Применение модифицированных-Т клеток пациента, несущих химерный антигенный рецептор (CAR) получило широкое распространение. Однако данный революционный подход имеет существенные ограничения из-за возможности возникновения цитокинового шторма. Имеется настоятельная потребность обеспечить отмену эффекта CAR -Т в случае нежелательной реакции. Мы показывали, что специфичность и активность Т-клеток, направленных на опухоль, с CAR, состоящим из антитела с остатком лизина, который каталитически образует обратимую ковалентную связь с гаптеном 1,3-дикетона, может регулироваться концентрацией низкомолекулярных адапторов, субстратов каталитического CAR – Т. Этот адаптер избирательно связывается с гаптеном и выбранным опухолевым антигеном через низкомолекулярный связыватель, идентифицированный с помощью библиотеки, кодируемой ДНК. Таким образом, адаптер контролирует образование ковалентной связи между каталитическим антителом и гаптеном, а также привязку CAR Т-клеток к опухолевым клеткам и, следовательно, цитотоксичность и специфичность цитотоксических Т-клеток, как мы показываем in vitro. и у мышей с ксенотрансплантатами рака простаты. Такие низкомолекулярные переключения цитотоксичности и специфичности Т-клеток посредством антиген-независимого «универсального» CAR могут улучшить контроль и профиль безопасности клеточной иммунотерапии на основе CAR.

Полученные данные позволяют предположить, что основный белок миелина (MBP) может рекрутировать и регулировать активность множества белковых факторов, что согласуется как с инклюзивной ролью MBP в целостности миелиновой оболочки, так и с новой ролью ферроптоза в развитии аутоиммунных нейродегенераций, связанных с нарушением миелинизации. Предсказание сродства HLA класса I к пептидам МВР при его разрушении протеасомами с различным каталитическим фенотипом показало, что защитные аллели при рассеянном склерозе (РС) HLA-A*44 и -B*35 являются высокоаффинными , тогда как РС-ассоциированные аллели HLA-A*23, -A*24, -A*26 и -B*51, как правило, обладают умеренным сродством. Продукты защитной аллели HLA-A*44 могут связывать пептид QDENPVVHFF и его дезамидированную форму в нескольких регистрах с беспрецедентно высокой аффинностью, что, возможно, связано с истощением репертуара аутореактивных цитотоксических Т-клеток при негативной селекции в тимусе, а также с индукцией CD8+ регуляторных Т-клеток, специфичных к энцефалитогенному пептиду MBP.

Методом рентгеноструктурного анализа получена пространственная структура бактериальной олигопептидазы В (двухдоменного трипсино-подобного фермента, играющего ключевую роль в резистентности бактерий к антибактериальным пептидам не литического титпа) из Serratia proteamaculans (SpOpB) в комплексе с ковалентным ингибитором. Показано, что в каталитически-активной (закрытой) конформации субстрат связывающий карман и переходное тетраэдрическое состояние SpOpB имеют архитектуру типичную для пролилолигопептидаз (РОР). Однако способ стабилизации собранной каталитической триады, которая необходима для успешного гидролиза и осуществляется при участии аминокислотных остатков регуляторного b-пропеллерного домена, отличается от того, который был ранее описан для ряда РОР и протозойных ОрВ. С помощью биоинформатического анализа было установлено, что стабилизация каталитической триады в закрытой конформации по протозойному или бактериальному (SpOpB-подобному) типу характерна для всех бактериальных ОрВ. Работа опубликована журнале International Journal of Molecular Sciences, при поддержке гранта РНФ 21-74-20154.

Глобальное распространение устойчивости к антибиотикам знаменует конец эры обычных антибиотиков. Человечеству нужны новые молекулярные инструменты для борьбы с патогенными бактериями. Антимикробные пептиды АМП обладают различными механизмами действия на бактериальные клетки. Более того, в доклинических исследованиях сообщалось об эффективности АМП, продемонстрировавшей низкий уровень формирования резистентности. Танатин представляет собой небольшой бета-шпильчатый антимикробный пептид с бактериально-специфичным механизмом действия, что предопределяет его низкую цитотоксичность по отношению к эукариотическим клеткам. Это делает танатин исключительным кандидатом для разработки новых антибиотиков. В данной работе был создан штамм продуцент рекомбинантного танатина (rThan) в дрожжах Pichia Pastoris, что наделяет последние антибактериальными свойствами. Оптимизированные условия экспрессии и очистки обеспечивают высокий уровень продукции (до 20 мг/л) rThan из культуральной среды. rThan проявляет широкий спектр активности в отношении болезнетворных бактерий, как и его химически синтезированный аналог. Разработанный подход открывает новые возможности для разработки AMP и создания живых агентов биоконтроля для борьбы с устойчивостью к антибиотикам.

На рисунке представлены схема получения и анализа антимикробной активности штамма дрожжей, продуцирующих АМП танатин, и профиль активности по отношению к репортерному штамму E.coli ΔTolC.

Подавляющее большинство летальных исходов при колоректальном раке (КРР) обусловлено образованием метастазов в удаленных от первичной опухоли органах. В наших исследованиях была изучена роль изоформ рецептора CD44 в процессе метастазирования КРР. Сначала было показано, что в опухолях пациентов с КРР преимущественно экспрессируются изоформы 3 и 4 CD44. При этом высокая экспрессия изоформы 4 ассоциирована с низкой выживаемостью пациентов, эпителиально-мезенхимальной трансформацией клеток опухоли и снижением окислительного фосфорилирования (OxPhos); тогда как высокая экспрессия изоформы 3 ассоциирована с противоположными событиями. В ксенотрансплантантных опухолях КРР у животных, как и в опухолях пациентов, в основном экспрессировались изоформы 3 и 4 CD44. Обе изоформы преобладали в паранекротических областях опухолей с высоким уровнем гипоксии. Нокдаун CD44 приводил к снижению количества метастазов у животных. В ксенотрансплантированных опухолях с нокдауном CD44 наблюдалось стимулирование ангиогенеза, что сопровождалось снижением экспрессии HIF-1α (основного маркера гипоксии) и CEACAM5, и увеличением экспрессии E-кадгерина. Также наблюдался значительно более высокий уровень экспрессии митохондриальных генов и генов OxPhos. Важно, что гены, экспрессия которых изменялась в результате нокдауна CD44 в ксенотрансплантированных опухолях, значительно и статистически значимо перекрывались с генами, коррелирующими с экспрессией изоформы 4 CD44 (но не изоформы 3) у пациентов, что подтверждает значимость изоформы 4 CD44 в стимулировании метастазирования.

Обнаружено, что у пациентов с COVID-19 с летальным исходом снижена доля NKT-подобных клеток, что свидетельствует о потенциальной роли этой клеточной фракции в патогенезе COVID-19. Тяжелая форма течения COVID-19 сопровождалась снижением процента циркулирующих CD8+ Т-клеток, главным образом за счет гибели CD56— Т-клеток, и перераспределением состава субпопуляций NKT-подобных клеток с преобладанием более дифференцированных цитотоксических CD8+ Т-клеток. Прогрессия COVID-19 характеризовалась снижением процентного содержания Т-клеток, экспрессирующих активирующий рецептор NKG2D+ и ингибирующий рецептор NKG2A+ и повышением уровней экспрессии ингибирующего рецептора PD-1 и молекулы активации HLA-DR. Тяжелая форма COVID-19 была ассоциирована с координированным снижением доли NK-клеток экспрессирующих рецепторы активации NKG2D и CD16 и увеличением PD-1, что свидетельствовует об их истощении.

Эффекты «Спутника V» оценивали путем сравнения образцов мононуклеаров до вакцинации, через три дня и три недели после второй дозы. Такой протокол вакцинации вызывал сокращение фракций стареющих CD57+ Т-клеток и HLA-DR-позитивных Т-клеток. Было зафиксировано временное увеличение активации NK-клеток и NKT-подобных клеток в зависимости от того, болели ли доноры COVID-19 до вакцинации. В NK-клетках наблюдалось кратковременное повышение уровня активирующих рецепторов NKG2D и CD16. В целом, результаты исследования говорят о том, что вакцина «Спутник V» не вызывает резких фенотипических перестроек в Т- и NK-клетках, хотя и вызывает их незначительную временную активацию.

В клиническом исследовании на 11 пациентках с HER2-положительным раком молочной железы проведено прямое сравнение адресных радиофармацевтических препаратов ([^99mTc]Tc-ADAPT6 и [^99mTc]Tc-(HE)3-G3) на основе HER2-специфичных скаффолдных белков (ADAPT6 и G3) и технеция-^99m. Оба препарата продемонстрировали свою эффективность в отношении визуализации первичных HER2-позитивных опухолей молочных желез. При этом аккумуляция [^99mTc]Tc-ADAPT6 имела более высокие показатели накопления для опухолей с разным HER2-статусом. Кроме того, препарат [^99mTc]Tc-ADAPT6 показал значительно более высокое накопление в пораженных мягких тканях, что может являться преимуществом при визуализации небольших метастазов.

В настоящее время все большее внимание привлекает метод фотодинамической терапии (ФДТ) онкологических заболеваний. Однако применение ФДТ осложняется нежелательным воздействием солнечного света на здоровые ткани. Сотрудниками ИБХ РАН была получена гибридная белково-пептидная конструкция для селективного связывания и последующей фотодинамической деструкции раковых клеток. Был использован пептидный фрагмент в качестве модуля нацеливания, который рН-зависимо связывается c раковой клеткой. В качестве фотосенсибилизирующего компонента был использован мутант белка miniSOG, ковалентно связанный с пептидом. Показано, что такая белково-пептидная конструкция избирательно связывается с клетками HeLa при pH ниже 6,8 и уничтожает их при воздействии света. Полученные результаты демонстрируют возможность использования таких комплексов для адресной доставки и последующей высокоточной ФДТ рака.

Толл-подобные рецепторы – ключевые участники врожденного иммунного ответа. Полного понимания механизмов работы TLR до сих пор нет. Это касается и структурной биологии TLR: эти рецепторы получается исследовать лишь в виде отдельных фрагментов, и не для каждой части белка есть необходимая информация, что в конечном счете не позволяет восстановить по кусочкам структуру полноразмерного TLR. Основываясь на данных ЯМР-спектроскопии были получены структуры трансмембранных и примембранных регионов. Оказалось, что примембранные регионы образуют ɑ-спираль, которая глубоко погружена внутрь мембраны, что также подтвердилось при компьютерном моделировании полученных структур. Функциональные исследования на клетках, выполненные коллегами из Китайской академии наук, совместно с данными биоинформатического анализа, позволили установить, что в данных регионах “закодированы” важные взаимодействия, необходимые для работы всего комплекса. Таким образом, примембранные участки являются активными участниками передачи сигнала.

Депрессия - одна из актуальных проблем современности. Все больше исследователей утверждают, что депрессия обусловлена нарушением сигнализации нейротрофина BDNF, а его рецептор TrkB является дополнительной мишенью для целого ряда известных антидепрессантов. В ходе данной работы было установлено, что некоторые психоактивные вещества, которые очень эффективны в качестве антидепрессантов, также взаимодействуют с этим рецептором, причем с гораздо большим сродством. Однако, такие вещества обладают побочными эффектами (галлюцинации, изменение восприятия и др.) за счет связывания с другими нейрональными рецепторами. Таким образом, полученные данные дают основу для создания новых высокоэффективных антидепрессантов на основе описанных веществ, у которых будут исключены нежелательные проявления.

AstaP – группа каротиноид-связывающих белков, обнаруженных в микроводорослях. "Ядро" белка AstaP составляет домен FAS1, широко распространенный в различных организмах, от бактерий до человека. Ранее этот домен был описан только для белков клеточной адгезии. AstaPo1 – первый белок, для которого была обнаружена новая функция, которую может выполнять FAS1 домен: связывание каротиноидов. Совместно с группой "Белок-белковые взаимодействия" ФИЦ Биотехнологии РАН были изучены пространственная структура AstaPo1 и её связь с функцией белка. Оказалось, что AstaPo1 связывает астаксантин в гидрофобном туннеле, при этом длины туннеля не хватает, чтобы поместить туда всю молекулу. В результате, концевые "кольца" астаксантина находятся в водном окружении, а в “пасть” белка попадает только его “жирная” цепочка. Таким образом, взаимодействие между лигандом и AstaPo1 получается неспецифическим. Это объясняет широкий набор каротиноидов, которые связывает AstaPo1. В результате анализа трехмерной структуры и подвижности белка без астаксантина и в комплексе с ним, удалось предложить механизм, по которому AstaPo1 может связывать каротиноиды из мембраны клеток. В процессе предположительно участвует область молекулы, которая была названа "челюстью". Эта "челюсть”, состоящая из двух спиральных участков, может отсоединяться от остальной молекулы белка и, по-видимому, в состоянии погрузиться в мембрану и связать длинную цепочку каротиноида.

