Пресс-центр / новости / Наука /

Информация о ходе выполнения проекта Российского научного фонда по Соглашению № 14-50-00131

За отчетный период 2016 года в рамках выполнения соглашения были проведены следующие работы:

по направлению «Белки биокаталитических систем»

 

Осуществлен дизайн мутантных форм EcLon-протеазы и на его основе получена и охарактеризована форма фермента с делецией фрагментов V385–I399 и D431–P436, формирующих подвижные петли (Ес-Lon-d2). Установлено, что N-концевой фрагмент (1-172) абсолютно необходим для реализации процессивного механизма гидролиза белковых субстратов EcLon-протеазой.

На основе созданных штаммов E. coli, продуцирующих рекомбинантную IgA1 протеазу и ее фрагменты из различных участков первичной структуры фермента, получены в высокоочищенном состоянии четыре рекомбинантных белка, содержащие гистидиновую метку в С-концевой части молекулы: (M-A28–P1004-LEH6), M-W140–K833-LEH6, M-W329–P1004-LEH6 и M-W140–Q299-Y866–P1004-LEH6. В экспериментах на животных исследованы иммуногенные и протективные свойства полученных соединений. Показано, что аминокислотные последовательности N- и C-концевых участков IgA1 протеазы (W140–Q299 и Y866–P1004) и локализованные в них эпитопы, играют важную роль в формировании у иммунизированных животных долгосрочного иммунного ответа к IgA1 протеазе и эффективной защиты от менингококков основных эпидемических серогрупп А, В и С.

Исследован ограниченный протеолиз олигопептидазы PSP и показано, что в результате трипсинолиза происходит отщепление С-концевого фрагмента 656-677 с образованием PSP (1-655), который не обладает протеолитической активностью. Укороченный вариант PSP (1-655), полученный экспрессией соответствующего гена в E. coli также оказался неактивным. Химотрипсинолиз приводил к образованию PSP (101-677), обладающему способностью гидролизовать низко- и высокомолекулярные субстраты, включая азоказеи и проинсулин.

Получена панель мутантных антител, обладающих улучшенными параметрами активности по отношению к субстратам метилпараоксон, а также флуоресцентным аналогам параоксона. Установлено, что уровень активности мутантных по отношению к фосфорорганическим сусбтратам меняется в ряду параоксон>метилпараоксон>Par-R>Par-MCA в сторону уменьшения скорости образования ковалентного комплекса антитело-органофосфат.

В результате скрининга библиотек были идентифицированы пять вариантов БХЭ (БХЭ-PSHSG, БХЭ-KRLSG – при отборе на Par-MCA и БХЭ-DHISG, БХЭ-DHRSG, БХЭ-HTIHG – при отборе на S-MCA). Все полученные препараты обладали способность к реактивации после ковалентного связывания со «своим» субстратом.

Был отобран пул мутантных форм ЕК, обладающих активностью примерно в 300 раз выше в сравнении с исходным ферментом ЕК. Было установлено, что использование негативного типа селекции обогащения на варианты ЕК, обладающих повышенной специфичностью не целесообразно. В результате очевидно необходимо разрабатывать режимы позитивной селекции для отбора вариантов, обладающих заданными параметрами специфичности.

Предложена новая стратегия биосинтеза биологически важных нуклеотидов, которая состоит в мультиферментном каскадном превращении D-пентоз в пуриновые нуклеотиды. Каскадный синтез включает последовательное превращение в «одной колбе» D-пентоз в 5-фосфаты под действием рибокиназы, из которых затем синтезируются 5-фосфо-α-D-пентофуранозо-1-пирофосфаты под действием фосфорибозилпирофосфатсинтетазы (PRPP-cинтетазы), конденсация последних с гетероциклическими пуриновыми основаниям в присутствии аденинфосфорибозилтрансферазы (APR-трансферазы) дает желаемые нуклеотиды.

