1.Разработана воспроизводимая и прецизионная модель травмы спинного мозга на грызунах комбинированием хирургического доступа и последующей унилатеральной криоаппликации спинного мозга.

2. Выявлены ключевые медиаторы цитокинового шторма в ЦНС при травме спинного мозга человека и грызунов в острый, подострый и хронический период.

3. Показана эффективность сочетанного постадийного применения ингибиторов хемокиновых рецепторов низкомолекулярной и антительной природы (могамулизумаб) на восстановление модельных животных после травмы спинного мозга.

АТР-зависимые Lon-протеазы – это ключевые участники системы контроля качества клеточного протеома. Lon-протеаза из E. coli (EcLon) служит модельным ферментом для всего Lon-семейства. Отличительной особенностью EcLon является высокая подвижность ее N-концевого домена, не обладающего каталитической функцией. Наряду с классическими гексамерами EcLon образует ряд олигомеров более высоких порядков (10-, 11- и 12-меры), сформированных гексамерными и пентамерными кольцами. С целью поиска новых эффекторов для углубленного исследования структуры и регуляции EcLon получены нанотела к полноразмерному ферменту, представляющие две группы (А и В), члены которых различаются размерами CDR3-фрагментов. Показано, что все нанотела связываются с олигомерами ЕсLon путем взаимодействия своих CDR3-фрагментов с NTD^5H-субдоменами фермента, что приводит к стабилизации подвижных N-доменов. При этом нанотела группы А (Е2, Е9 и D2) взаимодействуют исключительно с 10-мером, а нанотела группы В (Е4 и Е12) – с 11- и 12-мерами. Кроме того, нанотела групп А и В оказывают различное влияние на АТР-азную, протеазную и пептидазную активности фермента: члены группы А ингибируют, а группы В – усиливают функциональную активность EcLon. Полученные результаты свидетельствуют о том, что нанотела к EcLon-протеазе могут служить перспективными инструментами для структурно-функционального изучения фермента.

Переход к органическому земледелию – одно из самых желанных достижений современности. Рациональное использование подходов органического земледелия позволяет не только снизить затраты и повысить урожайность, но и ограничить риски, связанные с применением пестицидов и химикатов. Несмотря на широчайшее практическое применение многочисленных средств биологической борьбы на основе штаммов Bacillus, их метаболом, включая основные действующие вещества, зачастую остаётся неизвестным. Для понимания основных принципов функционирования штамма Bacillus velezensis K-3618, широко используемого в органическом земледелии, нами был детально изучен спектр его антимикробных метаболитов. Показано, что основными антимикробными агентами B. velezensis K-3618 являются представители семейства макролактинов. Идентифицированный макролактин А (MLN A) и его ацилированные аналоги 7-O-малонилмакролактин А (mal-MLN A) и 7-O-сукцинилмакролактин А (suc-MLN A) активны в отношении грамположительных бактериальных патогенов, включая штаммы с множественной лекарственной устойчивостью. Среди них suc-MLN A является наиболее мощным антимикробным агентом, высокоактивным (МИК = 0,1 мкг/мл) в отношении распространенного патогена человека – метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA). Было выявлено, что основным механизмом действия макролактинов на основе MLN A является ингибирование трансляции белка. Ацилированные макролактины превосходят MLN A в прокариотической бесклеточной системе, демонстрируя высокую эффективность в микромолярных концентрациях. Было показано, что ацилированные аналоги MLN A подвергаются патоген-опосредованной биотрансформации в аналоги MLN F, при этом их антимикробная активность снижается на два порядка. Таким образом, как ацилирование MLN, так и стабилизация ядра MLN A необходимы для создания новых синтетических MLN с улучшенной антимикробной активностью и стабильностью. В то же время мы предполагаем, что идентифицированные механизмы биодеградации имеют первостепенное значение для экологии бактерий и высоко консервативны у многочисленных видов Bacillus из различных экологических ниш.

Пептаиболы представляют собой линейные пептиды грибного происхождения, обогащённые α,α-диалкилированными аминокислотами и характеризующиеся наличием аминокислотных спиртов на C-конце, однако их биосинтез и структурное разнообразие до сих пор изучены недостаточно. Геномно-ориентированный метаболомный анализ Trichoderma sp. SK1-7, выделенного из разлагающейся древесины, позволил выявить продукцию трихорозина IV  и ранее неописанного пептаибола типа SF4 — трихорозина V. Геном Trichoderma sp. SK1-7 содержит два гибридных кластера PKS-NRPS с 14 и 18 аденилирующими доменами. Анализ модульной архитектуры предполагает, что 14-модульный фермент синтезирует трихорозины посредством механизма пропуска модулей, что согласуется с выявленными изменениями в мотивах конденсационных доменов, характерными для родственных синтаз пептаиболов у других видов Trichoderma. Геномный майнинг также выявил широкое распространение коротких (10–14 доменов) и длинных NRPS-архитектур, связанных с биосинтезом пептаиболов, а также консервативных систем типа TqaLFM, участвующих в формировании Aib и Iva. Эксперименты с добавками показали, что соотношение Iva/Aib влияет на состав и соотношения пептаиболов. Выделеннные пептиды проявили умеренную антибактериальную и цитотоксическую активность, а также синергизм с клиническими антибиотиками. Полученные результаты подтверждают, что Trichoderma является ценным источником структурно разнообразных пептаиболов, и демонстрируют потенциал геномно-ориентированных подходов для изучения биосинтетических механизмов и разработки перспективных адъювантов к антибиотикам.

На основе органоидов колоректального рака, полученных из образцов опухолей пациентов, были выявлены молекулярные биомаркеры для персонализированного предсказания терапевтического ответа и прогноза выживаемости. Использование индивидуальных органоидов, полученных непосредственно от пациентов, позволило провести анализ профилей экспрессии генов, коррелирующих с чувствительностью к основным химиотерапевтическим препаратам (5-фторурацилу, оксалиплатину, SN-38). На этой основе разработаны два 12-генных классификатора для предсказания общей выживаемости при метастатическом раке и безрецидивной выживаемости при ранних стадиях заболевания.

Классификаторы демонстрируют высокую прогностическую силу при валидации на независимых клинических данных, позволяя идентифицировать подгруппы пациентов с благоприятным и неблагоприятным прогнозом. Успешная интеграция индивидуальных органоидных моделей с анализом клинических данных открывает путь к персонализированной медицине в онкологии, обеспечивая более точную стратификацию пациентов и оптимизацию выбора терапевтических стратегий.

Проведена комплексная молекулярная характеризация функций белка CD44, которая выявила его критическую роль в развитии химиорезистентности и метастатической прогрессии при колоректальном раке. Через анализ эффектов подавления CD44 идентифицированы молекулярные механизмы, посредством которых CD44 регулирует экспрессию микроРНК и их генов-мишеней, устанавливая новые связи между экспрессией CD44 и поведением раковых клеток. Дополнительные исследования продемонстрировали, что вариантные экзоны CD44 индуцируют химиорезистентность через модуляцию путей клеточной смерти, раскрывая молекулярные механизмы терапевтической резистентности. Кроме того, роль CD44 в опосредовании межклеточной адгезии и миграции была контекстуализирована в рамках более широких механизмов метастазирования, выявляя взаимодействие интегринов и селектинов в процессе диссеминации опухолей.

Полученные результаты в совокупности устанавливают CD44 как ключевой молекулярный узел, интегрирующий химиорезистентность, выживаемость клеток и метастатические процессы при колоректальном раке, и открывают множественные потенциальные мишени для терапевтического воздействия с целью преодоления лекарственной резистентности и подавления распространения опухоли.

Разработаны и оптимизированы технологические и методологические подходы для комплексного изучения преэклампсии, начиная с совершенствования систем плаценты-на-чипе и заканчивая анализом молекулярных нарушений в отдельных клеточных популяциях. Достигнута возможность стабильного сокультивирования клеток в условиях динамического потока в течение двух недель. Параллельно, на основе молекулярного анализа изолированных классических моноцитов при преэклампсии, впервые описано повышение экспрессии гена-адгезина ADGRE4P и значительное снижение экспрессии гена интерлейкина 8 (CXCL8), критического для ремоделирования спиральных артерий матки. Особое внимание уделено разрушающему действию гипоксии на липидный метаболизм трофобласта. На основе анализа РНК-секвенирования единичных клеток плаценты при преэклампсии и моделирования гипоксии in vitro показано, что синцитиотрофобласт (основной барьер между матерью и плодом) демонстрирует снижение экспрессии генов рецептора LDLR и холестеринового синтеза и одновременное повышение экспрессии генов трансцитоза (SCARB1, CAV1). Модель гипоксии в клетках BeWo b30 выявила критическое пятикратное увеличение экспрессии PCSK9 и 1,5-кратное снижение SNX17 — ключевых регуляторов метаболизма липопротеинов. Эти достижения создают платформу для более глубокого понимания индуцированных гипоксией осложнений беременности, в частности преэклампсии, открывая перспективы для разработки новых диагностических и терапевтических стратегий в репродуктивной медицине.

Споры условно-патогенных грибов Aspergillus fumigatus попадают в респираторный тракт человека воздушным путем. Они оседают на слизистой оболочке бронхов и в альвеолярном пространстве, где различные иммунные клетки взаимодействуют с ними, обеспечивая защиту организма от прорастания гриба. У пациентов с ослабленным иммунитетом отсутствие достаточного провоспалительного иммунного ответа может привести к развитию такого заболевания как инвазивный аспергиллез. Современные методы лечения этого заболевания ограничены недостаточным пониманием механизмов распределения конидий в дыхательных путях. В данном исследовании, используя передовые методы визуализации, включая конфокальную лазерную сканирующую микроскопию, мы провели оценку распределения спор A. fumigatus в дыхательных путях иммунокомпетентных мышей и мышей с индуцированной нейтропенией. С этой целью был предложен новый подход к обработке трехмерных изображений, позволяющий проводить количественный анализ распределения конидий в дыхательных путях мышей. Кроме того, мы проанализировали взаимодействие CD11c-положительных дендритных клеток со спорами гриба в слизистой оболочке дыхательных путей. В результате были выявлены закономерности распределения спор и взаимодействия с ними CD11с-положительных клеток в норме и при патологии, расширяющие существующие представления о пространственных аспектах патогенеза микозов дыхательных путей у пациентов с нейтропенией.

Проанализированы данные HLA-типирования, фенотипического профилирования NK-клеток и серологического тестирования на hCMV- и EBV-специфические IgG, полученные от 85 здоровых доноров.

Определены отличия биомаркеров периферических NK-клеток человека для инфекций цитомегаловируса (hCMV) и вируса Эпштейна-Барр (EBV). У hCMV-серопозитивных доноров наблюдалось значительное увеличение NK-клеток, экспрессирующих активирующий рецептор NKG2C и маркер активации HLA-DR, при этом процентное содержание этих клеток коррелировало с титрами hCMV-IgG. В отличие от этого, инфекция EBV ассоциировалась с увеличением терминально дифференцированных NK-клеток с фенотипом CD56dim NKG2A⁻ CD57⁺ и повышенной экспрессией ингибирующих KIR, но не NKG2C или HLA-DR. Выявлена корреляция титров EBV-специфических IgG с экспрессией активирующего рецептора KIR2DS4. Среди доноров, экспрессирующих KIR2DS4, наличие как минимум одного аллеля HLA-C2 ассоциировалось с более высокими титрами EBV-IgG.

Эти результаты подчеркивают различное влияние hCMV и EBV на NK-клеточный компартмент, демонстрируют значимость индивидуального HLA–KIR-ландшафта в формировании противовирусного иммунитета и предполагают участие KIR2DS4+ NK-клеток в контроле инфекции EBV.

Получены HER2-CAR-экспрессирующие NK-клетки, способные распознавать HER2-положительные мишени и обладающие цитотоксическим и цитокин-продуцирующим потенциалом в присутствии опухолевых клеток. 

Показано, что в присутствии HER2-специфического таргетного модуля (Da-9.29-Bn) клетки BsCAR-NK92 проявляют специфическую цитотоксичность в отношении HER2-положительных опухолевых клеток в 2D и в 3D моделях.

Клетки PSCA-CAR-NK проявляют цитотоксическую активность против опухолевых клеток, экспрессирующих PSCA, и характеризуются специфическим профилем хемокинов.

Установлено, что наличие альбумин-связывающего домена (ABD) в структуре белка не только увеличивает время циркуляции радиофармпрепарата в кровотоке, но и модулирует функциональность. Так, нахождение ABD на N-конце белка пролонгирует циркуляцию в кровотоке и увеличивает накопление в опухоли по сравнению с гибридным белком, содержащим ABD на C-конце.

Оба радиоактивно меченных анти-EGFR белка продемонстрировали специфичное поглощение опухолью. Однако, накопление в органах йодированного варианта, было заметно ниже, чем белка, меченного технецием. Визуализация in vivo подтвердила, что [¹²³I]I-(HE)3-E01-PIB обладает более высокой контрастностью изображения в доклинических моделях, чем [^99mTc]Tc-(HE)3-E01. Таким образом, анти-EGFR DARPin(HE)3-E01, меченый [¹²³I]I-пара-йод бензоатом, является предпочтительным радиофармпрепаратом для визуализации EGFR-положительных опухолей in vivo.

