Лаборатория механизмов генной экспрессии

Научно-исследовательские подразделения

Руководитель: Шпаковский Георгий Вячеславович, д. б. н.
gvs@ibch.ru+7(495)330-65-83

эукариотическая транскрипция, регуляция генной активности, сегментные дупликации, семейства генов POLR2J и PMS2 человека, молекулярная эволюция Homo sapiens, трансгенные растения, цитохром CYP11A1 (P450scc), стероидные гормоны растений, сигнализация между ядром и органеллами, модифицированные олигонуклеотиды

Лаборатория изучает транскрипционный аппарат и механизмы экспрессии генов эукариотических организмов. Два основных проекта, развиваемых в настоящее время, идейно вышли из пионерских работ заведующего лабораторией Георгия Вячеславовича Шпаковского (Gene, 1994, 147: 63-69; Mol. Cell. Biol., 1995, 15: 4702-4710; J. Mol. Biol., 2000, 295: 1119-1127; Биоорган. химия, 2004, 30: 621-625; Генетика 2010, 46: 1254-1257; патент РФ № 2237717 от 10.10.2004; Биоорган. химия, 2010, 36: 241-250).

В рамках первого направления установлено, что у человека, в отличие от подавляющего большинства эукариот, существуют множественные варианты субъединицы hRPB11 (POLR2J) РНК-полимеразы II и что эти различные изоформы кодируются в геноме Homo sapiens четырьмя разными генами, расположенными на хромосоме 7. Показано, что специфические для человека изоформы hRPB11 содержат в своём составе пептидные участки, характерные для белков системы репарации из семейства PMS2, которые в геноме человека также кодируются множественными генами (см.рис.1). В ходе дальнейших исследований мы установили, что молекулярная эволюция генных семейств POLR2J и PMS2, кодирующих базовые, незаменимые компоненты двух важнейших (в том числе и для эволюции) молекулярно-биологических систем клетки, транскрипции и репарации ДНК (MMR, mismatch repair), чётко коррелирует с основными этапами дивергенции высших приматов (Lesser & Great Apes) и привела к появлению у человека новых, уникальных белков, таких как минорные субъединицы РНК-полимеразы II hRPB11ba и hRPB11bb. На изучение роли этих субъединиц РНК-полимеразы II и белковых комплексов на их основе в изменении общей картины экспрессии генома Homo sapiens и направлены наши текущие исследования.

Второе направление связано с получением и изучением трансгенных растений с гибридными стероидогенными системами. В сотрудничестве с белорусскими учёными (Институт генетики и цитологии НАН Беларуси) мы показали, что уникальный только для животных ключевой фермент стероидогенеза CYP11A1 (Р450scc), катализирующий окислительное расщепление боковой цепи холестерина с образованием общего предшественника всех стероидных гормонов – прегненолона, успешно функционирует в трансгенных растениях табака и томата, повышая их устойчивость к фитопатогенам и абиотическим стрессам и ускоряя процессы роста и развития. В настоящий момент наши исследования направлены на изучение детального механизма интеграции митохондриального цитохрома CYP11A1 животных в стероидогенную систему растений и его влияние на физиологию, размножение и иммунитет.

В Лаборатории также проводятся работы по синтезу и исследованию свойств модифицированных олигонуклеотидов, пригодных в качестве праймеров для кПЦР или стабилизирующих в ДНК и РНК неканонические вторичные структуры – эти соединения могут найти применение в изучении регуляторных областей генов, а также для детекции и подавления вирусов человека.

Лаборатория имеет широкий круг партнеров, как в Институте (Лаборатория оксилипинов, Лабораторией инженерии белкаГруппа биоконъюгации), так и за его пределами: Институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева; Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины федерального медико-биологического агентства России; Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М. П. Чумакова РАН; Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора; Сколковский институт науки и технологий; Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск). Совместно с белорусскими партнёрами (Институт генетики и цитологии Национальной Академии наук Беларуси, г. Минск; Белорусский государственный медицинский университет, г. Минск) в рамках совместного проекта РФФИ и БРФФИ изучается механизм интеграции митохондриального цитохрома P450scc (CYP11A1) животных в стероидогенную гормональную систему растений и его влияние на физиологию, размножение и иммунитет (проект № 16-54-00227). Кроме того, Лаборатория сотрудничает с Институтом биологии и технологий в Сакле (iBiTec-S), Страсбургской Высшей Школой Биотехнологии, с профессорами M. Werner и Dr. Ju. Soutourina и доктором M. Vigneron (Франция).