С использованием ранее созданных штаммов-продуцентов рибокиназы из Thermus species 2.9 (TspRK), PRPP-cинтетазы 2 из Thermus thermophilus HB27 (TthPRPPS) и APR-трансферазы 2 из Thermus thermophilus HB27 (TthAPRT) и разработанных методик выделения осуществлена наработка ферментов в количествах, достаточных для дальнейшего проведения рентгеноструктурных исследований. Проведен комплекс работ по оптимизации условий кристаллизации белков: подобраны условия кристаллизации методом диффузии паров растворителя и адаптированы применительно к методу встречной диффузии в капиллярах. Получены дифракционные наборы всех ферментов, пригодные для определения пространственной структуры, и проведена съемка рентгенодифракционных имиджей кристаллов наилучшего качества. С использованием метода молекулярного замещения получены структуры TthPRPPS и TthAPRT. Проанализирована структура TthPRPPS и определен аллостерический активный центр фермента. Проведен компьютерный докинг комплекса TthPRPPS с лигандом и предложены варианты для направленного мутагенеза фермента с целью изменения его субстратной специфичности.

Получен очищенный препарат нового фермента - люциферазы Fridericia heliota в активном состоянии. Для локализации люминесценции в геле использовали систему детекции люминесценции Fusion Solo. Для детекции биолюминесцентной активности в геле сначала проводили электрофорез в неденатурирующих условиях, затем гель обрабатывали раствором содержащим люциферин и АТФ как указано к подписи к рисунку. Результаты эксперимента представлены на рисунке 1.7.1.

В связи с установлением структуры люциферина F.heliota актуальной стала задача получения его аналогов, которые бы обладали новыми спектральными характеристиками. Для решения этой задачи необходимо было ответить на вопрос о функциональной роли различных структурных фрагментов молекулы люциферина. В ходе предварительных исследований было установлено, что активность в реакции биолюминесценции, вероятнее всего, проявляет одна из карбоксильных групп в остатке ω-оксалиллизина (LysOx), поэтому модификация исходной структуры без потери активности возможна по фрагменту ГАМК. Для проверки этой гипотезы был осуществлен синтез двух аналогов люциферина, вариабельных по этому остатку.

Для синтеза производного люциферина с линкерной аминогруппой 2.28 и его конъюгата с флуоресцентным красителем 2.30 были использованы вещества CompX 2.4 и 2.26 (Схема 1.7.1).

Путем активации кислоты из 2.4 был получен пептид 2.27, в котором удаляли метильную защитную группу, а затем проводили пептидный синтез - сочетание с остатком лизина 2.10. Для получения целевого продукта 2.28 удаляли защитные трет бутильную и этильную группы. Соединение 2.30 было получено конъюгацией амина 2.28 и соответствующего активированного эфира 2.29 в гидрокарбонатном буфере.

Было показано, что соединения 2.28 и 2.30 обладают биолюминесцентными свойствами, аналогичными природному люциферину, проявляя активность при добавлении экстракта люциферазы. Эти данные подтвердили гипотезу о том, что фрагмент ГАМК не принимает участие в реакции биолюминесценции F. heliota.

Спектры поглощения и биолюминесценции аналога люциферина 2.30 в сравнении с люциферином 2.1 представлены на Рисунке 1.7.2. Можно наблюдать значительное смещение максимума поглощения для соединения 2.30 в красную область, которое объясняется наличием новой хромофорной группы. Максимум биолюминесценции также смещается: если для люциферина 2.1 он составляет 478 нм, то для аналога 2.30, в котором возможен Фёрстеровский перенос энергии излучения (BRET) с люциферина на хромофорную группу, пик биолюминесценции соответствует 528 нм.

по направлению «Рецепторные и сигнальные белки. Анализ структуры и функции»

 

С помощью гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения исследованы минимальные функциональные фрагменты рецепторных тирозинкиназ (рецепторов нейротрофинов и эпидермальных факторов роста) в мембраноподобных средах. Выявлены структурные детерминанты и построены конформационно динамические модели функционирования рецепторов в мембране клетки. Для функционирования рецептора нейротрофинов показана важность образования межмолекулярной SS-связи между трансмембранными доменами внутри мембраны. На основе структурных ЯМР данных и молекулярного моделирования выявлено влияние соматических онкогенных трансмембранных мутаций на активацию рецепторов эпидермальных факторов роста.