Создана конструкция на основе укороченной L-субъединицы ферритина (FTLsh) с отсутствующими 34 аминокислотными остатками на карбоксильном конце в качестве основы для создания гибридного белка для одновременного воздействия на рецептор эпидермального фактора роста человека (HER2) и молекулу адгезии эпителиальных клеток (EpCAM), оба из которых часто сверхэкспрессируются в эпителиальных карциномах. В качестве связывающихся с этими рецепторами составляющих мы использовали DARPin_9–29 и DARPin-EC1. Связывание и интернализации белка слияния DARP_9-29-FTLsh-EC1 исследовались с помощью цитометрии и конфокальной микроскопии. Исследования in vivo показали, что конструкция DARP_9-29-FTLsh-EC1 конъюгированная с токсином MMAE избирательно накапливается в HER2/EpCAM-положительных опухолях в модели ксенотрансплантата у мышей, вызывая уменьшение опухоли.

Toll-подобные рецепторы (TLR) играют важную роль в системе врождённого иммунитета, помогая организму распознавать патогены и запускать защитные реакции. Однако детали их работы до сих пор изучены не до конца. Ранее нами было показано, что TIR домен рецептора TLR1 способен связывать цинк с наномолярной аффинностью. В рамках нового исследования была изучена способность другого представителя семейства, TLR2, связывать ионы цинка. Оказалось, что это взаимодействие происходит с высокой аффинностью и специфичностью. Удалось определить аминокислоты, участвующие во взаимодействии TLR2 с цинком, а также показать их важность для функционирования рецептора. Полученные данные позволяют предположить, что цинк может участвовать в регуляции активности TLR-рецепторов. Эти результаты дополняют существующие представления о механизмах работы врождённого иммунитета.

Патогенез болезни Альцгеймера коррелирует с содержанием в мембранах различных видов липидов. Пептиды β-амилоида (Aβ), ассоциированные с развитием болезни Альцгеймера, являются продуктами расщепления APP секретазами в мембранах нейронов. Протеолитическая переработка АРР в Аβ контролируется несколькими факторами, включая его субклеточную локализацию и локальный липидный состав мембран, в том числе холестерина. Структурно и функционально напоминая мембранные рецепторы типа I, APP задействован в процессах передачи сигналов клетками, участвуя в воспалительных реакциях и модулировании синаптической пластичности. Мы использовали гетероядерную ЯМР-спектроскопию совместно с молекулярным моделированием для исследования взаимодействий холестерина и его аналогов с мембранными фрагментами APP, предшественниками Aβ, в различных системах, имитирующих липидные мембраны. На основе полученных нами результатов и совокупности литературных данных показано, что взаимодействия холестерина с трансмембранным (TM) доменом APP и примембранными (JM) участками в нескольких идентифицированных сайтах являются динамичными, и на них влияют локальные физико-химические свойства мембраны и присутствие специфических видов липидов, таких как сфингомиелины, ганглиозиды и полиненасыщенные липиды. Данные взаимодействия могут быть существенными как для выбора путей расщепления АРР секретазами, имеющих решающее значение для патогенеза болезни Альцгеймера, так и для многогранной и еще не до конца изученной функции рецептора АРР.

За последнее десятилетие конформационные ансамбли получили все большее признание как наиболее точное представление о естественном состоянии белка, дающее ценную информацию о фундаментальных взаимосвязях между структурой, динамикой и функцией белка. Мы представляем новый подход AlphaFold-MD-ЯМР в структурной биологии ЯМР, позволяющий создавать 4D-экспериментально подтвержденные динамические конформационные ансамбли на основе доступных данных ЯМР-релаксации, не требуя дорогостоящих экспериментальных методов, таких как рентгеновская кристаллография или традиционный ЯМР. Благодаря выбору полученных на основе MD ансамблей, соответствующих релаксационным параметрам основной цепи и боковых групп (R1, NOE, nxy), наш метод связывает динамику белка с высоким разрешением непосредственно с наблюдаемыми данными ЯМР, дополняя модели, основанные на cryo-EM и AlphaFold. Мы применили этот подход к внеклеточной области белка Streptococcus pneumoniae PsrSp, который катализирует прикрепление тейхоевой кислоты и/или других полисахаридов к пептидогликановому слою клеточных стенок грамположительных бактерий, что является критически важным для выживания бактерий. Разработанный подход AlphaFold-MD-ЯМР может быть распространен на внутренне неупорядоченные белки, многодоменные подвижные белки и фермент-субстратные комплексы, как универсальный инструмент для изучения структурно–функциональных взаимосвязей белков и разработки таргетных терапевтических соединений.

Передача сигналов рецептором эпидермального фактора роста человека (EGFR) управляется связыванием лигандов, а также модулируется различными соединениями в плазматической мембране, включая холестерин. В данном исследовании, используя метод ко-иммуно-иммобилизации отдельных молекул, обнаружено, что холестерин из внутреннего слоя плазматической мембраны играет важную роль в лиганд-зависимой активации EGFR. Это было достигнуто путем прямого и количественного изучения взаимодействия между EGFR и холестерином в плазматической мембране живой клетки. Структурный анализ с использованием молекулярного моделирования и гетероядерной ЯМР-спектроскопии показал, что холестерин из цитоплазматической части липидного бислоя мембраны имеет решающее значение для перехода димерного трансмембранного домена (ТМД) рецептора в активную конформацию. С помощью направленного мутагенеза определен специфический паттерн остатков Ile640-Gly641-Leu642 в ТМД EGFR, регулирующих связывание холестерина и активацию EGFR лигандом. Таким образом, наши результаты показывают, что холестерин во внутреннем слое плазматической мембраны является ключевым контрольным элементом активации EGFR, запускаемой EGF.

Кальций-селективный TRPV6 является ключевым регулятором гомеостаза кальция и ассоциирован с возникновением и развитием ряда агрессивных форм рака. Внутриклеточный магний (Mg²⁺) давно известен как важный эндогенный ингибитор TRPV6, однако до недавнего времени молекулярный механизм его действия оставался неясным. С использованием комбинации методов криоэлектронной микроскопии, электрофизиологии, мутагенеза и молекулярного моделирования было показано, что Mg²⁺ связывается в четырех идентичных сайтах с цитоплазматической стороны ионопроводящей поры TRPV6, формируемых остатками D489 и D580. Связывание Mg²⁺ в этих сайтах препятствует переходу порообразующей спирали S6 из α-спиральной конформации в состояние с π-сегментом, фиксируя канал в закрытом, непроводящем состоянии.

Для количественной характеристики свободной энергии связывания катионов в обнаруженном сайте разработан вычислительный подход, сочетающий метод т.н. «хорошо-темперированной метадинамики» и шкалирование зарядов атомов модельной системы. Показано, что сайт D489-D580 обладает выраженной селективностью к Mg²⁺ по сравнению с Ca²⁺. Разработанный протокол может быть применен для исследования ион-белковых взаимодействий в других системах, а полученные результаты открывают новые возможности для рационального дизайна лекарственных препаратов, нацеленных на больбу с TRPV6-ассоциированными заболеваниями.

Работа выполнена в сотрудничестве с лабораторией проф. А. Соболевского (Колумбийский университет, Нью-Йорк, США) и лабораторией проф. В. Чубанова (Университет им. Людвига-Максимилиана, Мюнхен, Германия).

На основании результатов вычислительного анализа структурно-динамической организации и физико-химических свойств домена HR2 показано, что этот богатый гептадными повторами α-спиральный домен имеет ограниченное сродство к интерфейсам вода/мембрана. С помощью созданной авторами оригинальной компьютерной технологии «динамического молекулярного портрета» в центральной части HR2 удалось выявить участок полипептидной цепи с паттерном амфифильности, характерным для пептидов слияния и других классических мембраноактивных пептидов. Результаты расчетов молекулярной динамики сегмента HR2 и его укороченных аналогов в присутствии модельной мембраны показали, что соответствующий центральному участку пептид эффективно встраивается в липидный бислой, в отличие от полноразмерного домена HR2. Это позволило заключить, что фланкирующие гидрофильные участки обнаруженной молекулярной детерминанты слияния, вероятно, временно «маскируют» ее, препятствуя эффективному взаимодействию с мембраной полноразмерного домена HR2 в исходном (до слияния) состоянии спайк-белка вируса. В дальнейшем, в ходе сближения мембран вируса и клетки-хозяина, выявленный центральный фрагмент HR2 способен связываться с вирусной мембраной, ассистируя глобальным структурным изменениям S-белка, наблюдаемым в ходе процесса слияния. Предполагается, что за счет подобного «подключения» мембранной активности HR2 на конкретных этапах слияния мембран достигается тонкая регулировка работы спайк-белка вируса.

Получены рекомбинантные пептидные блокаторы Ce1 и Ce4 из яда скорпиона Centruroides elegans. На основе пептида хонготоксина 1 (HgTx) и зеленого флуоресцентного белка (GFP) сконструирован генетически кодируемый флуоресцентный зонд HgTx-GFP. С использованием аналитических систем, разработанных нами на основе клеток, экспрессирующих в мембране каналы Kv1.1, Kv1.2 и Kv1.3, показано, что Ce1, Ce4 и HgTx-GFP являются высокоаффинными лигандами Kv1.2, c константами диссоциации комплексов (Kd) соответственно 10, 30 и 110 рМ. Установлено, что Ce1 и Ce4 являются селективными блокаторами Kv1.2 канала: их сродство к каналам Kv1.1 и Kv1.3 в ~10000 и ~1000 раз меньше, чем к каналу Kv1.2. Методами компьютерного моделирования и молекулярной динамики построены модели комплексов канала Kv1.2 с пептидами Ce1, Ce4 и HgTx1, определены межмолекулярные взаимодействия, стабилизирующие эти комплексы. 

Потенциал-зависимый калиевый канал Kv1.2 является одним из регуляторов нейрональной активности ЦНС, осуществляет контроль проведения электрических импульсов в аксонах и секреции нейромедиаторов. Разработка новых высокоаффинных блокаторов этого канала, в том числе, флуоресцентно-меченых открывает новые возможности для функциональных исследований и флуоресцентного имиджинга канала Kv1.2.

Работа выполнена в соавторстве с В.Н. Новоселецким (кафедра биоинженерии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова; Биологический факультет университета МГУ-ППИ в Шэньчжэне, Китай) и поддержана грантом РНФ 22-14-00406.

Гетеротетрамеризация α-субъединиц Kv1.1 и Kv1.2 расширяет функциональное разнообразие потенциал-зависимых калиевых каналов Kv1 в центральной нервной системе (ЦНС), что требует изучения свойств этих гетероканалов, включая их взаимодействие с лигандами.

Мы сформировали гетероканалы Kv(1.1-1.2)₂ человека на основе димерных конкатемеров Kv1.1-Kv1.2, слитых с флуоресцентным белком mKate2,  в клетках Neuro2a и изучили их электрофизиологические свойства и взаимодействие с пептидными блокаторами. Установлено, что гетероканалы Kv(1.1-1.2)₂ активируются при низком потенциале мембраны, отличаются высокой скоростью активации и высокой проводимостью, которая остается постоянной в состоянии открытого канала. Эти свойства гетероканала очень похожи на свойства канала Kv1.1 и заметно отличаются от канала Kv1.2. Предположительно, гетероканалы Kv(1.1-1.2)₂ обеспечивают отклик на ранние изменения потенциала покоя мембраны нейронов, функционально заменяя каналы Kv1.1, которые не экспрессируются в мембране нейронов в ЦНС.

Мы продемонстрировали, что хонготоксин 1, слитый с зеленым флуоресцентным белком (HgTx-GFP), связывается с Kv(1.1-1.2)₂ в субнаномолярных концентрациях и позволяет визуализировать распределение этих каналов на мембране клеток. Измерена аффинность нескольких пептидных блокаторов к гетероканалам Kv(1.1-1.2)₂, и установлено, что гетеротетрамеризация α-субъединиц может существенно изменять сродство некоторых блокаторов к гетероканалам по сравнению с их аффинностью к каналам Kv1.1 и Kv1.2. Работа поддержана грантами РНФ 22-14-00406 и 22-14-00406П.

Метициллин-резистентный Staphylococcus aureus (MRSA) представляет глобальную угрозу из-за устойчивости к традиционным антибиотикам. Мы применили нейронные сети для анализа 75 тысяч коротких фрагментов пептидов из яда пауков, отобрав 15 наиболее перспективных кандидатов. Три из них продемонстрировали высокую антибактериальную активность против MRSA при минимальной токсичности для человеческих клеток. Детальное изучение пептида IX выявило селективное взаимодействие с анионными липидами, моделирующими бактериальные мембраны. Ключевую роль играет прочный комплекс между N-концевым гидрофобным трипептидом, включающим ароматические остатки, и молекулой фосфатидилглицерина из мембраны. В то же время отсутствие сильного взаимодействия с незаряженными липидами, характерными для мембран человеческих клеток, объясняет низкую токсичность. Наилучшее соотношение эффективности и безопасности показал пептид XIII с гидрофобным якорем FWF.

G-квадруплексы (G4) модулируют ключевые клеточные процессы, включая регуляцию транскрипции, но молекулярные механизмы их влияния пока не до конца понятны. Мы установили, что G4 солокализуются с фактором транскрипции BRD4 в активных суперэнхансерах. Нам удалось выделить консенсусный ДНК-мотив и при помощи спектроскопии ЯМР показать связывание образуемого им квадруплекса (SE G4) с двумя бромодоменами BRD4. Он дестабилизирует ацетилированные нуклеосомы и способствует разделению фаз в растворах BRD4, причем образующиеся конденсаты разрушаются G4-специфичными лигандами. Добавление PDS или SOP1812 приводит к существенному снижению транскрипционной активности в участках хроматина, обогащенных SE G4. Эти данные свидетельствуют о том, что G4 оказывают влияние на транскрипцию независимо от промоторов генов, поскольку играют роль топологического переключателя, что проливает свет на устройство медиаторного комплекса.