Изучение мембранных белков представляет собой одну из актуальных задач современной биологии и медицины. Ключевая проблема при работе с этими объектами - это получение функционально-активного белка в растворимом состоянии. В рамках работы было предложено использовать для этих целей бесклеточный синтез в присутствии мембранного миметика - бицелл на основе новых "сверхмягких" детергентов Facade. Оказалось, что такая среда не оказывает влияния на аппарат транскрипции/трансляции и при этом способна эффективно имитировать мембранное окружение. Уровень экспрессии модельного мембранного белка, родопсина, в такой системе в несколько раз превышал выход белка при использовании классических бицелл на основе более "жестких" детергентов CHAPS или DHPC, и оказался сравним с выходами белка в случае липид-белковых нанодисков.

Отсутствие достоверной детальной информации о конформации белкового комплекса приводит к сложностям и даже невозможности разработки таргетных терапевтических соединений. Для решения задачи нами был разработан метод «конформационного фильтра», комбинирующий релаксационные данные ЯМР о подвижности основной и боковых цепей белков с молекулярной динамикой для идентификации конформационных ансамблей, доминирующих в растворе. Апробация метода была проведена на примере протеазы NS2B/NS3pro вируса Денге, димерный комплекс которой может формировать «открытые» или «закрытые» конформационные наборы. Результаты ЯМР показали превалирование «закрытого» конформационного ансамбля в растворе, в то время как ошибочное использование «открытой» конформации, индуцированной неспецифическими контактами в кристалле, в течении десятилетия служило препятствием для разработки лекарственных средств от лихорадки Денге (в зоне риска заболевания которой, по данным ВОЗ, находится половина населения мира). Таким образом, разработанный подход позволяет однозначно идентифицировать истинные конформационные ансамбли белков, что необходимо для надёжной разработки лекарственных средств.

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса стала одним из основных инструментов в биохимии и медицине. Хотя константы спин-спинового взаимодействия содержат важную структурную информацию, они также могут понижать разрешение в спектрах. Был разработан новый подход, который использует свойство Ханкеля экспоненциального ЯМР-сигнала для достижения широкополосной гомоядерной развязки, который не только эффективно повышает разрешение, но также сохраняет чувствительность и подавляет спектральные артефакты в ЯМР-спектрах. Кроме того, для достижения широкополосной гомоядерной развязки была разработана нейросеть глубокого обучения с архитектурой «WaveNet». Качество реконструкции ЯМР-спектров новыми методами было продемонстрировано на примерах трёх глобулярных белков: Убиквитина (8.6 kDa), Азурина (14 kDa) и Мальта (44 kDa).

Рецепторные тирозинкиназы (RTK) InsR, IGF1R и IRR подсемейства инсулиновых рецепторов играют важную роль в сигнальных путях широкого спектра физиологических процессов в организме человека и напрямую связаны со многими патологиями, включая нейродегенеративные заболевания. Обладая высокой гомологией последовательностей и структур, рецепторы существенно различаются по своей локализацией, экспрессией и функциям. В данной работе с помощью ЯМР-спектроскопии высокого разрешения и компьютерного моделирования, обнаружено, что конформационная изменчивость трансмембранных доменов и их взаимодействие с окружающими липидами существенно различаются между представителями подсемейства. Поэтому мы полагаем, что в наблюдаемом многообразии структурно-динамической организации и механизмов активации рецепторов InsR, IGF1R и IRR следует учитывать гетерогенное и высокодинамичное мембранное окружение. Этот мембранно-опосредованный контроль передачи сигналов рецепторов открывает перспективу для разработки новых таргетных методов лечения заболеваний, связанных с дисфункцией рецепторов подсемейства инсулина.

Кальций-селективный ионный канал TRPV6 является ключевым участником клеточной пролиферации, его избыточная экспрессия наблюдается при самых тяжелых видах рака у человека. Несмотря на свою фармакологическую ценность, блокаторы TRPV6 природного происхождения до сих пор не изучали. В работе выявлены структурные аспекты взаимодействия TRPV6 с природными малыми молекулами-ингибиторами: фитоэстрогеном генистеин (gen) и фитоканнабиноидом тетрагидроканнабиварин (THCV). Путем совместного применения экспериментальных и вычислительных методов показано, что gen, связываясь с TRPV6, работает как поровый блокатор, изменяющий структуру проводящей поры канала. Тогда как THCV не блокирует пору, а действует как аллостерический ингибитор, связываясь с TRPV6 в порталах, соединяющих пору с мембранным окружением. На основании данных молекулярного моделирования предложен наиболее вероятный путь связывания THCV c TRPV6. Описанные молекулярные механизмы открывают новые возможности в разработке противораковых препаратов.

Работа выполнена в сотрудничестве с лаб. А. Соболевского (Колумбийский университет, Нью-Йорк, США)

Методами in silico исследован гипотетический механизм активации рецепторной тирозинкиназы PDGFRA путем олигомеризации, индуцированной ТМ мутацией V536E. Показано, что, в отличие от белка дикого типа, мутантная форма образует стабильный компактный тетрамер с повышенной подвижностью С-концевых областей, способствуя перестройке киназных доменов в асимметричное состояние. Реалистичность предложенных моделей ТМ тетрамеров подтверждена путем реконструкции полноразмерного рецептора в тетрамерной конфигурации. Полученные результаты показывают, что мутация V536E может не только модулировать аллостерическую коммуникацию в рецепторе, но также активировать его в результате индуцированной ТМ агрегации, при которой достигается высокая локальная концентрация киназных доменов и повышается вероятность спонтанной реакции автофосфорилирования.

Впервые продемонстрирована применимость spFRET-микроскопии для анализа структуры нуклеосом и их комплексов с белками в полиакриламидном геле после разделения реакционной смеси методом электрофореза в нативных условиях. Показано, что нативный электрофорез минимально влияет на конформацию нуклеосом и других супрамолекулярных комплексов; полиакриламидный гель не влияет на спектральные характеристики донор-акцепторной пары флуорофоров Су3-Су5. Валидация метода:
- FRET-профили мононуклеосом (а значит и структура нуклеосом) одинаковы в растворе и в геле;
- масштабная реорганизация нуклеосом белковым комплексом FACT сходным образом детектируется при анализе FRET-профилей в растворе и в геле.

Исследование методом spFRET-микроскопии в геле компактных динуклеосом показало, что для динуклеосом характерны не менее двух долгоживущих конформаций, между которыми существует динамическое равновесие. spFRET-микроскопия в геле значительно повышает информативность структурных исследований за счет разделения сложных реакционных смесей в процессе электрофореза и анализа биохимически гомогенных супрамолекулярных комплексов без их выделения из геля.

*spFRET-микроскопия - микроскопия одиночных частиц на основе Фёрстеровского резонансного переноса энергии.

Работа выполнена в сотрудничестве с учеными из Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова и Онкологического центра Фокс Чейз (США).

Целиакия — непереносимость глютена — недуг, которому подвержено около 1% населения, вынужденных соблюдать обременительную диету под угрозой аутоиммунного воспаления, болей в желудке и даже развития рака. Избавлением мог бы стать прием с пищей препарата пептидаз, способных расщеплять в желудке глютеновые PQ-богатые пептиды. Хорошим кандидатом является протеиназа мучного хрущака катепсин L, однако она неустойчива в кислой среде: желудок насекомых отличается от нашего. В этой работе с использованием молекулярной динамики (МД) мы предположили, что одной из причин потери активности катепсином L при pH = 2 может быть дестабилизация конформации активного центра, в частности ключевого остатка His 275. Чтобы скорректировать это, мы спроектировали мутантную форму с заменой V277A, как восстановившую стабильность в расчетах МД, так и приобретшую in vitro стабильность при кислых pH. Мутантная форма катепсина L запатентована и может стать прототипом перорального лекарства от целиакии.

Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы характеризуется неблагоприятным прогнозом и плохо поддается терапии. Моделью развития PDAC может служить ряд клеточных культур, отражающих различные степени дифференцировки и злокачественности (grade) опухоли. В частности, низкозлокачественные клетки характеризуются повышенной экспрессией гена KLF5. Мы исследовали пространственную организацию хроматина регуляторных областей гена KLF5 с использованием высокодифференцированных клеток Capan2 с высоким уровнем экспрессии KLF5 и слабо дифференцированных клеток MIA PaCa2 c низким уровнем экспрессии этого гена методом циркулярной идентификации конформации хромосомы (4C-seq). Показано, что число и распределение контактов регуляторной области KLF5 с другими областями хроматина существенно различаются для этих типов клеток. Найдена корреляция уровня экспрессии генов и числа контактов их последовательности с регуляторной областью KLF5, что указывает на согласованность их экспрессии. Для Capan2 характерно большое число контактов регуляторной области KLF5 с участком генома, содержащим кластер ассоциированных с аденокарциномой сайтов полиморфизма (SNP/indel). При повышении степени злокачественности клеток уменьшается общее число контактов промотора KLF5, понижается степень модификации гистона H3 и уровень экспрессии большинства окружающих KLF5 генов.

Чрезвычайная вариабельность опухолей делает неэффективной молекулярно-таргетную терапию для большого количества пациентов. Мы выделили две надмолекулярные характеристики, общие для всех опухолей: наличие кластеров - молекулярных ансамблей, образующихся в межклеточном пространстве между взаимодействующими раковыми клетками с их микроокружением (синапсами) [1] и образование внутриклеточных безмембранных биомолекулярных конденсатов с характерными для опухолей особенностями. Эти две надмолекулярные структуры, характерные для большинства опухолей представляются наиболее универсальными мишенями для противоопухолевой терапии и могут лечь в основу перспективных стратегий опухолеспецифической терапии, использующей один или ограниченный набор универсальных агентов для лечения широкого спектра опухолей, хотя их разработка, естественно, потребует серьезных дополнительных исследований.

1. Cancers (Basel), 2020, 12(4), 806, doi.org/10.3390/cancers12040806

Впервые подробно проанализированы изменения транскриптома Mycobacterium smegmatis при холодовом стрессе; выявлены группы генов, определяющих успешную адаптацию микобактерий к низким температурам. Существенно расширена существующая аннотация регуляторных РНК M. smegmatis

Накапливается все больше данных, что значительные фенотипические и физиологические преобразования в эволюции организмов могут быть связаны с потерей или возникновением целых генов. Целенаправленная широкоформатная идентификация таких генов оставалась из-за своей сложности до сих пор не решенной задачей. Сотрудники лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН совместно с сотрудниками Института проблем передачи информации им. А.А. Харкевича впервые разработали эффективный метод решения этой задачи. Мы назвали этот метод WINEGRET, потому что, во-первых, созвучие этого названия со словом винегрет подчеркивает тот факт, что наш метод сложен из двух разнородных компонентов, а, во-вторых, слово WINEGRET состоит из первых букв слова в кратком англоязычном описании метода: Wide-scale Identification of Novel or Eliminated Genes Responsible for Evolutionary Transformations. В качестве доказательства принципа мы идентифицировали около 50 генов, участвующие в регенерации конечностей у рыб и амфибий, но отсутствующие у не способных к такой регенерации рептилий, птиц и млекопитающих. Разработанный метод предоставляет широкий диапазон возможностей для изучения взаимосвязи между утратой/появлением фенотипических и физиологических признаков и утратой/появление специфических генов в эволюции.

Сотрудники Группы геномного анализа сигнальных систем клетки приняли лидирующее участие в сравнении скорости структурной и регуляторной эволюции как на уровне единичных генов, так и на уровне внутриклеточных молекулярных путей.

Мутации могут быть синонимичными (не меняющими аминокислотного состава белка) и несинонимичными (приводящими к изменению аминокислотного состава белка). На оценке их соотношения и основан анализ, позволяющий выявлять гены с наиболее быстро или медленно эволюционирующими структурами белка.