Нами было ранее показано, что рецепторная тирозинкиназа ИРР, близкий структурный гомолог рецептора инсулина, является клеточным сенсором слабощелочной среды. Была проведена экспрессия эктодомена ИРР в эукариотических клетках, выделен чистый белок и изучена его пространственная структура при помощи криоэлектронной микроскопии и малоуглового рентгеновсого рассеяния. Построена модель трехмерной структуры эктодомена и найдены ее изменения при защелачивании среды.

В ходе работы по проекту у модельного объекта - шпорцевой лягушки - впервые был найден мембранный трех-петельный белок, Tfp4, и показано, что он является потенциальным рецептором секретируемого фактора Agr2. Так как Agr2 вовлечен во множество процессов в нормальном развитии и при патологии, выявление и изучение его рецептора является важной задачей.

по направлению «Пептидомика. Пептидные факторы системы врожденного иммунитета»

 

Для экспрессии антимикробных пептидов в бесклеточной белоксинтезирующей системе были получены генно-инженерные конструкции в виде кольцевых и линейных молекул ДНК, кодирующих АМП (цистеин-содержащие, в т.ч. бета-шпилечные, пролин-богатые, производные гистонов) под контролем промотора Т7. Была исследована зависимость уровня экспрессии от концентрации ДНК матрицы, температуры, концентрации ионов магния. Проведена работа по оптимизации условий реакции бесклеточного синтеза и осуществлена препаративная наработка трех пептидов в количествах, достаточных для проведения тестов антимикробной и гемолитической активности.

Изучена антимикробная активность семи пептидов (ThM21L, 3W, TachZ, TachY8S, TachY8R, TachI11S, TachI11R) в отношении штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также их гемолитическая активность в отношении свежевыделенных человеческих эритроцитов. Были получены значения минимальной ингибирующей, минимальной бактерицидной и минимальной гемолитической концентраций исследуемых пептидов. Для трех наиболее активных пептидов (TachZ, TachY8S, TachI11S) были построены кинетические кривые действия на цитоплазматическую мембрану бактерий E. coli.

Получены адсорбционные зависимости разности граничных потенциалов (РГП) от концентраций ареницина-2 и Lc-LTP2 для БЛМ, моделирующих свойства мембран грамположительных, грамотрицательных бактерий и клеток млекопитающих. Установлен эффект увеличения РГП с увеличением доли отрицательно заряженных фосфолипидов в БЛМ. В экспериментах по измерению мембранного тока показано, что проводимость пептид-индуцируемых проводящих пор увеличивается соответственно доле отрицательно заряженных фосфолипидов в БЛМ. Изучено влияние модифицированных аналогов ареницина-2 на барьерные свойства БЛМ. В работе использовали аналоги со следующими заменами Tyr5Ser (аналог А1) и Val4Ser (аналог А2). Оба аналога вызывают флуктуации проницаемости БЛМ всех типов. Действие аналога А2 не приводит к разрушению мембраны. Замена Tyr5Ser способствует ускорению разрушения мембраны под действием данного пептида в той же концентрации, что и для исходного пептида.

Структура этого катионного пептида в частично заряженной мембране, состоящей из ФГ/ФХ, исследована методами Фурье ИК и КД-спектроскопии. Фурье ИК спектры ареницина в области амида I анализировали методом разложения сложного контура и методом второй производной. Данные Фурье ИК для пептида в липосомах из ФГ/ФХ сопоставлялись с данными, полученными в мицеллах анионного детергента додецилсульфата натрия, где согласно данным ЯМР- спектроскопии ареницин формирует димер, образованный при ассоциации двух параллельных β-шпилек. Результаты указывают на то, что ареницин формирует димерную структуру в частично заряженной липидной мембране из ФГ/ФХ.