Строение и принцип селективного проведения ионов для калиевых каналов изучены одними из первых — в конце 1990-х на примере бактериального KcsA. Однако в геноме человека почти 80 генов разных калиевых каналов, а потому мы задались вопросами: «А во всех ли калиевых каналах механизм селективности тот же?» и «Уникален ли селективный фильтр для K⁺-каналов, или же его можно найти и в других белках?» Проведя структурный анализ всех доступных структур K⁺-каналов (около 350 шт) и всех прочих мембранных (и частично немембранных) белков, мы установили несколько важных принципов: 1) Во всех калиевых каналах селективный фильтр (СФ) представляет собой четыре выстроенные в цепочку квадратные антипризмы из атомов кислорода главной цепи белка, десольватирующие ион K⁺ без энергетического штрафа; 2) В инактивированных структурах C-типа эта геометрия нарушается, предотвращая проведение K⁺; 3) Разработанный нами алгоритм отличает проводящие и инактивированные СФ; 4) Схожие по строению K⁺-транспортирующие белки (каналы NaK, CNG и HCN) имеют СФ схожего устройства, однако он «недосчитывается» 1–2 K⁺-связывающих сайтов, что снижает селективность этих каналов.

Натриевые каналы играют важную роль в природе, например обусловливают возбудимость нервной системы и мышц. Их селективная проводимость интенсивно изучается многие десятилетия, однако ее физико-химические основы до сих пор не ясны. Мы предложили механизм «вторичного хелатирования», ключевую роль в котором играет пространственная организация молекул воды в гидратной оболочке иона. Моделирование молекулярной динамики показало, что селективный фильтр (СФ) бактериального натриевого канала NavMs (в отличие от K⁺-каналов) организован так, чтобы оптимально взаимодействовать с гидратной оболочкой Na⁺ в энергетически выгодной октаэдрической стереометрии: так СФ позволяет беспрепятственно проходить ионам Na⁺ через канал. Гидратная оболочка второго наиболее распространенного катиона K⁺ имеет форму квадратной антипризмы, и вынуждена в СФ «сжиматься». Это приводит к возникновению энергетического барьера на пути прохождения иона K⁺ через канал, что и является причиной селективности.

Фактор транскрипции SOX9 является ключевым регулятором транскрипции в программах развития и дифференцировки тканей и органов, в частности, поджелудочной железы. Повышенная экспрессия SOX9 найдена во многих опухолях, включая рак поджелудочной железы (РПЖ), и часто обсуждается как прогностический маркер. Для более глубокого изучения функций SOX9 мы исследовали изменение полных транскриптомов клеток рака поджелудочной железы линий COLO357 и PANC-1 при подавлении экспрессии SOX9 методами РНК-интерференции и секвенирования РНК. Были проанализированы аннотации генов, молекулярные пути, а также генные экспрессионные сигнатуры, влияющие на выживаемость пациентов и лекарственную устойчивость опухолей при раке поджелудочной железы. Нокдаун SOX9 оказал амбивалентное действие на экспрессию факторов транскрипции, генов с дифференциальной экспрессией при РПЖ, онкогенов и генов-супрессоров опухолей, генов эпителиально-мезенхимального перехода и устойчивости опухолей к лекарственным препаратам, а также генов, включённых в прогностические экспрессионные сигнатуры рака поджелудочной железы.

Среди наиболее заметных различий между транскриптомами клеток с подавленным SOX9 и контрольных клеток найдены активация генов, ответственных за  транспорт анионов, метилирование ДНК, транскрипцию и метаболизм РНК одновременно с подавлением экспрессии генов, участвующих в дифференцировке, различных стадиях клеточного цикла, репликации ДНК и апоптоза.

Проведенное исследование демонстрирует, что транскрипционный фактор SOX9 выполняет в клетках рака поджелудочной железы роль центрального координатора, оказывая широкое влияние на ключевые онкогенные процессы. Амбивалентный эффект подавления SOX9 на экспрессию различных групп онкогенов, супрессоров опухолей и генов лекарственной устойчивости указывает на сложную и зависимую от контекста роль этого фактора в прогрессии опухолей.

Mycobacterium abscessus — быстрорастущая нетуберкулезная микобактерия, вызывающая тяжелые хронические легочные инфекции, трудно поддающиеся лечению. Как и Mycobacterium tuberculosis, она может выживать в организме хозяина в течение длительного времени. Исследование стратегий M. abscessus для уклонения от иммунного ответа макроорганизма находится на начальном этапе.

Впервые проведено комплексное транскриптомно-протеомное исследование адаптации Mycobacterium abscessus к двум клинически значимым стрессам — дормантности и голоданию.

Электронная микроскопия с энергодисперсионным анализом показала катионно-гетерогенные субпопуляции и способность части клеток компенсировать дефицит K⁺ захватом альтернативных катионов.

Дормантные клетки демонстрировали более чем 20-кратное снижение транскрипционной активности и переход более 98% популяции в транзиторную некультивируемость при сохранении жизнеспособности.

Для обоих состояний установлена универсальная стратегия выживания — глобальное подавление ростовых и биосинтетических процессов, а также некоторых факторов вирулентности при активации β-окисления жирных кислот, глиоксилатного шунта и «гипоксиеподобного» ответа, что указывает на снижение вирулентного потенциала при сохранении способности к долговременному выживанию

Сотрудники лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза ГНЦ ИБХ РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, в рамках работы по исследованию генетических основ появления парных конечностей у позвоночных животных, установили, что гены chordin-like1 и shox2 впервые в эволюции появились у челюстноротых. Именно у этой группы позвоночных также впервые в эволюции появились парные конечности в виде парных плавников, которые впоследствии дали начало конечностям всех наземных животных и, в том числе человека. Авторы показали, что оба гена экспрессируются в парных плавниках эмбрионов наиболее древних представителей челюстноротых - кошачьей акулы и стерляди, плавники которых считаются базовой моделью конечностей позвоночных. Полученные результаты указывают на возможное участие chordin-like1 и shox2 в эволюции парных конечностей, и в первую очередь в развитии метаптеригиального базального элемента и его производных, ставших структурной основой наземных конечностей.

Расчетным методом молекулярной динамики (МД) изучена пространственная организация флуоресцентного белка DiB3-F53L – оранжево-красного флуоресцентного нековалентного комплекса генно-инженерного варианта бактериального белка липокалина Blc в комплексе с синтетическим GFP-подобным хромофором M739. Показано, что хромофор сильнее взаимодействует с мутированным белком DiB3-F53L по сравнению с нативным белком DiB3. Расчеты позволили установить аминокислотные остатки из окружения хромофора в сайте связывания, вносящие наибольший вклад в энергию взаимодействия хромофор–белок. Комплекс белка DiB3-F53L с хромофором М739 обладает повышенной яркостью флуоресценции по отношению к известному родительскому биомаркеру DiB3, что выдвигает его в число перспективных маркеров для мечения биологических объектов в клеточной биологии, а также в качестве стартового объекта для последующего дизайна новых более ярких биологических маркеров.

Показано, что в клетках пациентов с этим вариантом самопроизвольно происходит восстановление рамки считывания и синтез укороченного, но частично функционального белка. Описан новый патологический вариант последовательности СOL7A1 у двух неродственных пациентов врожденного заболевания с рецессивной формой дистрофического буллезного эпидермолиза. Показано что вариант вызывает альтернативный сплайсинг за счет активации криптического сайта сплайсинга и  cинтез укороченного, но функционального белка COLVII.

Два неродственных пациента (PrI и PrII) с клинически сходным, но относительно лёгким фенотипом заболевания (Рис. 4 слева верхний ряд). Оба были компаунд-гетерозиготами: у каждого была общая делеция c.2588-3_2588delCAGC в сочетании с другой патогенной мутацией (c.520G>A или c.682+1G>A), вызывающей нонсенс-опосредованный распад (NMD) мРНК. Делеция c.2588-3_2588delCAGC затрагивает акцепторный сайт сплайсинга интрона 19. Это приводит к активации криптического донорного сайта в экзоне 19, что вызывает частичный пропуск 81 нуклеотидов в мРНК.  

Сдвига рамки считывания не происходит, но возникает замена аминокислот на стыке экзонов (p.Gly837_Pro863delinsAla) в фибронектин-III подобном домене. Несмотря на укорачивание белка, в клетках пациентов обнаружены остаточные количества коллагена VII (с; 2) (уровень ниже нормы, 1, но выше, чем у пациента с нулевой мутацией, 3). Это объясняет смягчённый фенотип — болезнь проявляется в промежуточной форме (RDEB-intermediate), а не в тяжёлой. Данный вариант в компаунд-гетерозиготном состоянии с нуль-аллелями приводит к продукции частично функционального укороченного коллагена VII и, как следствие, к более лёгкой форме заболевания. Данное исследование расширяет спектр известных мутаций и демонстрирует, что механизм альтернативного сплайсинга с частичным пропуском экзона в фибронектин-III-подобном домене может быть причиной промежуточного, менее тяжёлого фенотипа болезни.

Были разработаны генетически кодируемые сенсоры на основе флуоресцентных или флуороген-активирующих белков для визуализации различных процессов в живых клетках. В частности, созданы сенсоры для детекции эпигенетических модификаций гистона H3, таких как H3K9me3 (триметилирование лизина 9) и H3K9ac (ацетилирование лизина 9). Один из эпигенетических сенсоров, MPP8-Green, был использован для мониторинга изменений маркера гетерохроматина H3K9me3 в ходе спонтанной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека при формировании эмбриоидных телец. Визуализация паттернов экспрессии сенсора позволила выделить в эмбриональных тельцах как минимум 2 популяции клеток, отличающихся по паттерну метилирования K3 гистона H3 (Рисунок 1). Показано, что сенсор не мешает спонтанной дифференцировке ИПСК, на рисунке видны резултаты иммуноцитохимического окрашивания на маркеры трех зародышевых слоев и видна флуоресценция сенсора (Рисунок 2). С помощью нового сенсора  splitFAST  и применения алгоритма LIVE MIELE показана возможность визуализации зоны, обогащенной одновременно модификациями активного (H3K9ac) и неактивного хроматина (H3K9me3).(Рисунок 3). Это первый генетически кодируемый сенсор с такой специфичностью, так как части сенсора испускают флуоресценцию только при пространственном сближении и взаимодействии в присутствии флуорогена.

• Проведено исследование транскриптомов живых EPCAM+ раковых и опухоль-инфильтрирующих CD45+ иммунных популяций клеток из биоптатов первичных опухолей в когортах пациентов с люминальным В и тройным-негативным подтипами рака молочной железы (РМЖ)
• Выявлен новый “агрессивный” субподтип люминального В РМЖ (люминальный С), характеризующийся специфическим профилем экспрессии генов, высокой активностью ассоциированных с неблагоприятным прогнозом генов и специфическим иммунным микроокружением
• Путем сравнения транскриптомов раковых EPCAM+ популяций клеток нового люминального С и собственно люминального В РМЖ определены кандидатные биомаркеры
• С использованием транскриптомных и клинических данных для каждого исследуемого подтипа РМЖ с помощью машинного обучения определены генные сигнатуры, ассоциированные с прогнозом заболевания
• С использованием вычислительного разложения (деконволюции) транскриптомов опухоль-инфильтрирующих CD45+ иммунных популяций клеток выявлены три типа иммунного микроокружения с разной представленностью в исследуемых подтипах РМЖ
• На основе анализа экспрессии генов лигандов и их рецепторов в раковых и иммунных популяциях клеток опухолей определены потенциальные межклеточные взаимодействия с терапевтическим потенциалом, общие и специфичные для исследуемых подтипов РМЖ

Работа выполнена совместно с МКНЦ им. А.С. Логинова (чл.-корр. РАН Жукова Л.Г.)

Из яда полосатого крайта были выделены 6 новых изоформ β-бунгаротоксина (β-BuTx) – BM1, BM2A, BM2B, BM3, BM4A, BM4B, которые были структурно охарактеризованы различными масс-спектрометрическими методами. Все они обладали фосфолипазной активностью в диапазоне 57-146 мкмоль/мин мг. В конкуренции с флуоресцентным производным известного блокатора калиевых каналов агитоксина 2, а также ряде электрофизиологических тестов была продемонстрирована способность β-BuTx взаимодействовать с Kv1.1, Kv1.3 и Kv1.6 каналами с различающимся сродством. Наибольшая аффинность в отношении этих каналов проявили изоформы BM4a и BM4B с константами 0.18-0.3 мкМ, а наиболее чувствительным ко всем изоформам оказался Kv1.3 канал.

Трехпетельные токсины (ТПТ) змей, включающие нейротоксины и цитотоксины, взаимодействуют с различными биологическими мишенями. Однако данные о взаимодействии ТПТ с нуклеиновыми кислотами отсутствуют. Для обнаружения этого взаимодействия использована спектрофотометрия, ион-парная ВЭЖХ и анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA). Так, при инкубации раствора ТПТ с РНК увеличивается его оптическая плотность, что указывает на взаимодействие токсина с РНК. Уменьшение общего отрицательного заряда молекулы РНК при взаимодействии с ТПТ выявлено с помощью ион-парной ВЭЖХ. EMSA показал снижение электрофоретической подвижности как РНК, так и ДНК при добавлении различных ТПТ. Взаимодействие с РНК/ДНК может быть общим свойством ТПТ, и некоторые биологические эффекты ТПТ могут быть опосредованы таким взаимодействием.