Лаборатория создана в мае 2007 года на базе группы с тем же названием, которая существовала как независимое структурное подразделение ИБХ РАН с декабря 2001 г. В более глубокой исторической ретроспективе лаборатория ведёт свой генезис из подразделений института, которыми руководили в своё время академик Михаил Николаевич Колосов (лаборатория химии продуктов микробного синтеза,  лаборатория химии генов) и профессора Юрий Адольфович Берлин (группа интерлейкинов, лаборатория генной экспрессии) и Владимир Алексеевич Ефимов (лаборатория химии нуклеиновых кислот).

Основным направлением исследований лаборатории является изучение механизмов реализации генетической информации сложных геномов на примере эволюции «молодых», человек-специфичных генов-паралогов POLR2J и hPMS2, кодирующих новые изоформы незаменимых субъединиц аппарата транскрипции и MMR-системы репарации Homo sapiens. В настоящее время основные усилия направлены на установление взаимодействий in vivo и детализацию функций в живой клетке минорных изоформ субъединицы hRPB11 (POLR2J): hRPB11ba, hRPB11bb и hRPB11ca, hRPB11cb, кодируемых соответственно специфичными для человека генами POLR2J2 и POLR2J3. 

Важнейшими предпосылками для данной работы было обнаружение того факта, что у человека, в отличие от подавляющего большинства эукариотов, существуют множественные варианты субъединицы hRPB11 (POLR2J) РНК-полимеразы II и что эти различные изоформы кодируются в геноме Homo sapiens четырьмя разными генами, расположенными на хромосоме 7 (Биоорган. химия, 2004, 30: 621-625). Впервые данные нами в этой публикации названия генов POLR2J1–POLR2J4, их основные характеристики и классификация кодируемых ими изоформ в настоящее время признаны HUGO и всем научным сообществом. Очень важной «функциональной» предпосылкой было обнаружение Г.В. Шпаковским того факта, что из трёх основных типов изоформ субъединицы hRPB11 (POLR2J) человека (мажорная hRPB11a и минорные hRPB11ba и hRPB11bb) только МИНОРНАЯ hRPB11ba способна, пусть и с определёнными трудностями, комплементировать нулевую аллель Drpb11-HIS3 Sacharomyces cerevisiae (BMC Mol. Biol., 2001, 2: 14). Проведённый нами филогенетический анализ семейств генов POLR2J (RPB11) и PMS2 приматов ясно показал, что в эволюции обоих этих генных семейств имеются стадии, специфичные для человека. Определена анатомия всех четырёх POLR2J и всех шестнадцати PMS2-подобных генов человека, содержащих от 4 до 16 экзонов каждый, проводится работы по изучению тканеспецифичности экспрессии важнейших из кодируемых ими мРНК в норме и патологии (при некоторых формах рака). С помощью генетических (дрожжевая двухгибридная система, мутагенез, супрессорный анализ) и биохимических (соосаждения белков из клеточных лизатов, иммунопреципитация) подходов изучаются белки, взаимодействующие с человек-специфичными изоформами субъединицы hRPB11 (POLR2J), hRPB11ba (hRPB11ca) и hRPB11bb (hRPB11cb), в нервной (эмбриональный мозг) и иммунной (клеточная линия Jurkat) тканях человека. Спектр выявленных нами на сегодняшний день  взаимодействий hRPB11ba и hRPB11сa показывает, что эти белки являются минорными изоформами субъединицы РНК-полимеразы II hRPB11 и входят в состав специфичных РНК-полимеразных комплексов, по-новому регулирующих экспрессию целого ряда важнейших генов человека – нами впервые обнаружены некоторые из таких генов, в частности CLN3.  Изучаются также партнёры и функции in vivo впервые обнаруженным нами (среди партнёров минорных изоформ субъединицы hRPB11 РНК-полимеразы II Homo sapiens) белков протеома человека: eIF3mb (Биохимия, 2011, 76: 1195-1200), COMMD4d и DROSHPA (Цитология, 2013, 55: 172-177). В перспективе эти исследования могут привести к разработке новых подходов к диагностике и мониторингу ряда онкологических и неврологических заболеваний человека.