Получен лабораторный образец липид-транспортирующего белка укропа Anethum graveolens (Ag-LTP), меченный стабильными изотопами 13C,15N. Полученный образец был охарактеризован методами электрофореза в ПААГ, масс-спектрометрии МАЛДИ, КД-спектроскопии и автоматического N-концевого микросеквенирования. Методом ЯМР-спектроскопии была определена пространственная структура липид-транспортирующего белка укропа Ag-LTP в водном растворе. Определены оптимальные условия для измерения ЯМР-спектров Ag-LTP. Было показано, что структура Ag-LTP представлена четырьмя α-спиралями и содержит длинную неупорядоченную петлю в С-концевом участке молекулы. Ag-LTP содержит внутреннюю гидрофобную полость объемом ~800 ų, в которой располагается сайт связывания липидных молекул. По данным о релаксации ядер 15N охарактеризована внутримолекулярная динамика Ag-LTP в свободном состоянии и в комплексе с липидом LPPG.

В рамках количественного анализа пептидомов крови было проведено выделение пептидного пула из 9 образцов сыворотки крови здоровых доноров и 9 образцов пациенток с подтвержденным диагнозом рак яичников, используя крупнопористый слабый катионообменный сорбент Toyopearl CM-650M, Tosoh Bioscience LLC, USA. Был проведен количественный анализ пептидомов сыворотки крови методом безметочной квантификации SWATH LC-MS/MS. В процессе проведения экспериментов была отработана технология безметочной квантификации таких сложных биологических жидкостей, как плазма или сыворотка крови. Количественным безметочным масс-спектрометрическим методом SWATH в пулах образцов сыворотки крови пациенток с подтвержденным диагнозом рак яичников обнаружено 36 пептидов, содержание которых в 2 или более раз выше, чем в пулах сыворотки крови здоровых доноров, и 28 пептидов, содержание которых в 2 или более раз ниже, чем в пулах образцов от здоровых доноров.

Для секвенирования транскриптома была выделена и очищена мРНК из трёх типов клеток мха Physcomitrella patens. Секвенирование библиотеки мРНК было проведено с использованием генетического анализатора SOLiD 4 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Была обнаружена транскрипция 23446 генов, к которым относится 47976 изоформ. При этом 12043 генов имеют более одной изоформы, т.е. подвергаются альтернативному сплайсингу (AS). Для идентификации дифференциально-экспрессирующихся (DE) и дифференциально-альтернативно сплайсирующихся (DAS) генов мы составили каталог транскриптов, которые включал 61048 транскриптов для 32275 генов, куда отнесли и аннотированные изоформы, содержащиеся в версии генома мха 1.6. Известно, что помимо белок-кодирующих транскриптов, короткие открытые рамки считывания (sORFs) с высоким кодирующим потенциалом могут быть обнаружены на длиных некодирующих РНК (lncRNAs). Поэтому, для более полного описания транскриптома клеток мха мы отобрали lncRNAs, потенциально способные нести sORFs. Оценка кодирующего потенциала транскриптов проводилась по следующей схеме: транскрипты, длиной свыше 200 нуклеотидов, не являющиеся аннотированными транскриптами (версия генома 1.6) были отобраны, и проведен анализ их кодирующего потенциала с помощью программного пакета CNCI и базы данных Rfam. Кроме того, было проведено секвенирование неполиаденилированной РНК, выделенной из протонемы и протопластов P. patens для того, чтобы идентифицировать транскрипты участков генома, способные кодировать пептиды, но не связанные с работой РНК-полимеразы II. Для этого выделенная тотальная РНК была секвенирована на платформе Illumina HiSeq (DNA Sequencing Center/Brigham Young University). В результате было получено 106,178,640 и 102,092,879 высококачественных парных ридов для РНК, выделенной из протонемы и протопластов, соответственно. С помощью программы Trimmomatic были отрезаны адаптеры, и риды были отфильтрованы по длине (минимум 105 п.н.). Затем риды были картированы на последовательности хлоропластной и митохондриальной ДНК мха, и картированные риды (около 60%) были отфильтрованы. В итоге для сборки lncRNA были использованы 45,648,279 парных ридов для протонемы и протопластов. Длина ридов варьировала от 105 до 113 п.н.

Используя результаты транскрипционного профилирования, была создана база данных коротких последовательностей для поиска пептидов в образцах с помощью масс-спектрометрического анализа. Данная база включает в себя аминокислотные последовательности, соответствующие sORFs, лежащих на транскриптах и, следовательно, имеющих высокий кодирующий потенциал.