Регуляторная эволюция связана с изменениями в регуляторных элементах генов, влияющих на их экспрессию. Даже у родственных видов с очень схожими последовательностями генома могут наблюдаться существенные различия в регуляции экспрессии. Эти особенности оказывают влияние на фенотипические характеристики и играют ключевую роль в процессах адаптации к окружающей среде.

Эволюция белоккодирующих генов имеет как структурные, так и регуляторные компоненты. Первый может быть оценен путем измерения соотношения несинонимичных и синонимичных нуклеотидных замен. Второй компонент может быть измерен как нормализованная доля мобильных генетических элементов, которые используются в качестве геномных регуляторов. Впервые мы параллельно охарактеризовали регуляторные и структурные эволюционные профили для 10 890 человеческих генов и 2972 молекулярных путей. Мы наблюдали ~0,1 корреляцию между структурными и регуляторными метриками на уровне генов, которая оказалась гораздо выше (~0,4) на уровне молекулярных путей. Для всех проанализированных генов и путей, мы разместили полученные данные в открытой базе данных RetroSpect. Мы также проанализировали эволюционную динамику шести основных сигнальных путей онкогенеза, связанных с двумя главными молекулярными осями: Notch/WNT/Hedgehog и AKT/mTOR/EGFR. У пути Hedgehog оба компонента развивались медленнее, тогда как у пути Akt структурная эволюция явно ускорена. В частности, в основных узловых точках пути: генных продуктах Akt и бета-катенина оба эволюционных компонента демонстрируют замедленную динамику, в то время как два основных регулятора Akt - TCL1 и CTMP, имели выдающиеся высокие темпы эволюции. Мы также отметили структурную консервативность серин/треониновых киназ и генов, связанных с метаболизмом гуанозина в раковой сигнализации: GPCRs, G-белков и малых регуляторных ГТФаз (Src, Rac, Ras); однако это было компенсировано ускоренной эволюцией их регуляторов.

Основной набор результатов был получен вместе со студентами и другими молодыми учеными в ходе проведения Сеченовского хакатона по биоинформатике. В исследовании также приняли участие сотрудники МФТИ, Европейской организации по исследованию и лечению рака (EORTC), компаний Oncobox и OmicsWay.

Рисунок 1. Эволюционная диаграмма молекулярного пути Akt человека. Интенсивность синего цвета отражает значение скорости регуляторной эволюции генов, размер узлов пропорционален усредненному показателю структурной эволюции. Узлы, в которых отсутствует информация о dN/dS и структурных показателях эволюции, показаны в виде ромбов. Узлы, в которых отсутствуют значения показателя регуляторной эволюции, показаны желтым.

Успехом завершилась длительная и кропотливая работа Отдела по характеристике нового оригинального агониста α7 никотинового холинорецептора (нАХР) – D-6-бромгипафорина (Hyp) из морских организмов, начатая совместно с ТИБОХ ДВО РАН около десяти лет назад. Морские организмы содержат целые комбинаторные библиотеки низкомолекулярных веществ с уникальной биологической активностью. Однако для получения соединений с улучшенными свойствами в Отделе были проведены работы по конструированию и синтезу аналогов Hyp, приведшие к созданию соединения с высоким сродством к рецептору, составившим 610 нМ, что является хорошим результатом для малой молекулы. В тестах in vivo ряд синтезированных аналогов проявил противоотечную, противовоспалительную и анальгетическую активность, что создает задел для разработки новых противовоспалительных и анальгетических препаратов.

Имеющиеся данные указывают на то, что активация никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР) может уменьшить повреждение сердца в результате ишемии и последующей реперфузии. Ранее этот эффект был показан для агонистов нАХР α7-подтипа. Нами проведено исследование двух новых синтетических D-аналогов 6-бромогипафорина, являющихся избирательными агонистами α7 нХР, на модели ишемии миокарда у крыс. Обнаружено, что введение аналога, содержащего нитро группу, на первой минуте реперфузии приводило к статистически достоверному снижению размера инфаркта. Полученные данные свидетельствуют о перспективности аналогов гипафорина для разработки препаратов, уменьшающих неблагоприятные последствия инфаркта миокарда. Мы также изучили действие агонистов α4β2 нАХР цитизина и варениклина — препаратов, применяемых для лечения никотиновой зависимости, и обнаружили, что они значительно уменьшают реперфузионное повреждение миокарда, причем варениклин обеспечивает большую защиту. Дигидро-β-эритроидин, антагонист α4β2-нАХР, а также метилликаконитин, антагонист α7- и α6β2-содержащих нАХР, предотвращали защитное действие варениклина. Это может свидетельствовать о том, что эффект варениклина опосредуется α4β2, а также рецепторами, содержащими α7 и/или α6β2. Наши результаты указывают на новый путь использования цитизина и варениклина в качестве кардиопротекторов.

Из яда морской анемоны Metridium senile, показавшего анти-холинергическую активность, выделено 4 новых пептида (Ms11a-1/4), имеющих низкую гомологию с известными структурами и взаимодействующих с определенными подтипами никотиновых ацетилхолиновых рецепторов. Наиболее активный из них (Ms11a-3) показал ингибирующее сродство порядка 200 нМ в отношении мышечного подтипа рецептора электрического ската и нейронального α9α10 рецептора крысы в тестах связывания и по анализу функциональной активности. ЯМР анализ Ms11a-2 и Ms11a-3 токсинов установил, что они относятся к новому варианту ингибиторного цистинового узла (ICK) с удлиненной петлей между 5-м и 6-м цистеинами и, таким образом, являются уникальными по структуре блокаторами определенных подтипов никотиновых холинорецепторов.

Неклассический каннабиноидный рецептор GPR55, способный активировать как пролиферацию, так и апоптоз. является многообещающей мишенью для терапевтического вмешательства с целью лечения некоторых типов рака, экспрессирующих этот рецептор. Однако его практическое использование требует четкого понимания механизма функциональной селективности рецепторана уровне клеточной мембраны. Мы впервые обнаружили решающую роль взаимодействия каннабиноидных рецепторов GPR55 и CB2 с образованием гетеродимера для про-пролиферативной активности агонистов GPR55. Это открывает перспективы для разработки новых противораковых препаратов с двойным действием на оба рецептора, но противоположным образом. Установлено, что рецептор GPR18, но не CB1, дополнительно участвует в реализации про-апоптотического эффекта докозагексаеноилдофамина (DHA-DA). Субъединица Ga13 усиливает цитотоксичность, опосредованную GPR55, но мало влияет на стимуляцию пролиферации.

В нашем Отделе ранее было показано, что окта-аргинин (R8) ингибирует α9α10 нАХР и подавляет невропатическую боль. В настоящей работе мы проверили, могут ли быть эффективными ингибиторами α9α10 нАХР другие поликатионные соединения, содержащие амино- и/или гуанидиновые группы, и протестировали активность “цикло” R8, серии биогенных полиаминов (путресцин, спермидин и спермин), С-метилированных аналогов спермина, агматина и его аналогов, а также ацилполиамина аргиотоксина-636 из яда паука. Их ингибирующая активность в отношении нАХР мышечного типа, α7 и α9α10 была определена с помощью радиолигандного анализа, электрофизиологии и кальциевого имиджинга. “Цикло”R8 также эффективно ингибировал α7 и α9α10 нАХР (IC50 = 13 и 62 нМ), как и исходный пептид R8. Биогенные полиамины, а также агматин и его аналоги проявляли низкую активность в отношении нАХР мышечного типа, α7 и α9α10. Активность данных соединений возрастала с увеличением длины цепи. Аргиотоксин-636, который содержит полиаминовую последовательность и концевую гуанидиновую группу, показал высокую активность в отношении α9α10 нАХР (IC50 ≈ 200 нМ). Таким образом, олигоаргинины и аналогичные поликатионные соединения, эффективно ингибирующие α9α10 нАХР, могут служить основой для разработки обезболивающих при невропатической боли.

Микробные родопсины – интегральные мембранные белки, содержащие хромофор ретиналь и осуществляющие светозависимый транспорт ионов через мембрану или другие функции. Интерес к ним объясняется перспективами использования в биомедицинских технологиях с целью светоиндуцируемой регуляции клеточных процессов. Нами сконструированы системы экспрессии рекомбинантных ретинальных белков в клетках бактерий, включая «зеркальный» протеородопсин Sphingomonas paucimobilis, проявляющий активность при низких значениях рН, ксантородопсин Salinibacter ruber, протеородопсин Exiguobacterium sibiricum. Проведены структурно-функциональные исследования, позволяющие уточнить уникальные детали функционирования этих белков в различных условиях (совместно с МГУ, МФТИ).

Для двойного воздействия на злокачественные клетки и сосудистое микроокружение опухоли был разработан мультитаргетный гибридный белок SRH-DR5-B-iRGD, содержащий антиангиогенный VEGFR2-специфичный пептид SRH на N-конце и опухоле-специфичный пептид iRGD на С-конце рекомбинантного рецептор-селективного варианта цитокина TRAIL DR5-B, специфичного к рецептору DR5. Белок SRH-DR5-B-iRGD индуцировал DR5-опосредованную гибель опухолевых клеток, подавлял рост ксенографтов глиобластомы человека в иммунодефицитных мышах более чем на 80%, удвоил продолжительность жизни животных и ингибировал васкуляризацию опухоли. Таким образом, параллельное нацеливание на рецепторный комплекс VEGFR2/NRP-1/интегрин αvβ3 наряду с активацией рецептора DR5 обусловило выраженный двойной противоопухолевый и антиангиогенный эффект. Одновременное воздействие на молекулярные пути цитокина TRAIL и VEGF/VEGFR с помощью мультивалентного гибридного белка SRH-DR5-B-iRGD может послужить основой нового терапевтического подхода для лечения солидных опухолей.

На молекулу SRH-DR5-B-iRGD получен патент РФ №2801367 от 08.08.2023 и подана международная заявка PCT/RU2023/000214.

Потенциал-зависимые калиевые каналы Kv1.1 и Kv1.3 участвуют в патогенезе неврологических, аутоиммунных и онкологических заболеваний и рассматриваются в качестве потенциальных мишеней при их лечении. Методами биоинженерии сконструированы генетически кодируемые флуоресцирующие в красной области каналы mKate2-Kv1.1 и mKate2-Kv1.3. Путем введения мутации S369T в канал Kv1.1 и удаления 52-х N-концевых остатков в канале Kv1.3 обеспечена повышенная экспрессия этих каналов в плазматической мембране клеток млекопитающих. Биоинженерные конструкции сохраняют характерные для природных каналов функциональную активность и способность к высокоаффинному взаимодействию с пептидными блокаторами из ядов скорпионов. Установлено, что хонготоксин 1, меченый флуорофором Atto488 (A-HgTx), блокирует каналы Kv1.1 и Kv1.3, образуя комплексы с константами диссоциации (Kd) 0,7 и 0,48 нМ, соответственно. Показано, что комбинация биоинженерных каналов, экспрессированных в клетках млекопитающих, с лигандом A-HgTx является надежной и удобной альтернативой электрофизиологическим и радиолигандным методам скрининга и оценки аффинности пептидных блокаторов каналов Kv1.1 и Kv1.3. Установлено, что открытие-закрытие каналов не влияет на аффинность взаимодействия с ними пептидных блокаторов.

Болезнь Альцгеймера (БА) — широко распространенное нейродегенеративное заболевание, характеризующееся накоплением олигомерных токсичных форм β-амилоида (Аβ1-42) и дисфункцией холинергической системы в различных отделах головного мозга. Однако точные механизмы патогенеза БА и роль никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (nAChR) в прогрессировании заболевания остаются неясными. Мы выявили снижение экспрессии ряда белков Ly6/uPAR, регулирующих nAChR, в мозжечке мышей 2xTg-AD (модель раннего AD) по сравнению с нетрансгенными мышами как на уровне мРНК, так и на уровне белка. Мы показали, что совместная локализация одного из них, нейромодулятора Lynx1, с α7-nAChR уменьшалась вблизи астроцитов мозжечка мышей 2xTg-AD, тогда как совместная локализация Aβ1-42 с присутствующим этим рецептором увеличивалась. Более того, в мозжечке мышей 2xTg-AD снижалась экспрессия противовоспалительного транскрипционного фактора KLF4, регулирующего транскрипцию генов Ly6/uPAR, тогда как экспрессия воспалительного цитокина TNF-α повышалась. Основываясь на этих данных, а также на наблюдаемой дегенерации астроцитов в мозжечке мышей 2xTg-AD, мы предполагаем механизм, посредством которого экспрессия белков Ly6/uPAR при патологии Aβ приводит к нарушению регуляции холинергической системы и, в частности, функции α7-nAChR в мозжечке. Это приводит к усилению нейровоспаления и дегенерации астроцитов мозжечка.