Нетрадиционные токсины змеиного яда, такие как WTX из кобры Naja kaouthia, представляют собой трехпетельные белки, ингибирующие никотиновые холинорецепторы (нХР) α7 и мышечного типа. Синтезировано несколько фрагментов центральной петли II WTX с остатками цистеина, замкнутыми в S-S мостик, на N- и C-концах. Синтетические фрагменты ингибировали α7 и нХР мышечного типа сильнее, чем WTX. Впервые показано, что WTX и его фрагменты ингибируют α9α10, α3β2 и α4β2 нХР, причем синтетические фрагменты снова оказались более активными, чем WTX. Фрагменты петли II снижали артериальное давление у крыс сильнее, чем WTX. Таким образом, как в ингибировании подтипов нХР, так и в снижении артериального давления фрагменты петли II более активны, чем WTX.

С помощью рамановской спектроскопии (РС) проведен сравнительный анализ ядов различных животных и ряда контрольных веществ («не-яды»). На основе РС можно реализовать быструю и простую методику идентификации сухих ядов животных не только для применения в токсинологии, но и в криминалистике, судебно-медицинской и таможенной сферах. Мы показали, что РС в сочетании с методом главных компонент может обеспечить кластеризацию образцов ядов различных животных на основе сходства их составов. Использование алгоритмов машинного обучения, включающее тренировку на части образцов, позволило также автоматически разделить исследуемые вещества на яды и не-яды. Предложенный метод выглядит перспективным с точки зрения идентификации ядов на месте, например, на пограничном контроле.

2-Арахидоноилглицерин (2-AG) – одна из наиболее распространенных эндоканнабиноидных молекул с антипролиферативным, цитотоксическим и про-пролиферативным действием на различные типы опухолей. Мы оценили механизм антипролиферативного действия 2-AG и влияние лизофаофосфатидилинозита (LPI) на него в шести линиях клеток рака молочной железы человека с различной степенью злокачественности (MCF-10A, MCF-7, BT-474, BT-20, SK-BR-3 и MDA-MB-231) с помощью резазуринового теста, ингибиторного анализа, блокаторов и антиоксидантов, а также интерференции siRNA. Чтобы избежать миграции ацильной группы в 2-AG, мы заменили его на синтезированный нами аналог 2-арахидоноил-1,3-дифторпропанол (2-ADFP). Используя метод молекулярного докинга, мы показали, что на CB2 рецепторе 2-ADFP и 2-АГ расположены очень близко друг к другу. 2-ADFP оказывал антипролиферативное действие во всех исследованных клеточных линиях. Токсичность 2-ADFP усиливалась под действием LPI. Активность 2-ADFP снижалась или предотвращалась блокаторами CB2 и ваниллоидного рецептора 1 (TRPV1), рецептором инозиттрифосфата, CREB и ингибитором циклооксигеназы 2 (COX-2), а также добавлением антиоксидантов. В совокупности с литературными данными эти результаты указывают на зависимую от CB2 и TRPV1 индукцию COX-2 с сопутствующей индукцией клеточной смерти метаболитами окисленной молекулы. Предложен двухэтапный механизм индукции клеточной гибели раковых клеток под действием 2-AG.

Трехпетельные токсины образуют одно из наиболее обширных семейств токсинов змеиных ядов. Они характерны для большинства ядов аспид, но практически не встречаются в ядах гадюк. С использованием ядовитых желез гадюк Vipera nikolskii и V. berus был получен 21 клон кДНК, кодирующий эту группу токсинов. Из полученных последовательностей кДНК были выведены аминокислотные последовательности 9 нетрадиционных токсинов, один из которых был получен гетерологической экспрессией в клетках E. coli в виде гибридного белка с растительным белком-партнером SUMO с последующим отщеплением специфичной растительной протеазой BdSENP1 и хроматографической очисткой. Анализ его биологической активности показал, что этот токсин – слабый антагонист никотиновых холинорецепторов нейронного α7 и α3β2 подтипов.

Разработан новый подход к изучению окислительно-восстановительной реакции между гемсодержащими белками. С помощью разработанной методологии исследованы конформационные изменения гема цитохрома c в ходе реакции электронного переноса с нейроглобином и изучено влияние микроокружения гемов белков на окислительно-восстановительную реакцию между ними. На основе полученных данных предложен гипотетический механизм редокс взаимодействия между нейроглобином и цитохромом с: I. формирование реакционного комплекса за счет электростатических взаимодействий; II. конформационная подстройка гемов; III. перенос электрона; IV. диссоциация комплекса. Понимание механизмов взаимодействия между нейроглобином и цитохромом с позволит перейти к рациональному дизайну средств для терапии нейродегенеративных заболеваний и состояний, связанных с гибелью нейронов.

Частицы на основе амфифильного поли(N-винилпирролидона) (Amph-PVP) являются универсальной системой доставки терапевтических агентов. В данной работе наночастицы Amph-PVP были загружены протеасомным ингибитором бортезомибом (BTZ) и модифицированы рецептор-селективным вариантом цитокина TRAIL DR5-B. Полученные комбинированные частицы PVP-BTZ-DR5-B более эффективно интернализовались и накапливались в клетках и обладали повышенной цитотоксичностью по сравнению со свободным DR5-B или частицами PVP-BTZ на клеточных линиях глиобластомы и рака поджелудочной железы человека. Показано усиленное противоопухолевое действие in vivo на модели ксенотрансплантата глиобластомы U87MG в эмбрионах Danio rerio. Таким образом, совместная загрузка бортезомиба и DR5-селективного цитокина TRAIL в частицы Amph-PVP является перспективным подходом для повышения противоопухолевой эффективности свободных препаратов.

С помощью комплексного подхода исследован вклад антиангиогенных пептидов SRH и iRGD в составе гибридного белка SRH-DR5-B-iRGD на основе цитокина TRAIL в общий противоопухолевый эффект. Снижение васкуляризации опухолей, показанное методами иммуногистохимии, оптоакустической и оптокогерентной микроангиографии, сопровождалось повышением противоопухолевой активности SRH-DR5-B-iRGD in vitro и in vivo на моделях ксенотрансплантатов глиобластомы и рака поджелудочной железы человека. Молекулярное моделирование показало, что эффекторные пептиды SRH и iRGD не только позволяют гибридному белку взаимодействовать с дополнительными опухолевыми мишенями VEGFR2 и интегрином αvβ3/NRP-1, но и стабилизируют его взаимодействие с рецептором DR5. Таким образом, придание антиангиогенных свойств мультивалентному гибридному белку SRH-DR5-B-iRGD привело к значительному усилению как антиангиогенного, так и противоопухолевого эффектов, что свидетельствует о клиническом потенциале для лечения васкуляризированных солидных опухолей.

Сенесцентность, индуцированная терапией, играет важную роль в лечении рака, обусловливая резистентность злокачественных клеток. В работе выявлен сенолитический потенциал агониста рецептора DR5 в сенесцентных клетках глиобластомы, индуцированных темозоломидом. Признаки сенесцентности были наиболее выражены в клетках U87MG с высоким содержанием p53 и дефицитом MGMT, и в ряде первичных образцов глиобластом, полученных от пациентов. Это сопровождалось метаболическим сдвигом в сторону гликолиза, измеренным с помощью флуоресцентной визуализации продолжительности жизни (FLIM) кофактора НАДН, и повышением экспрессии DR5, DcR1, DcR2 и cFLIP. В результате наблюдалась сенсибилизация сенесцентных клеток к DR5-опосредованному апоптозу. Ключевым открытием работы является то, что сенесцентность, индуцированная темозоломидом, повышает чувствительность  клеток глиобластомы к агонистам рецептора DR5. Однако при разработке стратегий сенолитической терапии пациентов с глиобластомой после лечения темозоломидом следует учитывать гетерогенный ответ опухолевых клеток на индукцию сенесцентности.

Мутация T226R α-субъединицы потенциал-зависимого калиевого канала Kv1.1 вызывает атаксию 1-го типа, миокимию и эпилепсию. Изучены свойства гетероканала Kv(1.1(T226R)-1.2)2, формирующегося в мембране нейронов ЦНС. Сконструированы плазмиды, кодирующие субъединицы Kv1.1(T226R) и Kv1.2, слитые соответственно с флуоресцентными белками CFP и mKate2 (FRET-пара), а также плазмида, кодирующая конкатемер Kv1.1(T226R)-Kv1.2, слитый с mKate2, и обеспечивающая формирование гетероканалов в клетках млекопитающих. Установлено, что мутация T226R не препятствует образованию комплексов между α-субъединицами Kv1.1(T226R) и Kv1.2, но замедляет встраивание гетероканалов в мембрану клеток. Обнаружено, что мутантные гетероканалы имеют более низкую скорость активации и деактивации, а их порог активации сдвинут в область больших значений потенциала. Нарушение свойств гетероканала, вызванное мутацией T226R, может снижать чувствительность клеток к деполяризации мембраны и повышать возбудимость нейронов.

Недавно мы обнаружили, что трехпетельный белок Lystar5 из целомических клеток морской звезды A. rubens взаимодействует с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами (нАХР) и белком, подобным интегрину α8. Мы предположили, что Lystar5 может способствовать ранозаживлению, в основе которого лежит миграция кератиноцитов, регулируемая нАХР и интегринами. В согласии с гипотезой, мы выявили, что:

• Lystar5 стимулирует миграцию кератиноцитов HaCaT кожи и моноцитов периферической крови человека.
• Функциональный эпитоп Lystar5 образован петлями I и II.
• Про-миграционное действие Lystar5 и пептидов, имитирующих его активный сайт, обусловлено их взаимодействием с нАХР, содержащими α3, α4 и β2 субъединицы, а также с интегринами, содержащими α5, αV и β1 субъединицы.
• Вышеуказанные интегрины и нАХР образуют молекулярные комплексы в кератиноцитах.
• Описан молекулярный механизм действия Lystar5 и его миметиков.

Таким образом, Lystar5 и его миметики можно рассматривать как перспективные средства для заживления ран, способствующие как миграции кератиноцитов кожи на ранней стадии заживления ран, так и инфильтрации иммунных клеток в рану во время реэпителизации.

PSCA (антиген стволовых клеток простаты) – трехпетельный белок, гиперэкспрессируемый при болезни Альцгеймера и раке. В настоящей работе мы показали, что:

• Экспрессия PSCA значительно меняется в мозге при рассеянном склерозе, болезни Хантингтона, синдроме Дауна, биполярном расстройстве и ВИЧ-ассоциированной деменции.
• Изучена структура и фармакология рекомбинантного аналога PSCA.
• Показано избирательное взаимодействие PSCA с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами, содержащими субъединицу β2.
• PSCA регулирует секрецию воспалительных факторов и молекул адгезии и индуцирует провоспалительные реакции в первичных нейронах гиппокампа и астроцитах.

Наши результаты дают новое структурное и функциональное представление о взаимодействии PSCA с его молекулярными мишенями и дает ключи к пониманию его роли в функционировании мозга и развитии психо-неврологических расстройств.

Курение считается одним из факторов риска развития плоскоклеточной карциномы кожи (SCC). Недавно мы продемонстрировали высокую эффективность рекомбинантного ингибитора никотинового рецептора ацетилхолина альфа 7 типа SLURP-1 для контроля терапии SCC in vivo. Нами было изучено использование повышенной дозы SLURP-1 и комбинации SLURP-1 с низкой дозой цитостатика доксорубицина для лечения SCC in vivo.

• Увеличение терапевтической дозы SLURP-1 не приводит к усилению его противоопухолевого эффекта.
• Комбинация SLURP-1 с доксорубицином в пониженной дозе усиливала противоопухолевую активность SLURP-1 и значительно подавляла метастазирование опухолей in vivo. Токсичность комбинированной терапии не выявлена.
• Эффект от комбинированной терапии сопровождался снижением экспрессии EGFR в опухолях.
• SLURP-1 ингибирует EGFR.

Полученные нами данные свидетельствуют о перспективности применения SLURP-1 в комбинации с химиотерапией в низких дозах при SCC и требуют дальнейшего изучения.

Чувствительные к кислоте ионные каналы (ASIC) - это управляемые протонами катионные каналы, которые относятся к семейству дегенерин/эпителиальных натриевых каналов (DEG/ENaC). ASIC каналы образуют гомо- и гетеротримерные комплексы с различной чувствительностью к протонам, кинетикой и реакцией на различные модуляторы. Среди них ASIC1a и ASIC3 особенно важны из-за их высокой чувствительности к изменению рН. Гомомерные каналы ASIC3 человека находятся постоянно в десенситизированном состоянии при физиологических условиях (рН 7,3-7,4). Однако в виде гетеромеров функциональность канала должна радикально меняться. Мы изучили стехиометрию гетеротримерных каналов, образованных путем совместной экспрессии ASIC1a и ASIC3 в различных соотношениях и введением субъединиц в конкатемерные конструкции. Гетеромерный канал 1а:3 (1:5) и конкатемер 1а–3–3 были одинаково функциональны при физиологических условиях, что позволило предположить, преобладание субъединицы 3 в природных гетеромерных каналах нервной системы человека. Это исследование углубляет понимание структуры и фармакологии ASIC–каналов, а разработанная система экспрессии конкатемера 1a–3-3 служит подходящей моделью для разработки лекарств, нацеленных на патологии, связанные с ASIC3.

В эктодермальном секрете морской анемоны Metridium senile был обнаружен пептид, названный Ms13-1. Он усиливал ионные токи канала ASIC1a до 50% в ответ на кислотные стимулы в диапазоне рН от 6,9 до 5,5 (EC50 = 68 нМ при pH 5,5), и при этом не активировал ASIC1a напрямую. Поскольку пептиды гомологичные Ms13-1 ранее не были найдены, его структура в растворе была определена с помощью спектроскопии ЯМР. Ms13-1 обладает уникальной трехмерной структурой в виде антипараллельного β-листа из трех тяжей и протяженной С-концевой части пептида, которая «пришита» к β-листу тремя дисульфидными связями. Дополнительная четвертая дисульфидная связь стабилизирует два первых β-тяжа. Этот тип укладки пептидов морских анемон был обнаружен впервые и получил название «цистиновая лестница» («Cys-ladder») по визуальной аналогии. В экспериментах на мышах введение Ms13-1 в заднюю лапу вызывало ярко выраженную продолжительную болевую реакцию. Этот эффект значительно подавлялся при совместном введении Ms13-1 и селективного блокатора ASIC1 мамбалгина-2, что указывает на непосредственное действие Ms13-1 на каналы ASIC1a in vivo. Результаты опубликованы в FEBS Journal и отмечены как выбор редакции майского выпуска журнала.