по направлению «Мастер-регуляторные белки и гены развития и канцерогенеза на примере поджелудочной железы»

 

Задачей данного направления является выявление мастер регуляторных генов и кодируемых ими белков, ответственных за включение морфогенеза поджелудочной железы в процессе эмбрионального развития человека, исследование их экспрессии в норме и дисрегуляции в процессе канцерогенеза, а также исследование возможностей использования мастер генов в качестве мишеней для диагностики и терапии рака поджелудочной железы, в том числе PDAC.

Мы выдвигаем гипотезу, что ключевые для эмбрионального развития гены – мастер гены и белки являются также ключевыми для инициации и эволюции раковой опухоли, включая метастазирование. В предлагаемом Научном проекте мы основываемся на литературных данных и собственных результатах, полученных нами в предыдущих исследованиях, которые свидетельствуют о том, что гены и сигнальные пути, ответственные за включение морфогенетических процессов в ходе эмбрионального развития, при канцерогенезе выключаются (и наоборот). Итогом проекта будет расширение фундаментальных знаний о механизмах развития и раковой трансформации поджелудочной железы и выявление потенциальных мишеней терапевтического воздействия.

Для решения этой задачи были систематизированы данные по белкам и генам, вовлеченным в развитие и морфогенез поджелудочной железы человека и животных. Систематизированы данные по белкам и генам, активно вовлеченным в возникновение и развитие рака поджелудочной железы, а также в инициацию метастатического процесса и диссеминированного роста. Проведено сопоставление этих двух массивов данных и выявлены потенциальные гены-кандидаты, вызывающие эмбриоподобное состояние раковых клеток.

Созданы коллекции эмбриональных тканей человека на различных стадиях формирования поджелудочной железы. Собраны образцы аутопсийного материала ткани нормальной поджелудочной железы и коллекция хирургических образцов поджелудочной железы при хроническом панкреатите. Созданы коллекции хирургических образцов рака поджелудочной железы. Все образцы гистологически охарактеризованы, собраны сведения о пациентах. Созданы аннотированные каталоги собранных образцов тканей. Из собранных образцов тканей приготовлены панели РНК, кДНК, а также выделена геномная ДНК для проведения в дальнейшем эпигенетического анализа промоторов наиболее интересных мастер генов.

Для дальнейшей работы были взяты шесть потенциальных мастер генов (PDX1, PTF1a, SOX9, HNF1-beta, GATA4, KLF5 и ZEB1) и белков, вызывающих эмбриоподобное состояние опухоли. Проведен экспериментальный анализ содержания продуктов экспрессии потенциальных мастер генов в опухолевых и эмбриональных тканях поджелудочной железы, показана дифференциальная экспрессия этих генов в опухолевых и фетальных тканях поджелудочной железы.

Кроме того в работу взят ген FAP, белок которого содержится в клетках CAF (cancer associated fibroblasts), составляющих основную массу (до 90%) стромального окружения опухолей эпителиального происхождения. CAF клетки характерны практически для всех карцином и FAP может быть перспективной мишенью для терапевтического воздействия. Проанализирован уровень экспрессии гена FAP на панели клеточных линий. Полученные данные обобщены в опубликованной статье.

За отчетный период опубликовано 7 обзоров, обобщающих современные представления о механизмах молекулярного эмбриогенеза и канцерогенеза, их взаимосвязи, и роли мастер генов и регуляторов транскрипции в этих процессах. Опубликовано две статьи с экспериментальными данными. Материалы работы были представлены на четырех конференциях. Таким образом, проект развивается по намеченному плану, и все задачи, намеченные на отчетный период, выполнены.

