecules [2]. Curr Biol 10 (13), R473–4
  57. Shagin DA, Lukyanov KA, Vagner LL, Matz MV (1999). Regulation of average length of complex PCR product. Nucleic Acids Res 27 (18), e23
  58. Matz M, Shagin D, Bogdanova E, Britanova O, Lukyanov S, Diatchenko L, Chenchik A (1999). Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR. Nucleic Acids Res 27 (6), 1558–1560
  59. Matz M, Usman N, Shagin D, Bogdanova E, Lukyanov S (1997). Ordered differential display: A simple method for systematic comparison of gene expression profiles. Nucleic Acids Res 25 (12), 2541–2542
  60. Diatchenko L, Lau YFC, Campbell AP, Chenchik A, Moqadam F, Huang B, Lukyanov S, Lukyanov K, Gurskaya N, Sverdlov ED, Siebert PD (1996). Suppression subtractive hybridization: A method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc Natl Acad Sci U S A 93 (12), 6025–6030
  61. Lukyanov KA, Matz MV, Bogdanova EA, Gurskaya NG, Lukyanov SA (1996). Molecule by molecule PCR amplification of complex DNA mixtures for direct sequencing: An approach to in vitro cloning. Nucleic Acids Res 24 (11), 2194–2195
  62. Siebert PD, Chenchik A, Kellogg DE, Lukyanov KA, Lukyanov SA (1995). An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA. Nucleic Acids Res 23 (6), 1087–1088

Лукьянов Константин Анатольевич

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 34, комн. 522
  • Тел.: +7(495)995-55-57#2518
  • Эл. почта: kluk@ibch.ru

Метод флуоресцентного мечения белков в живых клетках на основе флуорогена и флуороген-связывающего белка (2017-11-28)

Мы разработали новый метод мечения целевых белков в живой клетке, названный Protein-PAINT. Метод основан на обратимом связывании белкового домена с флуорогенным красителем, что приводит к многократному увеличению интенсивности его флуоресценции. На основе результатов компьютерного молекулярного докинга, мы получили три мутантных варианта бактериального липокалина Blc с различным сродством к флуорогену. Было показано, что флуороген быстро проникает в живые клетки и вызывает окрашивание целевых белков, слитых с мутантными Blc. Новый метод обеспечивает на порядок большую фотостабильность сигнала, по сравнению с флуоресцентными белками. Protein-PAINT также позволяет проводить долговременную флуоресцентную микроскопию сверхвысокого разрешения живых клеток как в режиме детекции одиночных молекул, так и в режиме STED.

Глубокий структурно-функциональный анализ влияния аминокислотных замен на фотофизические свойства зеленых флуоресцентных белков (2016-11-24)

На примере зеленого флуоресцентного белка GFP впервые удалось экспериментально определить так называемый “ландшафт приспособленности” целого белка. Уникальный подход, разработанный в ходе работы, позволил соотнести функцию (флуоресценцию) и аминокислотную последовательность для нескольких десятков тысяч случайных мутантных вариантов с выявлением множества эпистатических (влияющих друг на друга) замен. Характеризация ландшафта приспособленности GFP делает возможным компьютерное предсказание свойств новых мутаций во флуоресцентных белках, а также имеет большое значение в различных областях науки, например, молекулярной эволюции и белковой инженерии.

С помощью расчетов возможных путей передачи электрона от возбужденного хромофора GFP к внешним молекулам и последующей экспериментальной проверки этих предположений удалось создать мутантные варианты с нарушением данных путей и, соответственно, повышенной фотостабильностью. Разработанный подход является новым в актуальной проблеме направленного создания фотостабильных вариантов флуоресцентных белков.

 

Рисунок. (А) Схема ландшафта приспособленности GFP по результатам анализа 51000 мутантов. Последовательность GFP представлена как круг, где каждая колонка соответствует одному аминокислотному остатку. Зеленым обозначены флуоресцентные варианты, черным – нефлуоресцентные. Цифры слева обозначают количество внесенных аминокислотных замен. Сайты с позитивным и негативным эпистатическим влиянием показаны зелеными и черными линиями, соответственно. Схема показывает узость пика ландшафта приспособленности GFP: 3/4 одиночных замен приводит к уменьшению яркости флуоресценции, а половина мутантов с 4-мя заменами полностью теряют флуоресценцию. (Б) Перенос электрона в GFP. Вверху - схема расчетного пути переноса электрона от хромофора на молекулу внешнего акцептора через тирозин-145 в качестве промежуточного акцептора. Внизу – кривые фотообесцвечивания EGFP и его вариантов с заменой тирозина-145 на фенилаланин или лейцин в присутствии окислителя в среде, демонстрирующие многократное увеличение фотостабильности мутантных вариантов благодаря блокировке пути переноса электрона. 

Публикации

  1. Acharya A, Bogdanov AM, Grigorenko BL, Bravaya KB, Nemukhin AV, Lukyanov KA, Krylov AI (2017). Photoinduced chemistry in fluorescent proteins: Curse or blessing? Chem Rev 117 (2), 758–795
  2. Sarkisyan KS, Bolotin DA, Meer MV, Usmanova DR, Mishin AS, Sharonov GV, Ivankov DN, Bozhanova NG, Baranov MS, Soylemez O, Bogatyreva NS, Vlasov PK, Egorov ES, Logacheva MD, Kondrashov AS, Chudakov DM, Putintseva EV, Mamedov IZ, Tawfik DS, Lukyanov KA, Kondrashov FA (2016). Local fitness landscape of the green fluorescent protein. Nature 533 (7603), 397–401
  3. Bogdanov AM, Acharya A, Titelmayer AV, Mamontova AV, Bravaya KB, Kolomeisky AB, Lukyanov KA, Krylov AI (2016). Turning on and off Photoinduced Electron Transfer in Fluorescent Proteins by π-Stacking, Halide Binding, and Tyr145 Mutations. J Am Chem Soc 138 (14), 4807–4817

Метод определения активности нонсенс-опосредованной деградации мРНК в единичных живых клетках с помощью флуоресцентных белков (2016-03-17)

Нонсенс-опосредованная деградация мРНК (NMD) является эволюционно консервативным механизмом распознавания и уничтожения транскриптов, несущих преждевременный стоп-кодон. Исследования последних лет показали, что NMD играет важную роль в глобальной регуляции экспрессии генов. Мы разработали новый репортер активности NMD, основанный на флуоресцентных белках. Особенностью данного репортера является возможность количественной оценки активности NMD на уровне единичных живых клеток, что не достигается ни одним из других известных методов. Используя NMD-репортер, мы обнаружили сильные различия активности NMD между линиями клеток млекопитающих. Также, мы впервые обнаружили явление существенной гетерогенности NMD внутри одной линии (например, HEK293, Jurkat, HaCaT), с выявлением субпопуляций клеток с высокой и низкой активностью NMD. Разработанный метод открывает принципиально новые возможности изучения как механизмов регуляции NMD, так и влияния низкой активности NMD на паттерн генной экспрессии и физиологическое состояние клетки.