Для изучения механизма интеграции митохондриального цитохрома P450scc (CYP11A1) животных в стероидогенную систему растений и его влияния на физиологию, размножение и иммунитет трансгенных растений томата и табака, экспрессирующих полноразмерную кДНК CYP11A1 быка, ведётся работа по установлению локализации белка CYP11A1 в клетках трансгенных растений, изучаются его функциональные партнёры в протеомах томата (известен и хорошо аннотирован полный геном), табака (нами создана представительная клонотека кДНК трансгенного по CYP11A1 растения) и наперстянки (единственное растение, для которого описана реакция отщепления боковой цепи холестерина с превращением его в прегненолон и предсказаны основные пути биосинтеза и дальнейших превращений прогестерона), анализируются фенотипы и физиология новых поколений (T2 и T3) трансгенных растений томата. Анализируются также партнёры и функции охарактеризованных нами ранее адренонодоксиноподобных ферредоксинов (MFDX1 и MFDX2) табака, томата и наперстянки (Журнал стресс-физиологии и биохимии, 2014, 10: 85-97) – компонентов митохондриальной электронтранспортной цепи растений и возможных партнёров  цитохрома P450scc (CYP11A1) в их протеоме. Изучение трансгенных растений, экспрессирующих гены стероидогенных белков животных, представляется по-настоящему актуальной научной и прикладной задачей. С одной стороны, эти растения являются удобной моделью для изучения новых, ещё по-настоящему не охарактеризованных, путей гормональной сигнализации у растений. С другой стороны, подход, основанный на применении генов белков стероидогенеза животных, может привести к созданию трансгенных растений, обладающих улучшенными с точки зрения сельского хозяйства признаками, а в случае лекарственных растений (наперстянка) – свойствами, важными для производства медицинских препаратов из растительного сырья. Не исключено также и то, что культуры тканей этих трансгенных растений могут найти биотехнологическое применение для осуществления трансформации различных стероидных соединений или их наработки.

Ещё одним направлением исследований лаборатории является синтез и исследование свойств модифицированных олигонуклеотидов, пригодных в качестве праймеров для кПЦР, а также стабилизирующих неканонические вторичные структуры (НКВТ) нуклеиновых кислот для создания сенсоров внутриклеточного pH. Проводится синтез и изучение свойств лигандов и «light-up» проб для стабилизации и детекции НКВТ, а также синтез и исследование противовирусной активности амфипатических производных нуклеозидов и гетероциклических оснований нуклеиновых кислот.