Никотиновый ацетилхолиновый рецептор α7-типа (α7-nAChR) способствует росту и метастазированию солидных опухолей. Трехпетельный белок SLURP-1 из семейства Ly6/uPAR, является специфическим негативным модулятором α7-nAChR. В настоящей работе мы исследовали механизмы антипролиферативной активности рекомбинантного SLURP-1 в клетках эпидермоидной карциномы А431, а также активность SLURP-1 и синтетического пептида, имитирующий его петлю I (Oncotag) на модели эпидермоидной карциномы на ксенотрансплантате мышей. SLURP-1 ингибировал митогенные пути и факторы транскрипции в клетках А431, а его антипролиферативная активность зависела от α7-nAChR. Внутривенное введение мышам SLURP-1 или Oncotag в течение 10 дней подавляло рост опухоли и метастазирование, а также вызывало устойчивые изменения в экспрессии генов и микроРНК в опухолях. И SLURP-1, и Oncotag не продемонстрировали острой токсичности. Удивительно, но Oncotag приводил к более длительному подавлению проонкогенной передачи сигналов, снижению экспрессии проонкогенной миР-221 и повышению экспрессии белка KLF4, ответственного за контроль дифференцировки клеток. Аффинная очистка выявила взаимодействие SLURP-1 как с α7-nAChR, так и с EGFR, а также селективное взаимодействие Oncotag с α7-nAChR. Таким образом, селективное ингибирование α7-нАХР препаратами на основе Онкотаг может стать перспективной стратегией терапии рака.

α-ENaC/ASIC1a/γ-ENaC каналы специфичны для раковых клеток и рассматриваются в качестве терапевтической мишени для противораковой терапии. Мамбалгин из яда чёрной мамбы ингибирует канал α-ENaC/ASIC1a/γ-ENaC более эффективно, чем (ASIC1a)3. В случае (ASIC1a)3 мамбалгин взаимодействует с интерфейсом ASIC1a(+)/ASIC1a(−), а в случае α-ENaC/ASIC1a/γ-ENaC — с интерфейсом ASIC1a(+)/γ-ENaC(−). С помощью молекулярного моделирования, сайт-направленного мутагенеза и электрофизиологии были выявлены молекулярные основы для более избирательного взаимодействия с интерфейсом ASIC1a(+)/γ-ENaC(−) — было показано, что остатки “головы” мамбалгина взаимодействуют с γ-ENaC(−)-субъединицей более эффективно, чем с ASIC1a(−)-субъединицей.

Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАХР) представляют собой лиганд-зависимые ионные каналы, состоящие из пяти гомологичных субъединиц. Гомопентамерный α7-нАХР, экспрессирующийся в головном мозге, участвует в регуляции нейрональной пластичности и памяти и подвергается фосфорилированию протеинкиназой А (ПКА). Здесь мы извлекли нативный α7-nAChR из мозга мыши, подтвердили его сборку с помощью крио-ЭМ и показали, что фосфорилирование с помощью PKA in vitro обеспечивает его взаимодействие с распространенным белком человеческого мозга 14-3-3ζ. Биоинформатический анализ сузил предполагаемый 14 -3-3-связывающий сайт вплоть до фрагмента внутриклеточной петли, содержащего Ser365 (Q361RRCSLASVEMS372), который, как известно, фосфорилируется in vivo.Мы реконструировали пептидный комплекс 14-3-3ζ/ICL и определили его структуру методом рентгеновской кристаллографии, что подтвердило зависимое от фосфорилирования Ser365 каноническое узнавание ICL с помощью 14-3-3.Предположен общий механизм регуляции nAChR путем фосфорилирования ICL и связывания 14-3-3, который потенциально влияет на активность nAChR, стехиометрию и поверхностную экспрессию.

В лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов усовершенствовали метод получения образцов геномной ДНК из грибов для ПЦР-диагностики. Был проведен поиск специальных хаотропных смесей для получения высокоочищенных клеточных оболочек с ДНК за счет высокотемпературной экстракции РНК, белков и низкомолекулярных компонентов из биомассы дрожжей. Наиболее эффективной оказалась хаотропная смесь на основе 7М мочевины, 1% SDS, 100 мМ аммиака и 25 мМ цитрата натрия. Ее использование обеспечивало практически полное удаление РНК и липидов за 10 минут, и одностадийное получение ДНК-содержащих клеточных чехлов, которые можно сразу добавлять в реакционную смесь для ПЦР без дополнительной пробоподготовки. Разработанный подход перспективен для ПЦР-диагностики и таксономических исследований любых микроорганизмов с прочной клеточной стенкой.

Сотрудники лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН в сотрудничестве с коллегами из ИНЭПХФ им. В.Л. Тальрозе ФИЦ ХФ РАН, используя комбинированный подход транскриптомики и протеомики, провели всесторонний анализ полипептидного состава яда среднеазиатского паука Tibellus oblongus. На основе анализа базы данных EST (Expressed Sequence Tags) была установлена аминокислотная последовательность 345 белков предшественников и 217 зрелых токсинов. Методами bottom-up протеомики в образце яда обнаружено 212 природных токсинов, а также подтверждены посттрансляционные модификации. Одновременное определение первичной структуры для такого количества токсинов из одного вида паука сделано впервые. Анализ первичной структуры показал, что часть молекул имеет характерную для токсинов пауков ICK (inhibitor cystine knot) организацию, однако значительная часть токсинов представляет новые структурные мотивы и не имеет известных гомологов. Все детектированные последовательности токсинов внесены в базу нуклеотидных последовательностей и доступны для поиска через базы данных Uniprot и GenBank.

В условиях низкого содержания кислорода поддержка доставки кислорода в мозг осуществляется за счёт увеличения мозгового кровотока. Однако механизмы, лежащие в основе расширения мозговой сосудистой сети, вызванного гипоксией, до конца не изучены. Было показано, что астроциты накапливают нитрит и, в ответ на гипоксию, вырабатывают оксид азота посредством митохондриального восстановления нитрита молибденсодержащим ферментом сульфитоксидазой. Эти данные свидетельствуют о том, что астроциты могут модулировать мозговой кровоток в соответствии с оксигенацией тканей головного мозга посредством митохондриальной выработки оксида азота.

Настоящая работа выполнена в рамках сотрудничества с британскими учёными.

Локомоция вызывает согласованную работу элементов активной среды мозга (brain active milieu). Ca²⁺ активность (изменение внутриклеточной концентрации ионов Ca²⁺, [Ca²⁺]_i) в нейронах преимущественно возникает за счет входа ионов Ca²⁺ в клетку через потенциал-зависимые Ca²⁺-каналы плазматической мембраны. В астроцитах же Сa²⁺ активность связана, в основном, с мобилизацией внутриклеточных запасов ионов Ca²⁺. Отличающиеся механизмы запуска Ca²⁺ активности в астроцитах и нейронах создают предпосылки для различий Са²⁺ ответов этих клеток на локомоцию. Мы проверили эту гипотезу, проведя визуализацию Ca²⁺ активности в астроцитах и нейронах соматосенсорной коры мышей, передвигающихся по «левитирующей» платформе. Мы обнаружили, что астроцитарная сома работает как интегратор Ca²⁺ активности. Так, при движении мыши Ca²⁺ активность начиналась в дистальных астроцитарных отростках, а затем распространялась к соме, где происходило увеличение Ca²⁺ сигнала и возникновение [Ca²⁺]_i осцилляций. Ca²⁺ ответы астроцитов запаздывали на несколько секунд относительно начала локомоции, тогда как в нейронах [Ca²⁺]_i повышалась практически одновременно с началом движения. Сравнение величин Ca²⁺ ответов на пары последовательных локомоторных эпизодов выявило, что для астроцитов характерна рефрактерность, проявляющаяся в значительном снижении Ca²⁺ ответа на второй эпизод локомоции. Таким образом, Сa²⁺ ответы нейронов и астроцитов соматосенсорной коры на локомоцию принципиально различаются. Функционально Ca²⁺ ответ нейронов отражает обработку сенсорной информации, поступающей в мозг при локомоции. Астроцитарная же Ca²⁺ динамика, по-видимому, обеспечивает метаболическую и гомеостатическую поддержку активной среды мозга.

В данном исследовании были изучены сложные клеточные изменения, происходящие с возрастом в головном мозге человека. Исследование проводилось на ткани коры головного мозга человека в возрасте от 22 до 72 лет, и дало уникальную информацию о влиянии старения на астроциты и нейроны человека.

С возрастом происходит значительное снижение количества восстановленных цитохромов в астроцитах, что говорит об изменениях функций митохондрий. Примечательно, что в нейронах такого явления не наблюдалось, что подчеркивает клеточную специфичность процесса старения. Исследование выявляет изменения в соотношении белков и липидов в астроцитах и нейронах, подчеркивая сложность клеточных изменений, связанных со старением.

С возрастом также происходит атрофия астроцитов уменьшается количество их веточек, снижается объемная доля листочков, сокращается астроцитарный домен. Эти изменения коррелируют с функциональными изменениями, включающими в себя потерю связи между астроцитами через щелевые контакты и повышение входного сопротивления данных клеток.

Морфологические изменения коррелируют с увеличением количества глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), и уменьшением эзрина, белка расположенного в астроцитарных листочках. Удивительно, но эти изменения в астроцитах не сопровождались значительными изменениями возбудимости нейронов или спонтанной тормозной постсинаптической передачи сигналов.

Представленное исследование уникально еще и потому, что результаты получены на клетках мозга человека, а не на животных. Полученные данные открывают путь к более глубокому пониманию процесса старения, учитывая реакции, специфичные для каждого типа клеток в активной среде мозга.

Ранее нами была создана исчерпывающая база данных токсинов скорпионов, действующих на калиевые каналы, получившая название Kalium. Затем она была расширена и включила все известные природные лиганды калиевых каналов пептидной природы. Теперь мы представляем третью версию Kalium 3.0, в которую добавлены искусственные и меченые полипептиды, включая данные о мутагенезе, получении радиоактивных и флуоресцентно-меченых аналогов. Проанализирована информация по более чем 1200 веществам, что в пять раз обогатило содержимое базы данных. Kalium 3.0 доступна по ссылке.

При помощи специально разработанных серебряных плазмонных наноструктур было показано, что плазматическая мембрана эритроцитов демонстрирует признаки окислительного стресса у мышей содержащихся на диете с высоким содержанием жира, по сравнению с контролем. Предложенный метод позволяет оценивать окисление любых биологических мембран в том числе и искусственных биологических мембран и липосом. Это может быть использовано при исследовании различных функциональных и паталогических состояний организма.

С использованием методов биоинформатического анализа и секвенирования был разработан комплекс новых ДНК-маркеров с охарактеризованной последовательностью нуклеотидов (SCAR-маркеры). Эти маркеры были использованы для оценки филогенетического разнообразия токсинообразующих грибов рода Fusarium из различных регионов России, в частности, впервые на территории нашей страны были выявлены грибы видов F. coffeatum и F. commune. С помощью комбинации молекулярно-генетического и ВЭЖХ-анализа была показана высокая заражённость образцов зерна из некоторых регионов грибами F. graminearum, F. culmorum и F. avenaceum, а также микотоксином ДОН.

Рис. 1. Выделен фаг Curtobacterium MarsGL, ставший представителем новой группы умеренных фагов.

Рис. 2. Была впервые определена структура капсульного полисахариды K108 и обнаружен локус, содержащий гены белков биосинтеза этого полисахарида в геноме клинического изолята Klebsiella pneumoniae 1333/P225.

Рис. 3. Охарактеризованы деполимеразы хвостового шипа, кодируемые в геномах шести новых бактериофагов Acinetobacter baumannii. Установлен механизм специфического расщепления соответствующих капсульных полисахаридов.

Рис. 4. Впервые проведено детальное исследование структуры экзополисахаридов Curtobacterium flaccumfaciens.

