Пресс-центр / новости / Наука /

Яркий коротышка: BrUSLEE – зелёный флуоресцентный белок с уникальными свойствами

Исследователи из Лаборатории биофотоники ИБХ РАН (Анастасия Мамонтова, Константин Лукьянов и Алексей Богданов) методом полурациональной белковой эволюции получили новый зелёный флуоресцентный белок, сочетающий высокую яркость и короткое время жизни флуоресценции. Изучить физические характеристики этого перспективного для микроскопии времени жизни флуоресценции (FLIM) маркёра помогли коллеги из Институтов Биохимии им. А.Н. Баха и Химической физики им. Н.Н. Семёнова. Работа опубликована в журнале Scientific Reports.

FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy) – современный метод микроскопии, позволяющий различать спектрально близкие флуорофоры за счёт детекции отдельных фотонов с высоким временным разрешением. Если в традиционной флуоресцентной микроскопии многоцветное мечение обеспечивается только спектральным разнообразием маркёров (а это 4-5 независимых каналов детекции), то FLIM-микроскоп способен регистрировать ещё и время жизни флуоресценции флуорофора – величину, которая может существенно отличаться у меток похожего «цвета».

Времена жизни флуоресценции большинства флуоресцентных белков (ФБ) располагаются в довольно узком диапазоне (2,5-3,5 нс), что затрудняет высококонтрастную FLIM-визуализацию на их основе. Определённые успехи были достигнуты в области дизайна ФБ с увеличенным временем жизни (до 5,1 нс у белка NowGFP). В то же время ниша «короткоживущих» белков оставалась до недавнего времени практически свободной. Связано это прежде всего с достаточно жёсткой корреляцией между временем жизни и квантовым выходом флуоресценции. Так, метки с временем жизни менее 1 нс имеют, как правило, квантовый выход менее 10 %. «Тусклый» флуорофор означает слабый сигнал, увеличенное время сканирования, флуоресцентные данные низкого качества.

Сотрудники нашего Института сумели получить мутант популярного маркёра EGFP, сочетающий относительно высокую яркость (около 80 % EGFP) и короткое время жизни флуоресценции (порядка 800 пс in vitro и 600 пс в живых клетках).

«Мы прицельно атаковали аминокислотные остатки GFP, вовлечённые, согласно ранее опубликованным квантовохимическим расчётам, в светозависимый транспорт электрона внутри белка. Известно, что время жизни флуоресценции очень чувствительно к различным процессам в возбуждённом состоянии, в том числе, к переносу заряда. Делали десятки мутантов по трём ключевым положениям, изучали комбинации мутаций. И вот – интересный результат.» − рассказывает соавтор работы, Алексей Богданов.

Изображение, полученное при FLIM-микроскопии клеток HeLa, экспрессирующих BrUSLEE в митохондриях, EGFP в цитоплазме и EGFP-T65G в ядре. Цветами показано распределение средних времён жизни флуоресценции.

Потенциал нового белка, названного BrUSLEE (Bright Ultimately Short Lifetime Enhanced Emitter), был успешно апробирован в реальном FLIM-эксперименте c живыми клетками, помеченными тремя зелёными ФБ (см. рисунок). Отметим, что BrUSLEE не только расширяет палитру доступных времён жизни генетически кодируемых флуорофоров, но и открывает новые возможности скоростной FLIM-микроскопии, ведь чем короче время жизни, тем более высокочастотные лазеры можно использовать для сканирования образца.

«Наши результаты важны не только с практической точки зрения (создан новый маркёр, фотостабильный, яркий и очень контрастный относительно всех остальных GFP по времени жизни флуоресценции), они также ставят фундаментальный вопрос: каков предельный квантовый выход для конкретного времени жизни флуоресценции, или наоборот, каково минимальное время жизни при данном квантовом выходе?» − поясняет Анастасия Мамонтова, соавтор статьи.

7 сентября