по направлению «Белок и гликан-опосредованные клеточные взаимодействия в динамических условиях»

 

1. Молекулярная динамика для объяснения толерантности естественных антител. Проведено исследование почему не происходит аутоиммунной реакции между антителами к трисахариду Pk (он является гликаном гликолипида Gb3) и нормальным компонентом клеток, гликолипидом Gb3. Синтетический аналог гликолипида, отличающийся наличием спейсера-вставки между трисахаридом и липидом, связывался с антителами человека как в липидных мембранах, так и в искусственных тест-системах. Для объяснения иммунохимических данных была привлечена Молекулярная Динамика: симуляция проводилась с кластером молекул Gb3 (или его синтетическим аналогом sGb3), окруженных разными фосфолипидами Найдено, что: 1) холестерин (также, как и в иммунохимических экспериментах) не влияет на ориентацию трисахарида; 2) склонности к образованию кластеров гликолипидов не наблюдается; 3) водородные связи с молекулами среды значительно лучше формирует sGb3, чем природный гликолипид, а доступность внутреннего остатка Glc в Galα1-4Galβ1-4Glc в заякоренной молекуле sGb3 принципиально выше, чем в Gb3. Иммунохимические эксперименты по взаимодействию антител с широким рядом синтезированных аналогов (здесь без липидной части) показали, что приближенный к мембране остаток Glc важен для взаимодействия. Всё вместе это дает право заключить, что пространственная недоступность эпитопа естественных анти-Pk антител является причиной отсутствия в крови взаимодействия антител с казалось бы комплементарным антитеном. Далее, МД симуляция Gb3 в составе мицеллы выявила доступность остатка Glc, что предполагает возможность узнавания естественными антителами Gb3-содержащих свободных или формирующихся на внешней стороне мембраны везикул высокой кривизны; это будет предметом экспериментального изучения в дальнейшем.
2. Адаптация техники Surface Plasmon Resonance (SPR) для целей проекта. Исследовалась кинетика взаимодействия антител MA58-1 (IgG), направленных к дисахариду LeC, с помощью двух слайдов, с разной химией иммобилизации дисахарида. Поверхность золотого SPR слайда модифицировали цистеин-содержащим конъюгатом LeC-PAA-Cys в области первой проточной ячейки, а также AG-PAA-Cys (производное аминоглюцитола) как контроль - в области второй проточной ячейки слайда. Сенсограммы выглядят как классические SPR данные. Поверхность карбоксиметилдекстранового SPR слайда модифицировали мономерным LeC-spNH2 (область первой проточной ячейки) и AG-NH2 (контроль, область второй проточной ячейки), сенсограммы при таком методе иммобилизации значительно отличаются от классических SPR гистограмм, причины этого выясняются. В результате, 1) иммобилизация углеводного антигена на золотом слайде гликозилированным полимером через цистеин дает заметно лучшие результаты, чем иммобилизация того же мономерного лиганда на карбоксиметилдекстрановом слайде; 2) адекватной моделью взаимодействия антиген:антитело (IgG) при выбранном методе иммобилизации (через полимер) следует считать 1:1, так как при модели 1:2 величина KD порядка 10-11 для данных антител (выбранный антиген не является для них оптимальным) представляется нереальной; 3) найденные условия иммобилизации и условия проведения SPR-анализа можно далее применить для исследования естественных антител человека к гликану методом SPR.
3. Перенос гликолипидов на бактерии. В 2016 году мы продемонстрировали возможность быстрого переноса модельных липидов из клеток на бактерии. Затем тот же самый эффект был показан на гликолипиде, окрашивание проводили с помощью флуоресцентно-меченых антител к гликану этого гликолипида, тетрасахариду A(type 2). Наконец, показана возможность быстрого (меньше 1 мин) переноса липидов между гликолипид-модифицированными и нативными бактериями. Таким образом, гликолипиды могут переноситься из клеточной мембраны на бактерии, и передаваться между бактериями, причем процесс переноса происходит очень быстро – это неожиданно, мы ожидали, что быстрый («авидный») захват предполагает медленный трудный их релиз.
4. Динамическое светорассеяние, малоугловое рассеяние и AFM гликолипидов. AFM показывает наличие мицелл, которые в результате высушивания приобретают форму сплюснутого эллипсоида. Отметим, что частицы как мелкие (мицеллы), так и крупные (липосомы) практически одной формы, отличаются только размером, что указывает на высокую устойчивость частиц, которые не разрушаются даже при высушивании. Кроме того, отсутствуют «слипшиеся» частицы, что свидетельствует о высокой их коллоидной стабильности.