Удивительно, но некоторые пауки содержат в своем яде селективные и высокоаффинные ингибиторы болевых рецепторов человека. Мы обнаружили целое семейство пуротоксинов — ингибиторов рецепторов внеклеточного АТФ (P2X3). Эти рецепторы служат мишенью во многих болевых синдромах и хроническом кашле.

Мы воспользовались важным свойством природных ядов: токсины в их составе формируют своеобразные комбинаторные библиотеки. Это позволило выбрать «оптимизированный» пуротоксин минимального размера. Им оказался пуротоксин-6 (PT6) из яда паука-бокохода Thomisus onustus. В сотрудничестве со многими исследовательскими центрами России мы провели детальное исследование структуры, механизма действия и биологической активности PT6. Пептид ингибирует P2X3 с наномолярным сродством, а специфичность его действия была показана, в том числе, с использованием нокаутных мышей с утратой гена рецептора. PT6 эффективен в низких дозах (0,01–0,1 мг/кг) в моделях остеоартрита и невралгии тройничного нерва и при этом не влияет на вкусовые ощущения, в отличие от низкомолекулярных лигандов P2X3.

Подробнее в пресс-релизе на сайте ИБХ.

Мы обнаружили необычные пептидные токсины (названные муринотоксинами) в яде паука-птицееда Pterinochilus murinus. В отличие от ханатоксинов, открытых в лаборатории Нобелевского лауреата Родерика Маккиннона, модулирующих воротные механизмы, муринотоксины блокируют пору калиевых каналов. Для подтверждения молекулярного механизма их действия мы использовали мутантные каналы с аминокислотными заменами в поре.

Любопытно, что по последовательности и цистеиновому мотиву муринотоксины похожи на «обычные» токсины пауков, однако обладают ранее не описанной пространственной структурой и расположением дисульфидных мостиков. Мы назвали новый структурный мотив «дисульфид-сцепленной шпилькой». Муринотоксины проявляют наномолярную аффинность и высокую селективность в отношении нейрональных потенциал-зависимых калиевых каналов и могут быть использованы для изучения функции этих белков.

Подробнее в пресс-релизе.

Е.В. Гришин открыл ацилполиамины — токсины пауков, блокирующие рецепторы глутамата, главного нейромедиатора в ЦНС. Позднее в лаборатории А.И. Соболевского (Колумбийский университет) в сотрудничестве с нами была изучена структура комплекса токсина аргиопина из яда паука-кругопряда Argiope lobata с рецептором. Теперь на основе этой структуры вместе с учеными из ИЭФБ РАН мы создали светопереключаемые блокаторы глутаматных рецепторов.

План строения блокаторов сохранился: к ароматической «голове» присоединен полиаминный хвост. В качестве «головы» мы использовали модифицированный азобензол, для которого характерна светозависимая цис-транс изомеризация, а полиамином выступал спермин. Среди нескольких синтезированных соединений наилучшим оказалось ABSP-6, которое обладало высокой аффинностью и практически полным светопереключением. Новые инструменты подходят для контроля активности кальций-проницаемых AMPA рецепторов в экспериментах на срезах мозга и в клеточных культурах. Теперь, с использованием ABSP-6, можно активировать глутаматные рецепторы светом.

Большинство ионных каналов — олигомеры и при том гетеромеры. Однако в исследованиях в большинстве случаев ограничиваются изучением гомомерных каналов ввиду экспериментальных ограничений. Дело в том, что при коэкспрессии, например, двух субъединиц калиевых каналов они могут образовать шесть разных тетрамеров. Выход из ситуации — использовать сшивки субъединиц, к примеру, путем конкатемеризации их генов. Традиционно получение генетических конструкций с повторами было непростой задачей, однако современные методы клонирования, такие как Golden Gate, позволяют значительно упростить процесс.

Мы получили все возможные комбинации субъединиц калиевого канала Kv1.6 — дикого типа и мутантной с заменой V456L, обнаруженной у пациента с эпилепсией. Введение всего одной субъединицы Kv1.6-V456L оказалось достаточным для проявления эффекта усиления функции канала. По мере добавления большего количества мутантных субъединиц изменение биофизических свойств конкатемерных каналов становилось всё более выраженным. Для объяснения этих эффектов мы построили модели каналов с помощью AlphaFold 3. Кроме того, мы использовали модель типа Ходжкина-Хаксли для центральных интернейронов и наблюдали резкое повышение порога возбуждения в случае введения мутантных каналов.

Механизм биосинтеза белка рибосомой до сих пор не изучен во всех деталях. В частности, не до конца выяснен молекулярный механизм терминации трансляции. Этот процесс катализируется специальными белками — релиз-факторами, которые узнают стоп-кодон и опосредуют высвобождение синтезированной полипептидной цепи из рибосомы. До самого последнего времени считалось, что релиз-факторы активируют молекулу воды, которая вступает в реакцию гидролиза сложноэфирной связи пептидил-тРНК.

В лаборатории Ю.С. Поликанова (Иллинойсский университет в Чикаго) получены кристаллические структуры высокого разрешения комплексов рибосомы с мРНК, релиз-фактором и пептидил-тРНК в P-сайте, соответствующие «предгидролизному» состоянию. Удивительно, но никакой молекулы воды, активируемой релиз-фактором, обнаружено не было. Мы предложили новый механизм, в корне отличающийся от предполагавшегося ранее. Роль релиз-фактора состоит не в прямой активации молекулы воды, а в индукции особой конформации 3'-концевого нуклеотида тРНК, которая способствует активности собственного 2'-гидроксила, опосредующего гидролиз. Важно, что такая конформация не реализуется в ходе элонгации трансляции, исключая возможность преждевременной терминации.

Подробнее в пресс-релизе на сайте ИБХ.

Определён индекс связывания 305 молекул HLA класса I из 18 771 уникальных гаплотипов 28 104 индивидуумов с 821 пептидом, экспериментально обнаруженными в протеасомных гидролизатах RBD 5 основных штаммов SARS-CoV-2. Показано, что мутации в hACE2-связывающей области RBD_496-513 штамма Omicron B.1.1.529 приводят к резкому увеличению протеасом-опосредованного высвобождения двух иммунодоминантных эпитопов HLA I. Глобальный популяционный анализ гаплотипов HLA класса I, специфичных к этим пептидам, продемонстрировал снижение смертности популяций, обогащенных этими гаплотипами, от COVID-19 после декабря 2021 года, когда Омикрон стал доминирующим штаммом SARS-CoV-2. Примечательно, что циркулирующие в настоящее время штаммы содержат аналогичные аминокислотные замены в ключевых сайтах протеасомного расщепления, что сохраняет идентифицированные Т-клеточные эпитопы. Полученные данные могут быть использованы для оптимизации существующих и разрабатываемых Т-клеточных вакцин против атипичной пневмонии.

Биофунгициды рассматриваются в качестве эффективной и биологически безопасной альтернативы химическим препаратам в качестве средства борьбы с фитопатогенами грибной природы. При этом эффект биофунгицидов на профиль почвенных грибов, в числе которых могут быть как потенциальные патогены, так и полезные симбионты, изучен крайне слабо. В настоящей работе было исследовано влияние, оказываемого обработкой биопрепаратами на основе бактерий Bacillus subtilis и Bacillus velezensis, а также фунгицидами трифлоксистробином и тебуконазолом, используемыми для защиты яблони от возбудителя парши Venturia inaequalis, на грибной микробиом ризосферы яблоневых деревьев. Анализ проводился с помощью ПЦР в реальном времени и ДНК-метабаркодинга. Было показано, что обработка трифлоксистробином (500 г/л) и тебуконазолом (250 г/л) снижает разнообразие грибного микробиома, при этом повышая относительную представленность патогенных грибов, прежде всего родов Fusarium, Rhizoctonia и Verticillium. Так, в обработанных трифлоксистробином образцах содержание Fusarium достигало 6*103 КОЕ/г почвы, или 1.92*106 геном-эквивалентов/г почвы, в то время как в контрольном образце их количество составляло 5.2*102 КОЕ/г почвы, или 8.2*105 геном-эквивалентов/г почвы. При этом внесение биопрепаратов не оказывало значительного эффекта на почвенные грибные сообщества, при этом эффективно подавляя развитие возбудителя парши яблони. Полученные результаты демонстрируют эффективность и безопасность подхода, основанного на использовании бактериальных препаратов, для защиты яблони от одного из ключевых грибных патогенов.

Рис. 1. Содержание основных родов грибов в почве ризосферы яблони на фоне обработки биопрепаратами и фунгицидами (КОЕ). К – контроль, BS – Bacillus subtilis, B. velezensis 3 л/га, B. velezensis 4 л/га, B. velezensis 5 л/га, ТФ+ДФ – трифлоксистробин + тебуконазол.

В рамках исследования капсульных полисахаридов Acinetobacter baumannii нами была установлена химическая структура повторяющихся звеньев для ряда не изученных ранее типов капсульного полисахарида (КПС): K49, K104, K111, K95, K129, K58. Установлена вариабельность химических структур КПС  различных штаммов соответствующих генотипу KL58. Также были идентифицированы ключевые гены (гликозилтрансферазы, инициирующие трансферазы) в соответствующих кластерах биосинтеза KL, ответственные за формирование выявленных структурных особенностей. Полученные данные вносят существенный вклад в понимание молекулярного разнообразия и механизмов синтеза КПС у клинически значимых изолятов данного патогена. Все результаты опубликованы в серии статей в рецензируемых научных журналах.

Поли(АДФ-рибозил)ирование (парилирование) — это механизм посттрансляционной модификации белков в эукариотических клетках, который регулирует широкий спектр биологических процессов, включая репарацию ДНК, запрограммированную гибель клеток, передачу сигналов клеток и ответы на биотические и абиотические стрессы. Ферменты поли(АДФ-рибоза)полимеразы (PARP) играют ключевую роль в процессе парилирования, при котором целевые белки модифицируются путем присоединения молекул АДФ-рибозы. Мы исследовали, может ли белок PARP1 и само парилирование участвовать в регуляции ответа растений Nicotiana benthamiana на окислительный стресс, вызванный метилвиологеном (МВ), и каким образом это происходит. При ингибировании парилирования с помощью РНК-инттерференции или с применением фармакологического ингибитора PARP1 – 3-аминобензамида (3AB), происходила задержка выброса активных форм кислорода (АФК), а жизнеспособность зелёной ткани сохранялась дольше, по сравнению с контролем без ингибирования. Показано, что в клетках растений, обработанных МВ в условиях дефицита активности PARP1, наблюдалось снижение уровня накопления парилированных белков и значительное увеличение экспрессии генов основных антиоксидантных ферментов, включая каталазу (CAT), супероксиддисмутазу (SOD), аскорбатпероксидазу (APX) и глутатионредуктазу (GR), а также было отмечено ингибирование гибели клеток. Такой  механизм может быть частью более широкой сети, которая регулирует восприимчивость растений к окислительному стрессу через различные генетически программируемые пути, такие как фолатный и метиониновый циклы.

Пептиды семейства EPIDERMAL PATTERNING FACTOR-LIKE (EPFL) участвуют в регуляции множества морфогенетических процессов у растений, однако участие этих пептидов в ответе на стресс остаётся малоизученным. Мы показали, что нокаутирование PpEPFL5 и PpEPFL10 у мха Physcomitrium patens привело к повышению чувствительности растений к метилжасмонату и абсцизовой кислоте. Количественный протеомный анализ нокаутных линий ppepfl5 и ppepfl10 выявил 98 и 135 дифференциально экспрессируемых белковых групп соответственно, причём у ppepfl5 меняется содержание стрессовых белков, включая АБК-связывающий фактор, LEA-белки, HSP и тиоредоксин. Вместе с тем, нокаутные линии мха P. patens оказались более устойчивыми к инфекции фитопатогеном Pectobacterium carotovorum. Таким образом, пептиды EPFL вовлечены в регуляцию стрессовых ответов у мха Physcomitrium patens.

Отбор засухоустойчивых генотипов дуба черешчатого (Quercus robur L.) является актуальной задачей в условиях глобального изменения климата. Два генотипа дуба, контрастных по засухоустойчивости, выращивали в условиях нормальной доступности воды и в условиях ее дефицита, и проанализировали транскриптом этих растений. У генотипа 1 было обнаружено 70 дифференциально экспрессирующихся генов (DEG) (42 с повышенной и 28 с пониженной активностью), а у генотипа 2 - 97 DEG (37 с повышенной и 60 с пониженной активностью). Функции DEG у засухоустойчивого генотипа 1 были связаны с реакцией на абиотический стресс и изменениями в фотосинтезе, тогда как у чувствительного к засухе генотипа 2 ДЭГ в основном были связаны со стресс-индуцированной регуляцией биосинтеза гормонов и ответом на стресс во внеклеточном матриксе. У обоих генотипов в условиях засухи было обнаружен только общий ген с повышенным уровнем экспрессии, метилстеролмонооксигеназа, которая участвует в биосинтезе стероидов. В качестве маркерных генов, изменивших уровень экспрессии при засухе, могут использоваться гены, связанные с ответом на окислительный стресс. Полученные результаты могут быть использованы для выявления генотипов дуба черешчатого с повышенной устойчивостью к засухе на ранней стадии развития растений.