Применение экзогенной двуцепочечной РНК (дцРНК) представляет собой новый нетрансгенный подход для защиты растений от вредителей и патогенов. Принято считать, что механизм подавления вирусной РНК, опосредованного дцРНК, аналогичен механизму естественной РНК-интерференции (РНКи). Однако прямых доказательств этого нет. Мы представляем данные по анализу глубокого секвенирования (NGS) малых РНК (мРНК) как индикаторов РНКи, индуцированных вирусом картофеля Y (PVY/YВК). B отличие от PVY-индуцированной продукции дискретных видов мРНК длиной 21 и 22 нт, внешнее введение дцРНК PVY приводило к генерации неканонического пула мРНК, которые присутствовали в виде фрагментов длиной ~18-30 нт; что указывает на неизвестный ранее неканонический путь биогенеза мРНК. Эти результаты могут иметь важное значение для дальнейших разработок в области защиты растений, опосредованной дцРНК.

Устойчивость растений, в первую очередь, сельскохозяйственных, к стрессовым факторам различной природы – один из наиболее значимых вопросов в биологии растений. Мы исследовали протеомный ответ при засухе у пшеницы и рапса и выявили изменения представленности белков, связанных с фотосинтезом, трансляцией, первичным метаболизмом и антиоксидантной защитой. Помимо этого, мы провели анализ транскриптомов растений разных таксономических групп в ответ на заражение патогенами с целью обнаружить пептиды, регулирующие иммунный ответ. Таким образом, у мха Physcomitrium patens и сельскохозяйственных растений Zea mays, Brassica napus и Solanum tuberosum мы обнаружили как представителей известных семейств пептидов, так и новые, ранее не аннотираванные пептиды, экспрессия генов которых меняется при заражении. Эти результаты планируется использовать в качестве основы для дальнейших функциональных исследований.

Болезнь Шарка, вызываемая вирусом оспы сливы (PPV), является одним из самых вредоносных, карантинных вирусных заболеваний, поражающих косточковые культуры. Отсутствие естественной резистентности к вирусу у косточковых стало решающим фактором для применения методов генетической трансформации для получения устойчивых форм. Гены eIF(iso)4G и eIF(iso)4E кодируют факторы инициации трансляции, используемые в жизненном цикле PPV. В представленном исследовании изучено влияние сайленсинга этих генов методом РНК-интерференции на устойчивость растений подвоя вишни 146-2 (Prunus pumila L. x Prunus tomentosa Thunb) к болезни шарка. Для генетической трансформации растений созданы два вектора с самокомплементарными последовательностями фрагментов генов eIF(iso)4G и eIF(iso)4E. Экспрессионная кассета содержит сильный промотор гена персиковой рибулозы-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (RuBisCo), а также интрон и терминатор того же гена. Мы использовали вектор pMF1, содержащий рекомбиназу R и ген codA-nptII, что позволяет получать интрагенные растения, не содержащие маркеров. В экспериментах было получено восемь независимых трансгенных линий подвоя 146-2 (шесть линий со шпилькой к гену eIF(iso)4G и две линии со шпилькой к гену eIF(iso)4E). Их статус был подтвержден ПЦР и Саузерн-блоттингом. Сайленсинг генов eIF(iso)4G и eIF(iso)4E у трансгенных растений подтвержден количественной ПЦР. Наличие специфических малых интерферирующих (si) РНК было подтверждено методом Northern blotting. Растения всех трансгенных линий подвоя заражали ППВ методом прививки с зараженными почками. Результаты ИФА показали, что подавление гена eIF(iso)4G не приводило к повышению резистентности, в то время как подавление гена фактора eIF(iso)4E приводило к повышенной резистентности к PPV, и растения одной линии не проявляли признаков инфекции в течение трех лет после заражения. В работе продемонстрирован (перспективный) подход, при котором создание косточковых культур, устойчивых к вирусу оспы сливы, может быть достигнуто за счет подавления генов факторов инициации трансляции в клоновых подвоях

Трансгенные растения березы (Betula pubescens) с геном глутаминсинтетазы сосны GS1 оценивали по уровням гормонов во время укоренения in vitro и распускания почек в условиях открытого грунта. В побегах трансгенных линий содержание индолуксусной кислоты (ИУК) было в 1,5–3 раза выше, чем у дикого типа. В корнях растений березы фосфинотрицин (ФФТ) оказывал противоположный эффект. ФФТ снижал содержание свободных аминокислот в листьях нетрансгенной березы, но повышал их содержание у растений со сверхэкспрессией GS. Трехлетний горшечный эксперимент с разной обеспеченностью N показал, что продуктивность трансгенной линии березы была достоверно выше, чем в контроле в условиях дефицита, но не избытка N. Доступность азота не повлияла на распускание почек весной четвертого года; однако распускание почек у трансгенных растений было задержано по сравнению с контролем. Содержание ИУК и абсцизовой кислоты (АБК) в почках растений березы в период покоя и распускания почек зависело как от доступности, так и от трансгенного статуса. Эти результаты позволяют лучше понять взаимодействие фитогормонов и питательных веществ в древесных растениях.

Ключевая стадия рекрутирования лейкоцитов в ответ на воспаление - прикрепление к эндотелиальным клеткам (ЭК). Галектин-9 клеток иммунной системы опосредует клеточную адгезию посредством связывания N-домена с лактозаминами ЭК. Однако, лактозаминов на ЭК мало, в то время как гликанов группы крови Н больше и они имеют на порядок большее сродство к С-домену галектина-9. Мы исследовали, возникает ли адгезия, опосредованная H-гликаном и галектином-9, между клетками Jurkat (лимфоцитарного происхождения, имеющими gal-9) и клетками EA.hy 926 (эндотелиального происхождения, имеющими гликан группы крови H). Действительно, клетки Jurkat прикреплялись к клеткам EA.hy 926 (в статике и динамике), а дефукозилирование последних отменяло адгезию. Восстановление исходного уровня Н-гликана путем встраивания его липидного конструкта возобновляло адгезию.

Анти-гликановые антитела против т.н. aGal-эпитопа, то есть антигена Gala1-3Galb1-4GlcNAc, являются первой причиной отторжения ксено-органов у человека. Трансгенная свинья, у которой нет этого эпитопа, не решила проблему ксенотрансплантации – по-видимому, существуют другие антитела с аналогичным эффектом. Поэтому, с помощью нашего гликанового эррея мы анализировали углеводный профиль антител у бабуинов до и после пересадки органов от трансгенной свиньи, и обнаружили высокую реактивность к дисахаридному фрагменту гиалуроновой кислоты (НА) – GlcAb1-3GlcNAc (НА2) после трансплантации, и существенно меньшую – по отношению к самой НА. Интересно, что дисахарид НА2 является нормальным метаболитом при распаде НА. Таким образом, ксенотрансплантация вызывает появление антител против НА и ее метаболита, что предполагает развитие метода улучшения результатов ксенотрансплантации путем элиминирования анти-НА2 антител.

Антитело-зависимое усиление (ADE) бактериальных инфекций происходит, когда блокирующие или ингибирующие антитела способствуют инфекции. У людей, ADE-эффект обнаружился для антител, вызывающих отторжение при ксенотрансплантации, то есть антител к Galα1-3Galβ1-4GlcNAc (αGal-эпитопу, см. текст выше). Интракорпоральная блокировка этих антител с помощью гликополимера у мышей увеличивала выживаемость при заражении грам-отрицательными бактериями. Кроме того, блокировка этих антител в сыворотке крови человека in vitro увеличивала ее бактерицидный потенциал по отношению к E. coli O86:B7, Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa.

Эти результаты говорят о возможности предотвращать инфекционные заболевания путем удаления антител против αGal-эпитопа.

Показано, что противоопухолевые липосомы, оснащенные тетрасахаридным лигандом селектинов SiaLe^x, сохраняют способность к нацеливанию на активированные эндотелиоциты человека в динамических условиях микропотока при биомоделировании в микрофлюидном устройстве. Однако в потоке сыворотки крови уровень поглощения липосом клетками понижается. С помощью протеомного анализа и иммуноблоттинга липосом-белковых комплексов установлена корреляция между содержанием SiaLe^x в липосомах и некоторых аполипопротеинов в белковой короне липосом, в том числе апо-СI (одного из самых положительно заряженных белков кровотока) - вероятного неспецифического конкурента селектинов.

Сотрудниками ИБХ РАН совместно с коллегами из Коннектикутскиго Колледжа (CША) было проведено определение структуры оксилюциферина у грибных комаров рода Keroplatus. Была создана методика выделения оксилюциферина, позволившая минимизировать совыделение другого флуоресцентного вещества Keroplatus – рибофлавина. Было показано, что оксилюциферин представляет собой 3-гидроксикинуреновую кислоту. Помимо этого, в данном исследовании впервые были проведены тесты перекрестной реактивности “холодных” (содержащих активную люциферазу и люциферин) и “горячих” (содержащих люциферин, но не активную люциферазу) экстрактов Keroplatus и Orfelia. Результаты исследований указывает на наличие сходства между биолюминесцентными системами у представителей родов Orfelia и Keroplatus, однако механизмы излучения света у изученных представителей грибных комаров не идентичны. Результаты опубликованы в журнале Biochemical and Biophysical Research Communications.

Сотрудниками ИБХ РАН в коллаборации с коллегами из Института Биофизики СО РАН (Красноярск) проведено исследование влияния на биолюминесценцию сибирских дождевых червей Henlea sp. двух низкомолекулярных активаторов – ActH и ActS. Выявлено, что максимум флуоресценции активаторов совпадает со спектром биолюминесценции, достигающим пика при 464 нм. Структуры ActH и ActS были исследованы с использованием масс-спектрометрии высокого разрешения (Orbitrap HRMS) с глубоким фрагментированием и методом ядерного магнитного резонанса 1D/2D с криопробами. Оказалось, что ActH представляет собой аналог рибофлавина, аналогичный кофактору F0 архей – 7,8-дидеметил-8-гидрокси-5-дезарибофлавин. ActS был определен как новое соединение, представляющее собой производное ActH, сульфатированное по гидроксилу 3'-рибитила. Была разработана и реализована новая стратегия синтеза ActH. Синтетический ActH был идентичен естественному и активировал биолюминесценцию Henlea sp. Мы предполагаем, что ActH и новый сульфатированный деазарибофлавин – ActS – либо излучают свет при биолюминесценции Henlea sp., либо принимают донор(ы) гидрида при окислении люциферина.

Впервые нами разработан полный синтез рацемического люциферина Odontosyllis undecimdonta – тиено[3,2‑f]тиохроментрикарбоксилата, содержащего трициклический скелет с тремя атомами серы в разных электронных состояниях. Ключевое превращение основано на тандемной конденсации бифункционального тиолофосфоната, полученного при конденсации диметилацетилен-дикарбоксилата с бензотиофен-6,7-хиноном.

Представленный конвергентный подход позволяет за 11 стадий провести синтез целевого соединения с неописанным ранее конденсированным гетероциклическим ядром. Полученные данные позволили подтвердить химическую структуру люциферина Odontosyllis undecimdonta полученную методом 2D-ЯМР-спектроскопии.

Разработан новый подход к трехмерному ультраструрному анализу распределений магнитных наночастиц (МНЧ) и противоопухолевого препарата доксорубицина в опухолевых тканях, основанный на использовании коррелятивной ОЗНТ. 3-D реконструкция распределений МНЧ и особенностей наноструктуры исследуемых тканей позволила выполнить количественную оценку параметров трехмерных распределений Si-Fe МНЧ введенных внутривенно и интратуморально в образцы опухолевых тканей меланомы мыши B16/F1. Коррелятивный анализ ультраструктуры клеток (3D-АСМ)* и наномасштабного распределения введенного доксорубицина (3D-TERS)** -рамановская спектроскопия с усилением на острие) в исследуемых клетках аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 позволил выявить особенности проникновения и накопления препаратов в клетках. Разработанная технология с использованием принципов сканирующей ОЗНТ применима для исследования особенностей распределений различных флуоресцентных, плазмонных или магнитных нанопрепаратов в клетках и тканях.