5. Зондовая микроскопия (AFM) в изучении вируса гриппа. Был приенен метод, основан на использовании биотинилированного лиганда гемагглютинина вируса. Данную технику иммобилизации вирусных частиц мы применили для закрепления их на кончике зонда атомно-силового микроскопа, контролируя процесс с помощью растрового электронного микроскопа. Однако, вирусы осаждались преимущественно на основании кантилевера, но не на зонде. Причина будет выясняться, параллельно будет использована другая методология иммобилизации. Несомненным положительным итогом исследований 2016 г. является уверенность в возможности изучения вируса гриппа данным методом.
6. Естественные антитела (еАТ) как регуляторы адгезии ЦОК, ЛНП и др. Для изученияроли еАТ в роллинг-подобных механизмах адгезии, и возможной блокирующей роли, что служит причиной резистентности раковых клеток к иммунитету на сегодня представляется единственно возможным применение метода иммуно-ПЦР (иПЦР), обладающего рекордно высокой чувствительностью. В качестве первого этапа мы использовали иПЦР на основе ИФА, который дал нам возможность оценить чувствительность разрабатываемого чипного варианта на примере антител к дисахариду LeC, которые предположительно связываются с ЦОК, и несомненно являются опухоле-специфичными. Минимальная определяемая концентрация антител LeC методом иПЦР была 4 нг/мл, в то время как в ИФА - 300 нг/мл. Во всех экспериментах колебания значений ΔCq не выходили за пределы 0.2 цикла, что говорит о хорошей воспроизводимости получаемых результатов. Так как определяемые анти-LeC иммуноглобулины по аффинности и изотипному составу (в основном, IgM) являются типичными представителями еАТ, то есть основания полагать, что этот метод столь же успешно будет работать при детекции других анти-гликановых антител. Особо подчеркнем достоверность определения малого количества антител, что важно для выявления клеточных мишеней еАТ. Величина 4 нг соответствует ~108 молекул IgM; если количество клеточных мишеней на одной клетке не превышает величины 104, то для определения специфичности маскирующих антител методом иПЦР потребуется 104 – 105 клеток, что представляется вполне реальным количеством.
7. Синтетическая часть. За 2016 г. библиотека гликанов пополнилась 20 новыми гликанами и 50 новыми гликоконъюгатами
8. Приборно-методологическая работа. Была использована комбинация методов сканирующей зондовой микроскопии (СТМ) и оптической микроспектроскопии (ОМ), которые инструментально реализованы в одном приборном комплексе, что позволило получать изображения высокого и сверхвысокого разрешения (СТМ) и данные о структуре-функции локальных объектов (ОМ). Отработка методов осуществлялась на примерах гибридных наноструктур, содержащих флуоресцентные квантовые точки, были исследованы модельные пурпурные мембраны с бактериородопсином, благодаря чему была отработана техника оптической микроспектроскопии, в частности методы гигантского комбинационного рассеяния, применительно к клеточным мембранам. Особенности техники ОМ определялись на модели белок/наночастица, где в роли наночастиц применяли серебряные плазмонные или полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы. Процесс трансформации сигнала бактериородопсином оказался чувствительным к окружению, что позволяет использовать этот объект для оценки параметров микроспектральной техники Для изучения динамических процессов взаимодействия биологических объектов, были созданы ратиометрические наносенсоры, позволяющие регистрировать изменения температуры в локальных объемах сред (в том числе и в потоке) в физиологическом диапазоне температур (25-40°С).

 

9 декабря 2016 года

Прикрепленные файлы:

<form action="" method="post" class="commentForm" id="commentForm-{0}"> <input type="hidden" name="pressId" value="1869" /> <input type="hidden" name="parentId" value="{1}" /> <input type="hidden" name="id" value="{2}" /> <txt name="comment_text" id="comment_text">{3}</txt> <input type="button" class="button" value="Комментировать" /> <a class="button" href="javascript:void(null)">Отмена</a> <span class="wait">Подождите немного...</span> <div class="clear"></div> </form>