Рис. 1. Кластерная тепловая карта (a) и вулканическая диаграмма (b) представляют собой анализ DESeq2 между генотипами дуба 1 и 2 в условиях засухи. Каждый столбец тепловой карты представляет собой один образец, демонстрирующий профиль экспрессии для каждого транскрипта.

Наличие гликолипида в составе плазматической мембраны еще не означает, что его гликан будет узнаваться  как антиген – узнавание антителами может отменяться неправильной ориентацией относительно мембраны, кластерной организацией в рафте, маскировкой соседним белком  и др. факторами. И наоборот: в комплексе с мембранным белком формируется нео-антиген, узнаваемый иначе, чем свободный гликан. Чтобы изучать такие эффекты, предложен toolbox (левый блок слайда) синтетических гликолипидов, имеющих один и тот же гликан, но разные липидные участки, разную степень сближенности с мембраной, кластерную организацию гликана. Изучение связывания с анти-гликановыми антителами этих молекул, встроенных в плазматическую мембрану, позволило выявить вклад этих факторов.

Конкретный пример применения этого подхода приведен на среднем блоке слайда. Терапевтические моноклональные АТ против ганглиозида GD2 узнают этот ганглиозид, эндогенно находящийся в опухолевых клетках, но не узнают, если природный ганглиозид экзогенно встраивается в мембрану. Этот эффект может быть вызван комплексообразованием с соседним белком (интегрином, как показано на слайде). Чтобы выяснить, так ли это, или действуют другие причины, был синтезирован набор синтетических аналогов GD2, и показано, что узнавание встроенного гликолипида антителами появляется под влиянием плазматической мембраны на гликановый антиген.

На правом блоке слайда показано изучение анти-пептидных антител ковидных пациентов. Эти антитела диагностичны, но парадоксальным образом направлены к той части S-белка, которая тесно сближена с мембраной, то есть экранирована. МД симулирование показало, что на самом деле этот пептид доступен для взаимодействия. Предполагалось, что антитела лучше узнают пептид в свернутой конформации. Чтобы это показать, предложен подход для презентации пептида в псевдоциклической форме (правый блок слайда): дважды липидированный пептид встраивали в мембрану. Предположение в данном конкретном случае не оправдалось - антитела одинаково связывались с линейной и псевдоциклической формами, однако предложенный изящный метод презентации пептида в форме псевдоцикла может оказаться полезным в других исследованиях.

Колхицин сегодня рассматривается как потенциальное новое средство для блокировки развития воспаления после инфаркта миокарда, причем терапевтический эффект обусловлен концентрацией колхицина внутри лейкоцитов, а не в плазме крови. Нами показано ингибирование выработки провоспалительных цитокинов стимулированными первичными моноцитами из периферической крови человека под действием липосом определенного состава, нагруженных фосфолипидным конъюгатом аллоколхициноида и несущих белковую корону после инкубации в плазме крови. Липосомы без короны вызывали лишь умеренный противовоспалительный эффект. В короне липосом обнаружено повышенное содержание белков, в норме представленных в плазме в минорных количествах, в том числе аполипопротеина D и галектин-3-связывающего белка, которые задействованы в сигналинге воспаления. Описанные липосомы представляют интерес для дальнейших доклинических исследований на адекватной модели сердечно-сосудистых осложнений in vivo.

Универсальные регуляторные элементы могут быть использованы при конструировании ортогональных систем, функционирующих в разных организмах. В данной работе ученые из отдела биомолекулярной химии ИБХ РАН исследовали функциональность ряда составных промоторов в растениях, грибах и бактериях и выявили варианты, обеспечивающие сильную конститутивную экспрессию в Nicotiana tabacum, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli и Agrobacterium tumefaciens. Часть вариантов была функциональна только в эукариотических исследованных организмах. Полученные промоторы могут быть использованы в универсальных векторах для совместной оптимизации под разные организмы при направленной эволюции, конструировании биосинтетических путей и решении других биотехнологических задач, связанных со сменой системы экспрессии.

Сотрудниками Отдела биомолекулярной химии в сотрудничестве с учеными из Курчатовского института и Университета Вестлейк, Ханчжоу, Китай, были разработаны два флуоресцентных белка – PSmOrange3 и mBaoJin, которые открывают новые горизонты для высокоточной визуализации живых клеток. PSmOrange3 обладает уникальными свойствами фотоконверсии: под воздействием синего света он переключается с ярко-оранжевого свечения на глубокое красное, позволяя ученым отслеживать перемещение целевых молекул с нанометровой точностью. В то же время mBaoJin – яркий и исключительно фотостабильный зелёный белок – сохраняет своё свечение даже при длительном облучении, что делает его идеальным маркером для долгосрочных наблюдений. Оба белка были успешно протестированы в живых клетках и доказали свою эффективность в сочетании с передовыми методами суперразрешающей микроскопии (PALM, SIM), позволяя получать сверхчеткие изображения тончайших структур внутри клеток. Эти достижения подчеркивают значимость работы команды в области разработки флуоресцентных меток и открывают новые возможности для биомедицинских исследований, позволяя ученым наблюдать живые клетки на беспрецедентном уровне детализации. Результаты исследований опубликованы в журналах Nature Methods и Scientific Reports.

Разработан метод трёхмерной флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (3D total internal reflection fluorescence, 3D-TIRF), сочетающий ультрамикротомию и TIRF-микроскопию свежесрезанной поверхности образца. Подход позволяет проводить 3D-реконструкцию образца путем создания последовательности ультратонких срезов и получения 2D TIRF-изображения каждого среза с аксиальным разрешением, превосходящим дифракционный предел (достигнутое аксиальное разрешение не хуже 150 нм). Возможности метода продемонстрированы биологических образцах.

Методом голографической литографии созданы высокоупорядоченные металл-диэлектрические метаповерхности со значительной воспроизводимостью усиления рамановского рассеяния, сохраняющие вид исходного (нерезонансного) рамановского спектра. Преимуществом метаповерхностей является их высокая пространственная комплементарность к везикулоподобным объектам, поскольку локализованные плазмонные моды возбуждаются и проявляются в виде выраженных локальных максимумов электрического поля, пространственно ограниченных в областях углублений метаповерхности. С использованием таких систем удалось идентифицировать отдельные внеклеточные везикулы из клеточной линии HEK293T и получить их усиленные рамановские спектры. Одним из перспективных направлений разработки является создание исследовательских и диагностических методов спектрального исследования внеклеточных везикул и других везикулоподобных объектов в автоматизированных аналитических системах Lab-on-a-Chip

Совместно с коллегами из НИЦ “Курчатовский институт”, Сколковским институтом науки и технологий и НМИЦ онкологии имени Н.Н. Блохина разработан способ получения гидрогелей непосредственно в организме. Гидрогели формировали из гиалуроновой кислоты, модифицированной винильными группами, в процессе фотоиндуцированной радикальной реакции сшивки при облучении видимым светом из красного диапазона спектра (660 нм) в присутствии различных инициирующих системы на основе производных фталоцианина с соинициатором. Такая система позволяет отверждать фоточувствительные полимеры в глубине биоткани, поскольку излучение попадает окно прозрачности ткани. Полученные гидрогели были протестированы in vitro и in vivo. Прижизненно фотосшитые гидрогели сохраняли свою форму и размер как минимум в течение одного месяца, что сопровождалось медленной биодеградацией. Предлагаемая технология имеет большие перспективы для малоинвазивного формирования гидрогеля in situ.

Разработаны многослойные полиэлектролитные капсулы, содержащие доксорубицин и модифицированные белком DR5-B, позволяющие преодолеть лекарственную устойчивость клеток рака молочной железы MCF-7.

Капсулы продемонстрировали синергетическую цитотоксичность в отношении устойчивых к DR5-B сфероидов MCF-7 (IC50 227 ± 13 нг/мл), при этом они не были токсичны для фибробластов.

Послеродовой метрит - инфекционно-воспалительное заболевание матки у коров, представляет одну из важнейших проблем ветеринарии и экономики современного животноводства, связанную со снижением возможностей реализации генетического потенциала репродуктивной и лактационной функций животных, их продуктивного долголетия. Общепризнано, что развитие воспалительного процесса в матке связано с инфицированием родовых путей ассоциациями различных патогенных и потенциально патогенных микроорганизмов.

Проведены метагеномные исследования биологических образцов (мазков из цервикального канала и влагалища коров), полученных от коров Голштинской породы ферм Калужской области. Сравнивали три группы животных: здоровые, с метритом и яловые. Выявлено, что у больных метритом животных увеличивается содержание таких бактериальных патогенов как Fusobacterium necrophorum, Porphyromonas somerae и Bacteroides spp. Показана корреляция между присутствием в геноме коров вируса герпеса 4 типа (BoHV4) и 6 типа (BoHV-6) и заболеванием метритом. Определена полная геномная последовательность вируса Macavirus bovinegamma6 (BoHV-6), присутствующая в геноме животных, больных метритом.

Полученные данные представляют большой интерес для развития методов обнаружения патогенов и разработки методов предупреждения заболеваний инфекционной этиологии.

Данные поданы в публикацию: Metagenome Analysis of Microbiota of the Reproductive Tract 2 of Cows with Reproductive Disorders. Sergei Sokolov, Anatoly Sorokin , Timur Dzhelyadin, Kseniya Fursova , Darya Nikanova,  Evgeniya Kolodina, Olga Artem’eva, Varvara Romanova and Fedor Brovko. Microorganisms./in Press

С помощью просвечивающей электронной микроскопии в сочетании с абсорбционной и флуоресцентной 2D и 3D спектроскопией, Н1- и С13-ЯМР, ион-циклотронной масс-спектроскопией высокого разрешения и другими аналитическими методами были изучены химический состав и морфология нано- и микроструктур природных гуминовых веществ (ГВ) и их узкодисперсных электрофоретических фракций. 

Параллельное исследование фитогормональной (стимуляция роста растений) и фотохимической (фотосенсибилизирующая деградация поллютантов с использованием энергии солнечного света) активностей  ГВ и их электрофоретических фракций впервые показало взаимосвязь между данными экологическими функциями, химическим составом и формой морфологических нано- и микроструктур ГВ.

Секвенирование РНК одиночных клеток (scRNA-Seq) даёт ценные представления о биологии клеток. Однако существующие аналитические подходы к scRNA-Seq не различают сплайсированные и несплайсированные мРНК на этапе снижения размерности. В парадигме «RNA velocity» предполагается, что наличие несплайсированной мРНК отражает переходные клеточные состояния, информативные для изучения динамических процессов, таких как эмбриогенез или регенерация тканей. В то же время стабильные клеточные субпопуляции также могут поддерживать резервуары трансляционно репрессированной сплайсированные мРНК (например, в P-тельцах) и/или несплайсированных мРНК для быстрого запуска транскрипционно-независимой экспрессии. Таким образом, функциональные клеточные субтипы могут различаться не только текущими уровнями активно продуцируемых мРНК, но и тем, какие мРНК и в каких формах запасаются в ядре и цитоплазме.

Чтобы сделать возможным сплайсинг-осведомлённый анализ данных scRNA-Seq, мы разработали метод SANSARA (Splicing-Aware scRNa-Seq AppRoAch). Мы применили SANSARA для характеристики субпопуляций регуляторных Т-клеток (Treg) периферической крови и выявили комплементарное взаимодействие мастер-регуляторов FOXP3 и Helios, а также высокие уровни сплайсированных мРНК IL10RA, LGALS3, FCRL3, CD38, ITGAL и LEF1 в эффекторных Treg. Среди субпопуляций Th1 и цитотоксических CD4⁺ T-клеток SANSARA также выявила значительную сплайсинговую гетерогенность по сабсет-специфичным генам. Метод SANSARA легко интегрируется в существующие аналитические пайплайны и открывает новые измерения для открытий на основе scRNA-Seq.

Рибосомноый профайлинг – один из наиболее часто используемых методов для анализа экспрессии генов на полногеномном уровне. На самой первой стадии эксперимента производится лизис клеток и центрифугирование лизата для получения растворимой фракции, содержащей полисомы. В данной работе показано, что при центрифугировании теряется часть транслируемых мРНК, которые ассоциированы с цитоскелетом. Если не проводить стадию центрифугирования и сразу добавлять рибонуклеазу для получения рибосомных футпринтов, то можно получить информацию о трансляции всех мРНК.

Предложен новый научный термин транслон. Этот термин наилучшим образом подходит для описания всех транслируемых участков мРНК.