Cовместно с Центром Технологий и Микрофабрикаций, ФНКЦ ФХМ им. Ю.М. Лопухина ФМБА России и СБМ Роспотребнадзора разработаны функциональные покрытия для фотонных кристаллов (ФК) - чувствительной поверхности оптических безмаркерных биосенсоров на основе производных декстрана. Осаждение и сорбцию биомолекул, а также факт биомолекулярных взаимодействий выявляют путем анализа изменения параметров распространения оптических мод на чувствительной поверхности биосенсора. Метод позволяет измерять молекулярные и клеточные аффинные взаимодействия в реальном времени путем независимой регистрации значений угла полного внутреннего отражения и угла возбуждения поверхностной волны на поверхности фотонного кристалла. Сорбционная способность разработанных покрытий – трехмерных полимерных матриц - продемонстрированы с использованием бычьего сывороточного альбумина (БСА) в качестве модельного белка, и низкомолекулярных биомолекул, таких как олигонуклеотиды, которая сопоставлена с сорбционной способностью контрольного чипа с планарной поверхностью. Использование разработанных покрытий для модификации чувствительного слоя позволила повысить чувствительность биосенсора, и изучать процесс связывания биомолекул в режиме реального времени.

Cовместно с коллегами из ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН была продемонстрирована эффективная стратегия полимеризации фотоотверждаемых композиций с использованием наноинициатора, активируемого светом из ближнего ИК-диапазона, на основе апконвертирующих наночастиц (UCNP). UCNPs, преобразующие бИК-излучение в УФ- и видимое, использовали для исследования механизма переноса энергии в паре донор-акцептор с коммерчески доступными фотоинициаторами (LAP и Irgacure 369). Было определено влияние механизма передачи энергии на пространственное разрешение получаемых структур, продемонстрировано фотоотверждение как диакрилата полиэтиленгликоля, так и эндогенных биополимеров (желатина и гиалуроновой кислоты).

Совместно с коллегами из ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН и НМИЦ онкологии имени Н.Н. Блохина были разработаны наноконструкции на основе агрегатов полимерных мицелл с апконвертирующими наночастицами (UCNP), наполненные доксорубицином, покрытые термочувствительным полимером (поли-N-винилкапролактамом) и наночастицами серебра. Продемонстрировано контролируемое высвобождение лекарственного препарата в ответ на нагрев, а также 5ти кратная в сравнении с контролем регрессия ксенотрансплантата рака молочной железы человека SK-BR-3 в результате перитуморального введения и последующего однократного воздействия ИК-излучением.

В Лаборатории биомедицинских материалов (рук. Марквичева Е.А.) совместно с коллегами из других институтов была изучена эффективность трансфекции и высвобождения лекарств из катионных липосом и липоплексов в зависимости от типа ПЭГ–производного в 2D и 3D моделях in vitro, а также в модели на мышах in vivo. В наноносители на основе OrnOrnGlu(C16H33)2 липопептидов были загружены ДНК плазмидой (pGL3) или siRNA (50-UTR фрагмент вируса гепатита С), а эффективность трансфекции с использованием таких наносистем была изучена с помощью люцеферазного теста или ПЦР, соответственно. Липоплексы с ДНК плазмидой, содержащие ПЭГ-производное b (6 mol % ПЭГ), были выбраны в качестве оптимальных наноносителей для экспериментов in vivo. Изучение биораспределения показало, что ПЭГ-липоплексы элиминировались из потока крови значительно медленнее, чем немодифицированные наноносители. Таким образом, использование липоплексов с оптимальным ПЭГ-производным b позволило улучшить эффективность трансфекции и обеспечить пролонгированное высвобождение лекарства, а разработанный подход является перспективным для создания новых препаратов на основе siRNA.

Три устойчивых микробных консорциума, каждый состоящий из штаммов B. paranthracis и S. haemolyticus были выделены из молока больных маститом коров в трех географически удаленных регионах России. Состав консорциумов стабильно сохранялся при многократных пересевах на культуральные среды. Технологией мегасеквенирования отобранных образцов с последующим анализом генов способных участвовать в как процессах патогенеза так и в преодолении иммунного ответа макроорганизма показано: Стабильность может обеспечивается структурой биопленки сообщества. Вирулентность консорциума зависит от штаммов B. paranthracis. Выявлен ряд мутаций, не исключено, что мутация в гене cytK у бацилл влияет на способность консорциума вызывать мастит у коров.

Выявление внешних морфологических различий между гуминовыми кислотами (ГК) различного генезиса может стать поворотным моментом в понимании их экологических свойств и структурной организации. В настоящей работе впервые использован инновационный подход, заключающийся в первоначальном разделении препарата почвенной ГК на стабильные электрофоретические фракции, различающиеся по ряду физико-химических параметров и химическому составу, с последующим морфологическим анализом образцов методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) с негативным контрастированием препаратов водным раствором уранилацетата. ПЭМ впервые выявила два типа (пути) формирования наночастиц ГК, основанные на:

I - агрегации базовых блоков - точечных частиц (d 2-3 нм) в мелкие кольцевые частицы (d 4-6 нм), которые в свою очередь являются строительными блоками более крупных морфологических структур (сфероидов, червеобразных частиц, длинных фибрилл и их пучков);

II - ассоциации длинных (С10-С30) амфифильных линейных насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в каплевидные везикулярные образования.

Данное исследование дает представление о структурной организации почвенных наночастиц гуминовых кислот в виде супрамолекулярных (надмолекулярных) ассоциатов низкомолекулярных компонентов.

В предыдущих работах, мы идентифицировали TRBV9-содержащий мотив Т-клеточных рецепторов, ассоциированный с патогенезом анкилозирующего спондилита, псориатического артрита и острого увеита, а также HLA-B*27-презентированные бактериальные и селф-эпитопы. Здесь мы описываем доклинические испытания цитотоксических антител против TRBV9 на моделях приматов. Мы также описываем первую в мире анти-TRBV9 терапию анкилозирующего спондилита (болезни Бехтерева). Пациент достиг ремиссии в течение 3 месяцев и прекратил терапию анти-ФНО после 5 лет непрерывного применения. Полная ремиссия сохраняется в течение 4 лет, при этом ежегодно вводятся три дозы анти-TRBV9. Мы также наблюдаем значительное улучшение показателей индекса подвижности (BASMI). Описанный случай представляет собой первую в истории терапию аутоиммунного заболевания путем избирательной деплеции TRBV-подгруппы Т-лифмоцитов. Терапия анти-TRBV9 потенциально может быть применима при других спондилоартропатиях, ассоциированных HLA-B*27. В целом, такое таргетированное устранение основной причины заболевания без системной иммуносупрессии может представлять собой новое поколение безопасных и эффективных методов лечения аутоиммунных заболеваний.

Открыт новый тип структуры бета цепей Т-клеточных рецепторов (TRB), образуемый при рекомбинации D1-to-D2. Мы обнаружили бимодальное распределение соединений DD в составе зрелых генов TRB, указывающее на наличие двух активных сайтов рекомбинации, использование которых приводит к длинным или коротким перегруппировкам D-D области TRB локуса. Длинные TRB D-D перестройки реализуются в слиянии D1-D2 сегментов, которые войдут в состав зрелого TRB гена. Короткие приводят к элиминации D1-D2 участка из хромосомы. Оба типа D-D перестроек увеличивают комбинаторное разнообразие зрелых TRB генов. За короткими перегруппировками DD может следовать прямая рекомбинация V-to-J2. Длинные реаранжировки D-D могут далее рекомбинировать с генами J2 и V, образуя частичную реаранжировку D1-D2-J2, а затем полную реаранжировку V-D1-D2-J2. Мы показали, что зрелые TRB гены со структурой V-D1-D2-J2 присутствуют и экспрессируются в тысячах клонов Т-клеток памяти человека. Такие клоны обладают антигенной специфичностью и активно участвуют в развитии иммунного ответе.

Амфипатические нуклеозидные и ненуклеозидные производные пентациклического ароматического углеводорода перилена известны как мощные нецитотоксичные противовирусные препараты широкого спектра действия. Были синтезированы и изучены 3-метил-5-(перилен-3-илэтинил)-урацил-1-уксусная кислота и её амиды, периленилэтинилфенолы, была осуществлена модификация липофильной части молекулы путём введения 4-, 8- и 12-углеродных алкилов в положение 9(10) остатка перилена. Соединения демонстрируют выраженную (от наномолярной до микромолярной) активность in vitro против вируса клещевого энцефалита (TBEV), вируса желтой лихорадки (YFV), вируса чикунгунья (CHIKV), коронавируса 2, связанного с тяжёлым острым респираторным синдромом (SARS-CoV-2), вируса гриппа А (IAV), вируса герпеса типа 1 (HSV-1), вируса инфекционного перитонита кошек (FIPV), вируса везикулярного стоматита (VSV). Уникальное сочетание формы, обеспечивающей сродство к липидному бислою, и способности генерировать синглетный кислород делает перилен высокоэффективным скаффолдом против оболочечных вирусов. Противовирусная активность является светозависимой. Кроме того, эти соединения проявляют незначительную цитотоксичность, что подчеркивает их значительный потенциал для дальнейшего изучения точного механизма противовирусного действия, а также более широкие возможности и ограничения данного класса соединений. Результаты, полученные с алкилированными периленами, свидетельствуют о том, что производные с короткой алкильной цепью (бутил) обладают сильной противовирусной активностью, в то время как введение более длинных алкильных заместителей (n = 8 и 12) в периленэтинильный каркас приводит к резкому снижению противовирусной активности. Это явление, вероятно, связано с повышением липофильности соединений и их способностью образовывать нерастворимые агрегаты. Кроме того, молекулярно-динамические исследования показали, что алкилированные производные перилена располагаются преимущественно ближе к середине бислоя по сравнению с неалкилированными производными. Предсказанная вероятность поверхностного расположения коррелирует с противовирусной активностью, что позволяет предположить, что генерация синглетного кислорода происходит в приповерхностном слое мембраны, где периленовая группа более доступна для растворенного кислорода.

Устинов А.В., Коршун В.А., Никитин Т.Д., Красильников М.С., Мариевская К.А., Михновец И.Э., Брылёв В.А., Сапожникова К.А., Житлов М.Ю., Гуляк Е.Л. (Лаборатория молекулярного дизайна и синтеза), Алфёрова В.А. (Лаборатория антибиотикорезистентности), Чистов А.А., Аралов А.В. (Группа молекулярных инструментов для исследования живых систем), Панина И.С. (Группа анализа структуры мембранных белков in silico), Ефремов Р.Г. (Лаборатория моделирования биомолекулярных систем), Чумаков С.П. (Лаборатория молекулярной иммунологии), Кутяков С.В. (Лаборатория молекулярной тераностики), совместно с МГУ (биологический и химический факультеты), Федеральным научным центром исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН (Институт полиомиелита), Научно-исследовательским институтом гриппа им. А.А.Смородинцева (Санкт-Петербург), Ветеринарным исследовательским институтом (Брно, Чехия), Масариковым университетом (Брно, Чехия), Центром биологии Чешской академии наук (Ческе-Будеёвице, Чехия).

Внеклеточные везикулы опухолевого происхождения (EV) вносят активный вклад в метастазирование и иммуносупрессию в микроокружении опухоли. По крайней мере, некоторые из EV несут поверхностные молекулы опухоли, такие как опухолеассоциированные антигены (ТАА) и/или ингибиторы контрольных точек, и потенциально могут взаимодействовать с Т-клетками или CAR-Т-клетками. При контакте с Т-клетками EV могут изменить их фенотип и функции, запуская передачу сигналов через TCR или CAR. Мы предполагаем, что EV, обладающие ТАА на поверхности, вероятно, будут взаимодействовать с Т-клетками CAR, которые могут распознавать и связывать соответствующие ТАА. Это взаимодействие между EV и CAR T-клетками может изменить результат иммунотерапии рака на основе CAR T, поскольку оно должно влиять на CAR T-клетки. Кроме того, EV могут служить адъювантами и антигенными компонентами противоопухолевых вакцин. Были получены EV из линии клеток-предшественников лейкоза В-клеток (pre-B ALL) Nalm-6 и продемонстрировано, что распознавание и связывание CD19+ EV с Т-клетками CD19-CAR сильно зависит от присутствия антигена CD19. CD19+EV индуцируют секрецию провоспалительных цитокинов (IL-2 и IFN-y) и усиливают транскрипцию генов, связанных с активацией (IFNG, IFNGR1, FASLG, IL2) в Т-клетках CD19-CAR. Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухоли (TNFRSF4 и TNFRSF9) и маркеры истощения Т-клеток (CTLA4, LAG3, TIM3 и PDCD1LG2) также активировались в Т-клетках CD19-CAR после инкубации с CD19+EV. Длительное культивирование CD19+ или PD-L1+EV с CD19-CAR Т-клетками приводило к усилению терминальной дифференцировки и функциональному истощению в соответствии с повышенной экспрессией PD-1, TIGIT, CD57. Таким образом, наши результаты показывают, что хроническое воздействие CD19+EV на CD19-CAR Т-клетки опосредует активацию и системное истощение антигенспецифическим образом, и этот негативный эффект сопровождается нарушением цитотоксической активности in vitro.

Амфипатические нуклеозидные и ненуклеозидные производные пентациклического ароматического углеводорода перилена известны как мощные нецитотоксичные противовирусные препараты широкого спектра действия. Были синтезированы и изучены 3-метил-5-(перилен-3-илэтинил)-урацил-1-уксусная кислота и её амиды, периленилэтинилфенолы, была осуществлена модификация липофильной части молекулы путём введения 4-, 8- и 12-углеродных алкилов в положение 9(10) остатка перилена. Соединения демонстрируют выраженную (от наномолярной до микромолярной) активность in vitro против вируса клещевого энцефалита (TBEV), вируса желтой лихорадки (YFV), вируса чикунгунья (CHIKV), коронавируса 2, связанного с тяжёлым острым респираторным синдромом (SARS-CoV-2), вируса гриппа А (IAV), вируса герпеса типа 1 (HSV-1), вируса инфекционного перитонита кошек (FIPV), вируса везикулярного стоматита (VSV). Уникальное сочетание формы, обеспечивающей сродство к липидному бислою, и способности генерировать синглетный кислород делает перилен высокоэффективным скаффолдом против оболочечных вирусов. Противовирусная активность является светозависимой. Кроме того, эти соединения проявляют незначительную цитотоксичность, что подчеркивает их значительный потенциал для дальнейшего изучения точного механизма противовирусного действия, а также более широкие возможности и ограничения данного класса соединений. Результаты, полученные с алкилированными периленами, свидетельствуют о том, что производные с короткой алкильной цепью (бутил) обладают сильной противовирусной активностью, в то время как введение более длинных алкильных заместителей (n = 8 и 12) в периленэтинильный каркас приводит к резкому снижению противовирусной активности. Это явление, вероятно, связано с повышением липофильности соединений и их способностью образовывать нерастворимые агрегаты. Кроме того, молекулярно-динамические исследования показали, что алкилированные производные перилена располагаются преимущественно ближе к середине бислоя по сравнению с неалкилированными производными. Предсказанная вероятность поверхностного расположения коррелирует с противовирусной активностью, что позволяет предположить, что генерация синглетного кислорода происходит в приповерхностном слое мембраны, где периленовая группа более доступна для растворенного кислорода.

Антитела и их производные (scFv, Fabs и др.) представляют собой уникальный класс биомолекул, сочетающих селективность и способность к адресной доставке лекарств. В настоящее время одним из наиболее перспективных направлений в этой области является разработка молекулярных диагностических средств и терапевтических агентов на основе антител, т.е. флуоресцентных конъюгатов и конъюгатов антитело-лекарство (ADC, antibody drug-conjugate). Чтобы решить эту задачу, необходимо совершенствовать методы модификации антител. Одной из перспективных стратегией является введение в антитело карбонильных групп, которые далее модифицируются с помощью биортогональной реакции. Мы провели систематический обзор литературы и обобщили методы получения карбонилсодержащих антител, их особенности, достоинства и недостатки. Также мы обобщили существующие на сегодняшний день способы модификации антител по карбонильным группам и области применения подобных конъюгатов.

Флуоресцентные антитела являются важным инструментом для молекулярной биологии и клинической диагностики. Наиболее распространенный способ их получения – модификация остатков лизина и цистеина. Этот метод приводит к высокой гетерогенности получаемых конъюгатов, а также может приводить к снижению аффинности меченых антител в случае, если модификация затрагивает участок связывания антигена. Вероятность этого возрастает с увеличением степени мечения. В нашей работе мы предложили методику синтеза сайт-специфических конъюгатов антитело-краситель с высокой степенью мечения без потери аффинности. Для осуществления этого были синтезированы два разветвленных триазидных линкера на основе оксиамина, которые затем использовались для оксимного лигирования по карбонилам окисленного периодатом моноклонального антитела к опухолевому антигену PRAME. В качестве контроля использовали два линейных моноазидных линкера на основе оксиамина аналогичной структуры. Далее эти антитела, меченые азидными линкерами, были конъюгированы с флуоресцентными красителями с помощью реакции безмедного клика (SPAAC). По сравнению с аналогами, полученными с использованием линейных линкеров, разветвленные конъюгаты обладали более высокой степенью мечения без потери сродства к антигену. Полезность методики была продемонстрирована на примере обнаружения белка PRAME на поверхности клетки методом проточной цитометрии.

Далее этот подход был применен к созданию терапевтических конъюгатов антитело-лекарство. В результате мы получили универсальный метод получения таких конъюгатов антител, применимый к любому антителу без использования генной инженерии. Также, как и для флуоресцентных антител, подход заключается в использовании периодатного окисления гликанов антитела с последующим мечением оксиаминовым линкером с азидом в качестве биоортогональной функциональной группы и катализируемым медью(I) алкин-азидным циклоприсоединением для конъюгации с цитотоксическим препаратом MMAE (monomethyl auristatin E). Введение в линкер флуоресцентных цианиновых красителей позволило определить соотношение препарата и антитела, т.е. степень мечения конъюгата. Полученный конъюгат продемонстрировал активность против PRAME-экспрессирующей раковой клеточной линии in vitro. Это первый пример конъюгата антитело-лекарство, нацеленного на PRAME.

Распространение антибиотикорезистентных штаммов патогенных микроорганизмов создает острую потребность в новых препаратах, особенно имеющих оригинальный механизм действия. Природные соединения являются перспективным источником таких молекул, однако проблема переоткрытия известных соединений при исследовании вторичных метаболитов микроорганизмов стоит очень остро. Был проведен систематический анализ литературы и обобщены современные подходы к скринингу штаммов-продуцентов, оценены достигнутые с их помощью результаты и выявлены ключевые направления дальнейшего развития области. Следует отметить, что классическая Ваксмановская платформа поиска антибиотиков по-прежнему лежит в основе современных подходов, однако на текущем уровне техники возможно существенное повышение ее производительности и эффективности на всех этапах исследования. Особенное значение как для поиска новых антибиотиков, так и для изучения уже известных антимикробных препаратов имеет детальное понимание их молекулярного механизма действия. С развитием как технической базы, так и методов обработки данных и изображений, многие физико-химические методы стали применятся для различения тонких фенотипических различий бактерий при воздействии антибиотиков, а также в результате развития резистентности к ним. Были обобщены последние достижения в области исследования чувствительности к антибиотикам с помощью различных сенсорных систем. Многие методы, успешно применяемые для исследования механизмов действия антибиотиков, имеют большой потенциал для адаптации к изучению антибиотикорезистентности.

Биогенез рибосом требует строго контролируемой транскрипции и процессинга пре-рРНК, которая включает рибосомальные РНК, образующие ядро ​​больших и малых рибосомальных субъединиц. Ранние этапы процессинга пре-рРНК и сборки рибосомальных субъединиц требуют большого набора белков, которые осуществляют сворачивание и нуклеолитическое расщепление пре-рРНК в ядрышках. Структура и функции белков, участвующих в процессинге пре-рРНК, подробно изучены у почкующихся дрожжей S. cerevisiae. Функциональная характеристика их человеческих гомологов осложняется сложностью рибосом млекопитающих и повышенным количеством белковых факторов, участвующих в биогенезе рибосом. Было показано, что гомологи ядрышкового белка человека SURF6 из дрожжей и мыши, Rrp14 и Surf6, соответственно, участвуют в ранних стадиях процессинга пре-рРНК. Rrp14 работает как шаперон РНК в комплексе с белками Ssf1 и Rrp15. Нокдаун и сверхэкспрессия SURF6 человека были использованы для выяснения роли SURF6 на ранних этапах процессинга пре-рРНК в клеточных линиях человека HeLa и HTC116. Анализируя содержание предшественников рРНК в клетках со сниженным уровнем или сверхэкспрессией SURF6, мы продемонстрировали, что SURF6 человека участвует в созревании рРНК как из малых, так и из больших рибосомальных субъединиц. Изменения уровня SURF6, вызванные нокдауном или сверхэкспрессией белка, не приводят к гибели клеток HeLa в отличие от мышиных эмбриональных фибробластов, но существенно изменяют распределение клеток по фазам клеточного цикла. Нокдаун SURF6 как в раковых клетках человека HCT116 с нормальным уровнем p53, так и с дефицитом p53 приводит к удлинению фазы G0/G1 и укорочению фазы G2/M. Этот удивительный результат предполагает независимость p53 от эффектов SURF6 на клеточный цикл и возможные множественные функции SURF6. Наши данные указывают на переход с пути 1 на путь 2 биогенеза рРНК, вызванный нокдауном SURF6 и его вероятную связь с сигнальными каскадами, индуцируемыми антионкогеном p53.

Моралева А.А., Доброчаева К.Л., Рубцов Ю.П. (Лаборатория молекулярной вирусологии); Дерябин А.С., Рубцова М.П., Донцова О.А. (Лаборатория молекулярной онкологии

Дисфункция опухолевого супрессора PTEN задействована в патогенезе многих онкологических заболеваний. Помимо гена PTEN, человек и некоторые приматы обладают процессированным псевдогеном PTEN (PTENP1), который транскрибируется с образованием длинной некодирующей РНК lncPTENP1-S. Данный транскрипт выполняет онкосупрессорные функции при многих видах рака. Регуляция и функции PTEN и PTENP1 тесно взаимосвязаны, однако точный молекулярный механизм влияния этих двух генов друг на друга остается неясным. Мы обнаружили, что метилирование ДНК увеличивает экспрессию lncPTENP1-S в присутствии белка PTEN дикого типа, но снижает экспрессию lncPTENP1-S, если функциональный белок PTEN отсутствует. Дальнейшие эксперименты показали, что белок PTEN связывается с областью промотора псевдогена PTENP1 и ингибирует экспрессию lncPTENP1-S, если псевдоген не метилирован. Таким образом, был продемонстрирован механизм регуляции транскрипции lncPTENP1-S, основанный на метилировании CpG-островка псевдогена PTENP1 и активности белка PTEN.

Прогресс в исследованиях метаболизма, транспорта и функций РНК во многом зависит от систем молекулярной визуализации, в том числе включающих флуорогенный краситель и активирующую флуоресценцию метку на основе аптамера. Аптамеры семейства Манго, содержащие РНК G-квадруплекс и стабилизированные дуплексным/шпилечным каркасом, активируют флуоресценцию зеленого красителя TO1-биотин и выглядят перспективными для отслеживания внутриклеточных РНК. Мы разработали новую платформу на основе аптамера Манго для визуализации РНК в живых клетках. Ее ключевыми преимуществами являются возможность регулирования флуоресцентных свойств и применимость для визуализации небольших молекул РНК, требующих минимального размера метки. Первое преимущество обусловлено расширенной палитрой флуорогенных красителей, а второе - укороченным дуплексным каркасом. Пригодность разработанной платформы продемонстрирована на примере мечения малой некодирующей РНК Mycobacterium Tuberculosis. Система позволила визуализировать РНК в бактериях и инфицированных бактериями макрофагах.

Открытые рамки считывания upstream ORF являются особенностью эукариотических мРНК. Они регулируют трансляцию ORF различными способами: (1) отфильтровывают сканирующие рибосомы, или (2) позволяют инициировать нижестоящую трансляцию посредством сканирования или повторной инициации.

Установлено, что фактор элонгации eIF4G2участвует в сохранении трансляцию ORF, однако не существует доказательств об участии eIF4G2 в сканировании или повторной инициации трансляции.

Мы исследовали уникальную мРНК человека, которая кодирует два высококонсервативных белка (POLGARF с неизвестной функцией и POLG, каталитическую субъединицу митохондриальной ДНК-полимеразы) в перекрывающихся рамках считывания ниже регуляторной upstream ORF. Мы показываем, что upstream ORF обеспечивает трансляцию мРНК как POLGARF, так и POLG, зависящую от eIF4G2. Механически eIF4G2 усиливает как утечку сканирования, так и повторную инициацию, и, по-видимому, рибосомы могут приобретать eIF4G2 на ранних стадиях повторной инициации. Это подчеркивает роль eIF4G2 как многофункционального защитника сканирования, который заменяет eIF4G1 и облегчает движение рибосом, но не прикрепление рибосом к мРНК.