Аптамеры представляют собой фрагменты нуклеиновых кислот, обладающие большим сродством к мишени. Для их эффективной интеграции в медицину и молекулярную биологию необходимы рациональные стратегии оптимизации сродства аптамеров к мишеням и подходы к их визуализации. Нуклеотидные модификации являются универсальными инструментами как для тонкой настройки свойств аптамеров, так и для их визуализации. Разработана 7,8-дигидро-8-оксо-1,N6-этеноадениновая (oxo-εA) модификация, позволившая увеличить сродство аптамера к тромбину в десятки раз и контролировать сродство за счет внешнего воздействия. Кроме того, продемонстрирована применимость модификаций tCO и tCOAzo на основе 1,3-диаза-2-оксофеноксазина для выявления сайта связывания аптамера с гемагглютинином вируса гриппа и создания ПЦР зондов.  Наконец, создан новый флуоресцентный зонд, демонстрирующий повышенную селективность к аптамеру Манго II по сравнению с другими ДНК/РНК-структурами и повышенную яркость в комплексе с генетически кодируемой РНК, меченной аптамером, в живых клетках по сравнению с известными аналогами.Аптамеры представляют собой фрагменты нуклеиновых кислот, обладающие большим сродством к мишени. Для их эффективной интеграции в медицину и молекулярную биологию необходимы рациональные стратегии оптимизации сродства аптамеров к мишеням и подходы к их визуализации. Нуклеотидные модификации являются универсальными инструментами как для тонкой настройки свойств аптамеров, так и для их визуализации. Разработана 7,8-дигидро-8-оксо-1,N6-этеноадениновая (oxo-εA) модификация, позволившая увеличить сродство аптамера к тромбину в десятки раз и контролировать сродство за счет внешнего воздействия. Кроме того, продемонстрирована применимость модификаций tCO и tCOAzo на основе 1,3-диаза-2-оксофеноксазина для выявления сайта связывания аптамера с гемагглютинином вируса гриппа и создания ПЦР зондов.  Наконец, создан новый флуоресцентный зонд, демонстрирующий повышенную селективность к аптамеру Манго II по сравнению с другими ДНК/РНК-структурами и повышенную яркость в комплексе с генетически кодируемой РНК, меченной аптамером, в живых клетках по сравнению с известными аналогами.Аптамеры представляют собой фрагменты нуклеиновых кислот, обладающие большим сродством к мишени. Для их эффективной интеграции в медицину и молекулярную биологию необходимы рациональные стратегии оптимизации сродства аптамеров к мишеням и подходы к их визуализации. Нуклеотидные модификации являются универсальными инструментами как для тонкой настройки свойств аптамеров, так и для их визуализации. Разработана 7,8-дигидро-8-оксо-1,N6-этеноадениновая (oxo-εA) модификация, позволившая увеличить сродство аптамера к тромбину в десятки раз и контролировать сродство за счет внешнего воздействия. Кроме того, продемонстрирована применимость модификаций tCO и tCOAzo на основе 1,3-диаза-2-оксофеноксазина для выявления сайта связывания аптамера с гемагглютинином вируса гриппа и создания ПЦР зондов.  Наконец, создан новый флуоресцентный зонд, демонстрирующий повышенную селективность к аптамеру Манго II по сравнению с другими ДНК/РНК-структурами и повышенную яркость в комплексе с генетически кодируемой РНК, меченной аптамером, в живых клетках по сравнению с известными аналогами.

Оболочечные вирусы, такие как флавивирусы и коронавирусы, являются патогенами, вызывающими тяжёлые инфекции у человека. Известно, что некоторые фотосенсибилизаторы обладают вирулицидной активностью в отношении оболочечных вирусов, воздействуя на их липидный бислой. Мы получили серию фотосенсибилизаторов на основе галогенированных дифторбор-дипиррометенов (BODIPY) с выраженной вирусинактивирующей активностью. Наш анализ взаимосвязи структуры и активности показал, что каркасы BODIPY с тяжёлым атомом галогена демонстрируют значительную эффективность как против вируса клещевого энцефалита (семейство Flaviviridae), так и против коронавируса SARS-CoV-2 (семейство Coronaviridae), показывая также высокий квантовый выход фотогенерации синглетного кислорода. Будучи фотосенсибилизаторами, воздействующими на мембраны, BODIPY взаимодействуют непосредственно с вирусными частицами, вызывая повреждение мембран вирусной оболочки.

Низкомолекулярные противовирусные препараты, воздействующие на липидный бислой, охватывают самый широкий спектр вирусов. Как направленные на вирион, так и мембраноактивные молекулы воздействующие на хозяина, являются перспективными концепциями для создания противовирусных препаратов широкого спектра действия. Набор одобренных противовирусных препаратов станет эффективным средством реагирования и контроля вспышек заболеваний, вызванных новыми штаммами и вариантами вирусов.

Обширная неоваскуляризация является отличительной чертой глиобластомы (ГБМ). Помимо снабжения кислородом и питательными веществами, сосудистые эндотелиальные клетки обеспечивают трофическую поддержку клеток ГБМ посредством паракринной сигнализации. В данной работе показано, что секретируемый эндотелием протеогликан эндокан (ESM1) усиливает пролиферативные, миграционные и ангиогенные свойства клеток ГБМ. По крайней мере, часть своих функций эндокан реализует посредством прямого связывания и активации рецептора PDGFRA. Последующая передача сигнала усиливает экспрессию гена С-MYC, вызывая стабильные фенотипические изменения в клетках ГБМ. Кроме того, эндокан обеспечивает резистентность к радиотерапии клеток ГБМ in vitro и in vivo. Ингибирование сигнального пути Endocan-PDGFRA с помощью препарата понатиниб увеличивает выживаемость в модели ГБМ у мышей с диким типом Esm1, но не в модели ГБМ с нокаутом Esm1. Результаты наших исследований указывают на то, что эндокан и его нисходящий сигнальный путь являются потенциальной мишенью для подавления рецидива ГБМ и подчеркивают важность взаимодействия сосудов и опухоли в развитии и прогрессии ГБМ.

Эффективность вакцинации и стоимость производства вакцин на основе мРНК во многом зависят от состава компонентов мРНК, поскольку синтез иммуногенного белка требует точной и эффективной трансляции in vivo. Состав комбинаций 5'- и 3'-нетранслируемых областей (НТО) мРНК оказывает сильное влияние на эффективность трансляции. Основной целью данного исследования было повышение вероятности продукции иммуногенного белка, кодируемого вакцинной мРНК. Для этого мы предложили найти новую комбинацию природных НТО и параллельно с этим разработать и протестировать систему для in vivo отбора трансляционно активных НТО. С помощью анализа Ribo-Seq были получены наборы природных НТО-кандидатов. Эти НТО были протестированы как в клеточных культурах, так и на мышах на предмет эффективной продукции секретируемой нанолюциферазы (NLuc) и S-белка SARS-CoV-2. Комбинация наиболее эффективных НТО была использована для создания прототипа мРНК-вакцины, способной индуцировать выработку нейтрализующих антител против коронавируса. Пригодность выбранных НТО для разработки вакцины была проверена путём использования полноразмерной кодирующей последовательности S-белка вируса SARS-CoV-2 для синтеза основного иммуногена. В результате была создана система функционального скрининга НТО с использованием гена NLuc.

Скелетное редактирование - новое направление в органической химии. В отличие от более известной С-H активации, также направленной на позднестадийную функционализацию (LSF) комплексных молекул, скелетное редактирование позволяет внести изменения не на периферии молекулы, а в ее циклическом ядре (скелете). 

В группе химии природных соединений было разработано скелетное редактирование тетралинов, позволяющее осуществлять замену атома углерода на кислород с образованием хроманов. Разработанный подход является дивергентным и позволяет получать хроман-2-олы и хроман-2-карбоновые кислоты в зависимости от реагента.

Была показана широкая применимость разработанного скелетного редактирования, включая модификацию природных биоактивных соединений.

Эффективность вакцинации и стоимость производства вакцин на основе мРНК во многом зависят от состава компонентов мРНК, поскольку синтез иммуногенного белка требует точной и эффективной трансляции in vivo. Состав комбинаций 5'- и 3'-нетранслируемых областей (НТО) мРНК оказывает сильное влияние на эффективность трансляции. Основной целью данного исследования было повышение вероятности продукции иммуногенного белка, кодируемого вакцинной мРНК. Для этого мы предложили найти новую комбинацию природных НТО и параллельно с этим разработать и протестировать систему для in vivo отбора трансляционно активных НТО. С помощью анализа Ribo-Seq были получены наборы природных НТО-кандидатов. Эти НТО были протестированы как в клеточных культурах, так и на мышах на предмет эффективной продукции секретируемой нанолюциферазы (NLuc) и S-белка SARS-CoV-2. Комбинация наиболее эффективных НТО была использована для создания прототипа мРНК-вакцины, способной индуцировать выработку нейтрализующих антител против коронавируса. Пригодность выбранных НТО для разработки вакцины была проверена путём использования полноразмерной кодирующей последовательности S-белка вируса SARS-CoV-2 для синтеза основного иммуногена. В результате была создана система функционального скрининга НТО с использованием гена NLuc.

Оболочечные вирусы, такие как флавивирусы и коронавирусы, являются патогенами, вызывающими тяжёлые инфекции у человека. Известно, что некоторые фотосенсибилизаторы обладают вирулицидной активностью в отношении оболочечных вирусов, воздействуя на их липидный бислой. Мы получили серию фотосенсибилизаторов на основе галогенированных дифторбор-дипиррометенов (BODIPY) с выраженной вирусинактивирующей активностью. Наш анализ взаимосвязи структуры и активности показал, что каркасы BODIPY с тяжёлым атомом галогена демонстрируют значительную эффективность как против вируса клещевого энцефалита (семейство Flaviviridae), так и против коронавируса SARS-CoV-2 (семейство Coronaviridae), показывая также высокий квантовый выход фотогенерации синглетного кислорода. Будучи фотосенсибилизаторами, воздействующими на мембраны, BODIPY взаимодействуют непосредственно с вирусными частицами, вызывая повреждение мембран вирусной оболочки.

Низкомолекулярные противовирусные препараты, воздействующие на липидный бислой, охватывают самый широкий спектр вирусов. Как направленные на вирион, так и мембраноактивные молекулы воздействующие на хозяина, являются перспективными концепциями для создания противовирусных препаратов широкого спектра действия. Набор одобренных противовирусных препаратов станет эффективным средством реагирования и контроля вспышек заболеваний, вызванных новыми штаммами и вариантами вирусов.

Мы провели доклиническое исследование трёх вариантов CAR-T-клеток против B7-H3 с целью обоснования выбора наилучшего кандидата для последующих клинических испытаний при нейробластоме у детей. Полученные CAR-T-клетки, несущие варианты CAR, специфически распознавали и уничтожали B7-H3-позитивные опухолевые клетки in vitro. Тем не менее, TE9-28z и 8H9-28BBz продемонстрировали более высокую активацию и продукцию цитокинов по сравнению с конструкцией 8H9-BBz второго поколения. Клетки TE9-28z и 8H9-28BBz демонстрировали функциональные различия в экспансии, маркерах истощения и секреции цитокинов при совместном культивировании с целевыми клетками in vitro. Несмотря на сопоставимую цитотоксичность, CAR-T-клетки TE9-28z и 8H9-28BBz проявляли различную устойчивость в зависимости от типа опухоли и демонстрировали признаки функционального истощения при длительном воздействии целевого антигена. Клетки TE9-28z и 8H9-28BBz были отобраны для дальнейшей доклинической разработки в качестве перспективных кандидатов для эффективного воздействия на злокачественные опухоли, экспрессирующие B7-H3.

Обширная неоваскуляризация является отличительной чертой глиобластомы (ГБМ). Помимо снабжения кислородом и питательными веществами, сосудистые эндотелиальные клетки обеспечивают трофическую поддержку клеток ГБМ посредством паракринной сигнализации. В данной работе показано, что секретируемый эндотелием протеогликан эндокан (ESM1) усиливает пролиферативные, миграционные и ангиогенные свойства клеток ГБМ. По крайней мере, часть своих функций эндокан реализует посредством прямого связывания и активации рецептора PDGFRA. Последующая передача сигнала усиливает экспрессию гена С-MYC, вызывая стабильные фенотипические изменения в клетках ГБМ. Кроме того, эндокан обеспечивает резистентность к радиотерапии клеток ГБМ in vitro и in vivo. Ингибирование сигнального пути Endocan-PDGFRA с помощью препарата понатиниб увеличивает выживаемость в модели ГБМ у мышей с диким типом Esm1, но не в модели ГБМ с нокаутом Esm1. Результаты наших исследований указывают на то, что эндокан и его нисходящий сигнальный путь являются потенциальной мишенью для подавления рецидива ГБМ и подчеркивают важность взаимодействия сосудов и опухоли в развитии и прогрессии ГБМ.

В клетках поддерживается динамическое равновесие между синтезом и разрушением биомолекул. С возрастом это равновесие может нарушаться, что приводит к возникновению заболеваний, включая диабет и нейродегенеративные заболевания. Аутофагия, ключевой клеточный процесс, участвует в деградации поврежденных или дисфункциональных клеточных компонентов. Нарушение аутофагии может способствовать этому дисбалансу. Аутофагия строго регулируется внутри клетки посредством множества сигнальных путей, в том числе через AMPK-зависимый путь, который функционирует как ключевой сенсор, отслеживающий энергетический статус клетки. Мы оценили способность небольшой группы производных и аналогов 1,3-диаза-2-оксофеноксазина активировать аутофагию/митофагию и выявили два соединения, которые продемонстрировали высокие уровни активации аутофагии через AMPK-зависимый путь. При анализе специфичности соединений-лидеров к AMPK и её основному регулятору SIRT1 на линиях нокаутных клеток было установлено, что одно из соединений-лидеров продемонстрировало специфичность действия к AMPK. Молекулярный докинг показал, что оно связывается с участком 2 γ-субъединицы AMPK, что может способствовать активации AMPK двумя возможными механизмами: предотвращая связывание АТФ с участком 3, тем самым способствуя связыванию АМФ; и напрямую взаимодействуя с мотивом RIM2 для стабилизации его взаимодействия с γ-субъединицей.

Аптамеры представляют собой фрагменты нуклеиновых кислот, обладающие большим сродством к мишени. Для их эффективной интеграции в медицину и молекулярную биологию необходимы рациональные стратегии оптимизации сродства аптамеров к мишеням и подходы к их визуализации. Нуклеотидные модификации являются универсальными инструментами как для тонкой настройки свойств аптамеров, так и для их визуализации. Разработана 7,8-дигидро-8-оксо-1, N-этеноадениновая (oxo-εA) модификация, позволившая увеличить сродство аптамера к тромбину в десятки раз и контролировать сродство за счет внешнего воздействия. Кроме того, продемонстрирована применимость модификаций tCO и tCOAzo на основе 1,3-диаза-2-оксофеноксазина для выявления сайта связывания аптамера с гемагглютинином вируса гриппа и создания ПЦР зондов.  Наконец, создан новый флуоресцентный зонд, демонстрирующий повышенную селективность к аптамеру Манго II по сравнению с другими ДНК/РНК-структурами и повышенную яркость в комплексе с генетически кодируемой РНК, меченной аптамером, в живых клетках по сравнению с известными аналогами.

Скелетное редактирование - новое направление в органической химии. В отличие от более известной С-H активации, также направленной на позднестадийную функционализацию (LSF) комплексных молекул, скелетное редактирование позволяет внести изменения не на периферии молекулы, а в ее циклическом ядре (скелете). 

В группе химии природных соединений было разработано скелетное редактирование тетралинов, позволяющее осуществлять замену атома углерода на кислород с образованием хроманов. Разработанный подход является дивергентным и позволяет получать хроман-2-олы и хроман-2-карбоновые кислоты в зависимости от реагента.

Была показана широкая применимость разработанного скелетного редактирования, включая модификацию природных биоактивных соединений.

Скелетное редактирование - новое направление в химии для модификации циклических фрагментов ядра органических (и биологических) молекул за счет минимальных изменений - добавления, удаления и замены атома. 

Впервые проведен анализ скелетного редактирования в живых системах - в биосинтезе у актинобактерий. Выявлены основные направления скелетного редактирования -  удаления атома углерода и замены атома углерода на кислород в биосинтезе метаболитов, обладающих высокой противораковой активностью. Ключевую роль в данных превращениях играют ферменты, относящиеся к классу флавин-зависимых монооксигеназ.

Найденные закономерности могут послужить основой при разработке новых биомимемтических "химических" аналогов.

Ученые создали принципиально новый тип флуорогенного биосенсора пероксида водорода HyPerFLEX на основе флуороген-связывающего белка Y-FAST и  редокс-чувствительного домена OxyR из Neisseria meningitidis. Длина волны флуоресценции сенсора определяется разнообразием флуорогенов (от зеленого до дальнекрасного) и задается исследователями в зависимости от дизайна эксперимента. В отличие от биосенсоров на основе флуоресцентных белков, флуорогенные биосенсоры не требуют кислорода для созревания флуорогена, что позволяет использовать их в условиях длительной гипоксии или в анаэробных организмах. HyPerFLEX разработан специально для высокоточного высокочувствительного измерения количества H2О2 в живых клетках и их компартментах (в ядре, цитозоле, митохондриях, в люмене и на мембранах ЭПР и актиновых филаментах). Расширенные возможности и широкая спектральная совместимость HyPerFLEX делают его мощным инструментом для проведения мультимодальных и высокоточных исследований окислительного стресса и клеточной сигнализации. Результаты исследования, поддержанного грантом Российского научного фонда (РНФ), опубликованы в журнале Nature Chemical Biology.
 

Термочувствительный канал TRPV1, также известный как рецептор капсаицина, активируется температурой выше 42°С, участвует поддержании температурного гомеостаза организма и опосредует воспалительные реакции. Активация TRPV1 вызывает трансмембранные деполяризующие токи и повышает уровень кальция в цитозоле. Известно, что значительная фракция TRPV1 локализуется в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР), и лиганд-зависимая активация этой фракции вызывает высвобождение кальция из ЭПР. Однако вопрос о том, участвует ли локализованный в ЭПР TRPV1 в повышении уровня кальция в цитозоле в ответ на тепловое воздействие оставался открытым.

• Здесь мы впервые демонстрируем, что вызванные нагревом кальциевые ответы клеток с экспрессией hTRPV1 исчезают после удаления внеклеточного кальция, тогда как агонист TRPV1 капсаицин по-прежнему вызывает повышение внутриклеточного кальция. Возвращение в среду внеклеточного кальция после его удаления восстанавливает вызванные теплом кальциевые ответы клеток. Таким образом, фракция hTRPV1, локализованная в ЭПР и отвечающая на капсаицин, не активируется при нагревании.
• Наши результаты свидетельствуют о том, что благодаря дифференциальной чувствительности пулов hTRPV1, находящихся в плазматической мембране и ЭПР, обеспечивается дискриминация различных физиологических и вредоносных стимулов.
• Существование hTRPV1 одновременно в двух состояниях в клетке – чувствительном и нечувствительном к нагреву – может позволить локализовать участки, ответственные за термочувствительность, в структуре канала, приближая нас к пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе температурно-зависимого открытия канала TRPV1.

Считается, что окислительный стресс и, в частности, активные формы кислорода играют ключевую роль в патогенезе тканей головного мозга при развитии ишемического инсульта. С помощью генетически кодируемого флуоресцентного биосенсора HyPer7 и технологии оптоволоконного нейроинтерфейса мы показали в условиях in vivo генерацию пероксида водорода (H₂O₂) в митохондриях нейронов и астроцитов тканей мозга крыс в модели инсульта, вызванного окклюзией средней мозговой артерии. Выраженное изменение сигнала HyPer7 в клетках наблюдается лишь спустя несколько часов с момента начала окклюзии артерии и последующей реперфузии, причем для астроцитов характерны более выраженные изменения сигнала. Подход Рамановской микроспектроскопии на бодрствующих мышах также выявил редокс отличия между митохондриями нейронов и астроцитов в модели ишемии тканей мозга, вызванной фототромбозом. В отличие от нейронов астроциты демонстрируют перегрузку дыхательной цепи митохондрий электронами через 1 час ишемии. Повышенная нагрузка дыхательной цепи в астроцитах в острой фазе ишемии создает условия для генерации супероксид анион радикала, который приводит к образованию других активных форм кислорода, в том числе H₂O₂. Однако на модели ишемии/реперфузии мозга у крыс повышение концентрации H₂O₂ в астроцитах и ​​нейронах наблюдается на более поздних стадиях патологии, и, вероятно, связано со вторичными редокс-процессами.

Древовидные ветвящиеся структуры повсеместно распространены в природе. То, как морфология ветвления возникает из функциональных потребностей и, в свою очередь, как пространственные и физиологические ограничения формируют ветвящиеся паттерны, во многом остаётся неясным. Применения в вычислительной биологии и биомиметике требуют инструментов для генерации ветвящихся морфологий с широким спектром характеристик. Мы разработали простой вычислительный метод для построения разнообразных ветвящихся структур.  Данный метод строит ветви как сходящиеся пути градиентного спуска на некоторой вогнутой поверхности потенциала. Это можно рассматривать как нестабильность растущего конца ветки  в «обратном времени»: точки слияния сходящихся путей градиентного спуска соответствуют разделению вершин (бифуркации) для расходящихся ветвей, растущих от корня. В нашем случае поверхность потенциала моделируется как карта времени прихода волнового фронта, распространяющегося от некоторого исходного многообразия (источника), и вычисляется с помощью алгоритма быстрого марша по стохастическому полю скорости. Алгоритм включает механизм обратной связи, при котором ранее построенные структуры влияют на поле скорости и минимумы потенциала. Скорость увеличивается вдоль уже построенных ветвей, а обновление источников волны изменяет минимумы потенциала, к которым сходятся пути.  Мы исследуем, как различные параметры, включая свойства поля скорости, правила обратной связи, плотность и порядок выборки исходных инициализирующих точек, влияют как на результирующие формы, так и на их транспортную эффективность. Основное преимущество алгоритма заключается в его простоте и способности генерировать реалистичные отдельные 2D и 3D ветвящиеся структуры, а также сети, заполняющие пространство (тайлинг), подобные тем, что формируют астроциты в мозге.

Создан термостабильный и термоактивируемый мини-интеин на основе полноразмерного интеина DnaE1 из Thermus thermophilus. Применение методов структурной биоинформатики позволило подобрать делецию для удаления эндонуклеазного домена, в результате чего осуществлен рациональный дизайн мини-интеина TthDnaE1 Δ280. Точечные мутации в домене сплайсинга мини-интеина (HINT-домен) позволили устранить активность отщепления N-концевого экстеина и лигирования экстеинов. Для разработанных мини интеинов показана высокая термостабильность, термоактивируемость и способность к эффективному белковому сплайсингу или отщеплению C-концевого экстеина. Искусственный мини-интеин TthDnaE1 Δ280 С1A/D405G может служить основой для разработки новой экспрессионной системы, предназначенной для интеин-опосредованного получения рекомбинантных белков и пептидов медицинского назначения

Исследование структуры и функции активных центров гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансфераз (HGPRT) является актуальной задачей для разработки лекарственных препаратов и ферментативных подходов к синтезу модифицированных нуклеозидов и нуклеотидов. Получена кристаллическая структура HGPRT из E. coli (EcoHGPRT) в комплексе с молекулой HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислота), занимающей положение фосфорибозилпирофосфата (PRPP), одного из субстратов фермента. Помимо структурных исследований, было проведено сравнение ингибирования EcoHGPRT молекулами HEPES и соединениями со схожей структурой. Полученные результаты позволили сопоставить данные об ингибировании и многообразие способов связывания молекул сульфонатных буферных агентов в активном центре HGPRT и схожих белков.

Синтезированы новые аналоги известного антивирусного препарата рибавирина – 2-дезоксирибозиды алкилзамещённого 5-фенил-1,2,4-триазол-3-тиона, изучено их антивирусное действие в отношение вируса простого герпеса на штамме дикого типа HSV-1/L2(TK+) в культуре клеток Vero E6.

Проведен молекулярный докинг производных 1,2,4-триазола с двумя гидрофобными заместителями, предложены два варианта их возможного связывания с активным центром пуриннуклеозидфосфорилазы E. coli. Определены ключевые остатки аминокислот, взаимодействующие с подобными лигандами в реакции дезоксирибозилирования.

Результаты исследования цитотоксичности и противовирусной активности исходных оснований и соответствующих нуклеозидов показали, что удлинение цепи алкильного заместителя в положении C5 5-фенил-1,2,4-триазола приводит к значительному повышению как цитотоксичности, так и противовирусной активности. Наибольшая противовирусная активность наблюдалась для 1-(2′-дезокси-β-D-рибофуранозил)-5-бутилтио-3-фенил-1,2,4-триазола с более высоким индексом селективности, чем у противовирусного препарата рибавирина.

В исследовании in vitro, было показано, что короткий пептид N7.1 (SDNQPGVL), фрагмент белка Hsp70, способен эффективно ингибировать ключевые воспалительные процессы, блокировать взаимодействие TREM-1 с его лигандом, а также  модулировать иммунный ответ путем активирования NK-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов. На основе полученных данных можно предполагать, что пептид N7.1 может стать новым инструментом в борьбе с вирусными заболеваниями.

Разработан способ и тест-система, позволяющие проводить точную идентификацию РНК дальневосточного, сибирского, европейского и байкальского субтипов вируса клещевого энцефалита (TBEV) раздельно, с высокой чувствительностью (количество геном-эквивалентов, детектируемое в одной пробирке не менее 500), быстро (в течение 45 мин) и при постоянной температуре реакционной смеси.

Разработка новых синтетических антимикробных пептидных конструкций (САМПК) с широким спектром активности представляет собой многообещающую стратегию для преодоления множественной лекарственной устойчивости у патогенных бактерий. В этом исследовании мы исследовали антимикробную активность трех разработанных пептидов, которые были сконструированы на основе конъюгации амилоидогенного фрагмента из белка S1 S. aureus и одного или двух интернализирующих фрагментов через линкерную последовательность. Антимикробная эффективность этих конструкций и их комбинаций была оценена против нескольких микроорганизмов. Результаты показали, что все три пептида проявили значительную антибактериальную активность. Комбинации пептидов показали усиленные ингибирующие эффекты и сниженные минимальные ингибирующие концентрации (МИК), что предполагает синергические или аддитивные взаимодействия. Анализ индекса фракционной ингибирующей концентрации (FICI) подтвердил, что большинство комбинаций проявили синергические или аддитивные эффекты. Эти результаты подчеркивают потенциал модифицированных пептидов САМПК в качестве противомикробных агентов и важность оптимизации комбинаций пептидов для терапевтического применения.

Поиск у бактериофагов белков с EF-подобной кальцийсвязывающей петлей, впервые обнаруженной у эндолизина фага Т5 (EndoT5), выявил группу из 71 ортологичных пептидаз подсемейства М15_С. Все найденные последовательности принадлежат фагам, инфицирующим грамотрицательные бактерии родов Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Shigella, Edwardsiella, Pectobacterium, Aeromonas, Shewanella и др. Мы охарактеризовали представителя группы, гипотетический белок бактериофага 3 Aeromonas. Показано, что новый фермент EndoA3 – функциональная пептидогликангидролаза, цинксодержащая кальций-зависимая l-аланил-d-глутаматпептидаза (EC 3.4.24.B24). EndoA3 эффективно лизировал грамотрицательные бактерии и грамположительные бактерии рода Bacillus. EndoA3 – мономерный глобулярный белок; ионы каталитического Zn²⁺ и регуляторного Ca²⁺ необходимы для формирования активной глобулы. Как и у EndoT5, cродство к кальцию у EndoA3 низкое (Кд=(1.4±0.1)·10^-4 М), недостаточное для активации в цитоплазме клетки-хозяина. По-видимому, активация эндолизинов группы l-аланил-d-глутаматпептидаз периплазматическим кальцием – результат коэволюции бактериофагов и их грамотрицательных хозяев.