На рисунке представлена предполагаемая роль eIF4G2 в кэп-зависимой трансляции мРНК с помощью uORF. (А) Начальные этапы инициации трансляции происходят в соответствии с общепринятым механизмом Козака. (B) Роль eIF4G2 в утечке сканирования связана с частичной потерей eIF4G1, вызванной столкновениями сканирующего комплекса и рибосомы 80S внутри uORF. Благодаря взаимодействию с eIF4E eIF4G1 возвращается к m7G-кэпу, и роль геликазы затем берет на себя комплекс eIF4G2-eIF4A, тем самым обеспечивая утечку сканирования. (C) eIF4G2 также может способствовать повторной инициации на той же мРНК. eIF4G2 помогает посттерминирующей 80S рибосоме возобновить сканирование и, таким образом, способствует повторной инициации.

Возрастная деменция и спорадические формы нейродегенеративных заболеваний, связанных со старением, таких, как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, всегда сопровождаются окислительным стрессом нервных клеток. Однако, до сих пор нет ответа на ключевой вопрос – является ли окислительный стресс причиной этих нейропатологий или оказывается лишь явлением, возникшим на фоне заболевания. С помощью хемогенетического инструмента для продукции внутриклеточного пероксида водорода мы на уровне отдельных нейронов показали, что окислительный стресс снижает долговременную потенциацию, являющуюся одной из форм синаптической пластичности. Полученные нами результаты вероятно объяснят механизм возрастной деменции в отсутствие явной нейродегенерации.

Сахарный диабет является одним из значимых факторов риска ишемического инсульта головного мозга. Гипергликемия усугубляет патогенез инсульта, приводя к более обширному поражению нервной ткани. Логично предположить, что более масштабные повреждения ткани при ишемии должны как-то коррелировать со степенью выраженности окислительного стресса. H₂O₂ является важным, но не единственным представителем активных форм кислорода, участвующим в формировании окислительного повреждения. Мы впервые зарегистрировали динамику H₂O₂ в режиме реального времени в тканях головного мозга крыс при развитии ишемического инсульта в условиях гипергликемии. Для этого мы использовали высокочувствительный биосенсор HyPer7 и технологию оптоволоконного интерфейса. Мы показали, что высокий гликемический статус не влияет на генерацию H₂O₂ в ишемическом очаге ткани, однако при этом существенно усугубляет последствия патогенеза. Также впервые с помощью метода Рамановской микроспектроскопии мы показали, как резкое повышение уровня глюкозы в крови увеличивает относительное количество восстановленных цитохромов в митохондриальной электрон-транспортной цепи в нейронах у бодрствующих мышей.

Известный факт, что окислительный стресс играет ключевую роль в патогенезе ишемической болезни сердца. Однако редокс-механизмы, которые лежат в основе этого процесса, до конца не изучены. Мы исследовали редокс-состояние неонатальных и зрелых кардиомиоцитов крыс в условиях гипоксии. С помощью высокочувствительного биосенсора HyPer7 мы обнаружили, что гипоксия вызывает увеличение продукции H₂O₂ в зрелых кардиомиоцитах, тогда как в неонатальных клетках наоборот наблюдается снижение базового уровня H₂O₂ при тех же условиях. Это наблюдение коррелирует с нашими другими данными, полученными с помощью Рамановской спектроскопии, которые демонстрируют выраженную разницу в свойствах митохондриальной электрон-транспортной цепи зрелых и неонатальных клеток. Например, в зрелых кардиомиоцитах при гипоксии значительно увеличивается загрузка дыхательной цепи электронами, тогда как в неонатальных клетках такой эффект не наблюдается. При гипоксии в зрелых кардиомиоцитах значительно повышаются уровни тропонина Т, миоглобина и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, причем в неонатальных клетках уровни этих белков не только не изменяются, но изначально отличаются меньшими значениями. С помощью биосенсора SypHer3s мы также оценили динамику рН. Примечательно, что оба типа клеток в условиях гипоксии демонстрируют выраженное снижение рН. Таким образом, ацидоз является более универсальным клеточным ответом на снижение кислорода.

Фактор роста эндотелия сосудов-А (VEGF-A) является критическим регулятором ангиогенеза в норме и при патологии. Мы изучили гепарин-индуцируемое изменение структурных и физико-химических свойств рекомбинантного человеческого VEGF165 (rhVEGF165). Методами химического сшивания (с использованием глутаральдегида) и динамического светорассеяния исследовано взаимодействие гепарина с rhVEGF165. Показано, что связывание этих молекул друг с другом приводит к увеличению гидрофобной поверхности rhVEGF165 и увеличению его способности к олигомеризации/агрегации. При помощи методов структурной биоинформатики (в т.ч. молекулярного докинга) была смоделирована полная структура димера VEGF165 и предложен молекулярный механизм, лежащий в основе функционирования гепарин-связанного VEGF165. Дальнейшие исследования гепарин-индуцируемых процессов с участием VEGF-A могут иметь практическое применение для производства новых биоматериалов с хорошо изученными и контролируемыми свойствами для их применения в терапии регенерации тканей.

При исследовании спектров ЯМР N6-замещенных 2-хлораденозинов обнаружена вторая структурная форма, составляющая до 30% от основной. Ранее этот факт фиксировали для подобных нуклеозидов, но природа возникновения этой формы не была до конца изучена. Выдвигались предположения об образовании иминоформы или некой затрудненной конформации вращения, но конкретной структуры предложено не было. Наша гипотеза предполагает, что наличие мини-формы обусловлено затрудненным вращением, вызванным образованием ранее не описанной нестандартной внутримолекулярной водородной связи между атомом N7 пурина и протоном N6CH заместителя. Наша концепция подтверждается наличием кросс-пика в спектре ЯМР 1H,15N-HMBC: от донора CH к акцептору N7, представленному в мини-форме, но не в основной форме.

Для подтверждения нашей гипотезы были синтезированы соединения, в которых отсутствует донор (CH) или акцептор (N7) водородной связи N6CH∙∙∙N7. Мини-форма отсутствовала в спектрах ЯМР этих соединений, что подтверждает предсказанную нами локализацию внутримолекулярной водородной связи.

Выделен и охарактеризован бактериофаг Klebsiella K5, активный в отношении клинических изолятов K.pneumoniae с капсульным типом К21. Получена рекомбинантная деполимераза капсульного полисахарида фага К5, и исследована структура расщепления капсульного полисахарида под действием данного фермента. Подготовлен обзор научной литературы, посвященный молекулярным механизмам, вовлеченных в основные этапы регуляция теломеразы, и роли посттранскрипционных и посттрансляционных модификаций в биогенезе и функционировании теломеразы у дрожжей и позвоночных.

С целью поиска новых соединений обладающих антибактериальными свойствами осуществлен дизайн и химический синтез неприродных пептидных конструкций, представляющих собой конъюгаты интернализирующих (Tat, Antp) и амилоидогенных пептидов. Изучена биологическая активность ряда конструкций в отношении различных штаммов патогенных микроогранизмов. Значительная противомикробная активность по отношению к микроорганизмам P. aeruginosa, S. aureus, MRSA и E. coli проявлялась при наличии в структуре катионного пептида Tat. В тоже время, все изученные пептиды были активны по отношению к B. cereus.

Биоинформатический анализ последовательностей ортологичных цинксодержащих пептидаз подсемейства М15_С выявил расположенный вблизи от активного центра строго консервативный остаток триптофана, не вовлеченный в формирование белкового кора. Сайт-направленный мутагенез этого остатка Trp114/109 на примере двух разных представителей семейства, l-аланоил-d-глутаматпептидаз бактериофагов Т5 (активируемый кальцием EndoT5) и RB49 (EndoRB49, лишенный ионной регуляции),а также дальнейший анализ 1H ЯМР спектров мутантов показали, что уменьшение объема остатка W→F→A влечет не только изменения в гидрофобном коре и активном центре, но и падение сродства к регуляторному Ca2+ у мутантов EndoT5. Неактивный мутант T5W114A лишен способности связывать субстрат. В целом, консервативный остаток Trp114/109 ввиду пространственных ограничений своей боковой цепи существенно влияет на формирование каталитически активной формы фермента и критически важен для катализа.

Генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры могут нарушать физиологические процессы в живой клетке из-за своего постоянного присутствия и взаимодействия с соответствующими эндогенными мишенями. В данной работе было предложено новое решение данной проблемы на основе оптогенетической транслокации сенсора из компартмента, где мишень сенсора отсутствует, в целевой компартмент.

Эта стратегия была продемонстрирована на примере флуоресцентного сенсора эпигенетической модификации гистона H3K9me3. Созданные конструкции позволяли удерживать сенсор в цитозоле, избегая его взаимодействие с хроматином (левая панель). После освещения синим светом, сенсор транслоцировался в ядро и связывался с модифицированными гистонами (средняя панель). Светозависимая транслокация была полностью обратима – сенсор возвращался в цитозоль после прекращения облучения синим светом (правая панель).

Установлена кристаллическая пространственная структура (X-ray) яркого зеленого флуоресцентного белка BrUSLEE с временем жизни флуоресценции в экстремально коротком субнаносекундном диапазоне (FL~0.66 ns ). В микроскроскопии FLIM (fluorescence life time image microscopy) биомаркеры с разными FL используются для одновременной визуализации нескольких биообъектов в клетке.

Рис: Хромофор флуоресцентного белка BrUSLEE в ближайшем аминокислотном окружении.

Рентгеноструктурным методом при разрешении 2.6 Å установлена пространственная структура FAB-фрагмента моноклонального антитела LNKB-2 к итерлейкину-2 человека (IL-2) в комплексе с антигенным нонапептидом. Антигенный пептид в спиральной форме располагается в полости, образованной гипервариабельными участками тяжелой и легкой цепей Fab-фрагмента и специфически связывается четырьмя Н-связями, одним солевым мостиком и гидрофобными взаимодействиями.

Рис: Пространственная (X-ray) структура FAB-фрагмента моноклонального антитела LNKB-2 к итерлейкину-2 человека (IL-2) с антигенным нонапептидом.

Методом молекулярной механики установлена пространственная организация DiB3 – флуоресцентного нековалентного комплекса генно-инженерного варианта бактериального белка липокалина Blc с синтетическим GFP-подобным хромофором M739. По сравнению с кристаллической X-Ray структурой родственного комплекса DiB1, в структуре DiB3 установлено наличие альтернативного центра связывания хромофора М739.

Рис: Пространственная структура нековалентного флуоресцентного комплекса бактериального белка липокалина с хромофором (DiB3).

Открыта серия фотохимических превращений простых и доступных органических молекул. Реакции не требуют добавления никаких катализаторов и фотоактиваторов, что выгодно отличает такие реакции от большинства известных фотохимических реакций. Продукты найденных превращений трудно получить другими методами, что делает выявленные реакции перспективными для дальнейшего прикладного использования.

Разработана серия новых флуорогенов пригодных для мечения живых систем. А именно: (1) обнаружена серия веществ селективно окрашивающих эндоплзматический ретикулум живых клеток; (2) предложен ряд флуорогенов для флуоресцентного мечения белка nanoLuc.

Локализован пептид pCav3, который способен подавлять симптомы экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита крыс линии DA - утвержденной модели рассеянного склероза человека. Эффективность pCav3 сопоставима с известным иммуномодулятором иммунокортином. Оба пептида характеризуются значительной гомологией первичных структур. pCav3 и иммунокортин способны ингибировать пролиферацию лимфоцитов крыс DA, иммунизированных миелином хорды c IC50 = 0.42 μM (2.35 mcg/mL), что предопределяет терапевтический эффект. Был сделан вывод, что эффективность пептидов pCav3 и иммунокортина на модели ЭАЭ крыс DA практически идентичны, в то время, на как модель ревматоидного артрита у крыс SD, иммунокортин не оказывал влияния. Авторами сделан вывод, что рекомендации OECD в отношение использования линии крыс DA требуют ревизии, поскольку по нашим данным эффективность пептида в качестве терапевтического средства существенным образом зависит от типа ГКГ животных, используемых для получения модели того или иного аутоиммунного заболевания.