  1. Впервые продемонстрирована  функциональная  взаимозаменяемость in vivo отдельных субъединиц эукариотических РНК-полимераз между эволюционно далёкими организмами и проведено первое систематическое исследование взаимозаменяемости in vivo (в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae) субъединиц ядерных РНК-полимераз I, II и III эволюционно отдалённых эукариотических видов: Schizosaccharomyces pombe и Homo sapiens. (Gene, 1994, 147: 63-69; Mol. Cell. Biol., 1995, 15: 4702-4710; J. Mol. Biol., 2000, 295: 1119-1127; Nucleic Acids Res., 2006, 34: 3615-3624).
  2. Впервые показано функциональное родство малых субъединиц РНК-полимераз архей (надцарство Archaea) и эукариот (Eucarya) и впервые методом межвидовой комплементации клонированы кДНК, кодирующие незаменимый компонент многосубъединичных ферментов транскрипции (общую субъединицу Rpb10
    РНК-полимераз I-III делящихся дрожжей) и белковый фактор Fet5 (Gpn3) Schizosaccharomyces pombe, ставший прототипом нового семейства GTP/ATP–связывающих белков (Gpn1-3), играющих незаменимую роль в транспорте
    РНК-полимеразных комплексов из цитоплазмы в ядро клетки (Биоорган. химия, 1997, 23: 110-117; Биоорган. химия, 1997, 23: 234-237; J. Biol. Chem., 1999, 274: 8421-8427). Эти работы удостоены Главной премии издательства МАИК «Наука» за 1998 г. по группе биологических наук (Вестник РАН, 1999, т. 69, № 11, с. 1054).
  3. Установлен субъединичный состав РНК-полимераз I и III Schizosaccharomyces pombe, клонированы и функционально охарактеризованы кДНК и гены, кодирующие все субъединицы этих ферментов (Current Genet., 1999, 36: 208-214; Биоорган. химия, 1999, 25: 791-796; Молекулярная биология, 2002, 36: 3-26; Nucleic Acids Res., 2006, 34: 3615-3624).
  4. При активном участии лаборатории завершено секвенирование и аннотирование генома делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe: в рамках международного проекта, благодаря полученным в нашей лаборатории клонам pYUK71, pYUL23 и pYUG7, в трёх локусах восстановлена непрерывность нуклеотидной последовательности хромосомы I, cовместно с сотрудниками Сенгеровского Центра (Хинкстон, Великобритания) лаборатория была ответственной за аннотирование компонентов аппаратов транскрипции и трансляции Schizosaccharomyces pombe. Впервые российская лаборатория отмечена как полноправный участник проекта полного секвенирования генома эукариотического организма (Nature, 2002, 415: 871-880). Эта работа отмечена в числе главных научных достижений РАН за 2001 г. по разделу «Науки о жизни.
    Физико-химическая биология» («Отчёт о деятельности РАН в 2001 году  /Важнейшие итоги/», с. 43).
  5. С помощью мутагенеза консервативных аминокислотных остатков определен участок (SF/YGGLLM), наиболее важный для функции in vivo общей субъединицы РНК-полимераз I-III Rpb8. С использованием супрессорного анализа и дрожжевой двухгибридной системы показано взаимодействие Rpb8 с субъединицами Rpa1, Rpb1, Rpc1 и Rpb6. Установлено, что N-концевой домен фактора элонгации TFIIS взаимодействует с компонентом Медиатора Med13 и субъединицей Spt8 комплекса SAGA и важен для стабилизации инициаторного комплекса РНК-полимеразы II на промоторах (в сотрудничестве с учёными из Отдела биохимии и молекулярной генетики Центра Атомной Энергии в Сакле [SBGM], Франция (Prof. P. Thuriaux): Mol. Cell. Biol., 2001, 21: 6056-6065; EMBO J., 2004, 23: 4232-4242). 
  6. Впервые  (совместно с Институтом генетики и молекулярной и клеточной биологии — Иллкирш, Франция, Dr. M. Vigneron) установлено, что одна из субъединиц ядерных РНК-полимераз кодируется целым семейством генов
    (BMC Mol. Biol., 2001, 2: 14). Показано, что один из начальных этапов сборки
    РНК-полимеразы II, образование гетеродимера субъединиц  Rpb11  и  Rpb3, существенно отличается у дрожжей и человека: С-концевой участок субъединицы Rpb11 абсолютно необходим при сборке дрожжевого фермента, но не является критическим для гетеродимеризации hRPB11 и hRPB3. В то же время для сборки РНК-полимеразы II  человека в сравнении со сборкой фермента дрожжей гораздо более существенна целостность a–мотива субъединицы Rpb11, расположенного в середине N-концевой части белка (Nucleic Acids Research, 2005, 33: 3582-3590). Охарактеризованы три изоформы субъединицы hRPB11 (POLR2J) человека и выяснен механизм образования этих изоформ (Биоорган. химия, 2004, 30: 621-625).
  7. Изучена молекулярная эволюция двух специфичных для приматов генных семейств: POLR2J системы транскрипции и PMS2 системы репарации MMR. Установлено, что появление и совершенствование генетической структуры каждого из этих семейств чётко коррелируют с основными этапами биологической эволюции высших приматов. Показано, что гены PMS2 и POLR2J могут рассматриваться в качестве достоверных молекулярных маркеров антропогенеза. Предложена гипотеза о трёхкомпонентной белковой системе, продуцируемой PMS2-подобными генами человека. Сформулированы принципы каскадного усиления на поздних стадиях эволюции приматов, которое могло обеспечить ускоренную молекулярную эволюцию человека (Доклады Академии наук, 2006, 408: 699-703; Генетика, 2010, 46: 1254-1257).
  8. Определён основной спектр белковых партнёров специфичных для человека изоформ субъединицы РНК-полимеразы II hRPB11 (POLR2J) – hRPB11ba, hRPB11сa и hRPB11bb, hRPB11cb. Установлено, что минорные изоформы hRPB11ba и hRPB11ca взаимодействуют сразу с несколькими субъединицами фактора инициации трансляции hEIF3: eIF3a, eIF3i, eIF3ma и eIF3mb, что указывает на существование у Homo sapiens нового типа координации транскрипции с последующими этапами генной экспрессии (процессинг и транспорт мРНК из ядра в цитоплазму к транслирующим полисомам) (Биохимия, 2011, 76: 1195-1200). Среди партнёров изоформ hRPB11bb и hRPB11cb помимо субъединицы РНК-полимеразы II hRPB6 (POLR2F) и кóрового компонента белкового комплекса экзонных сочленений Y14 (RBM8A) обнаружен ряд белков, участвующих в биогенезе микроРНК, в том числе новый, ранее не описанный вариант инициирующей нуклеазы процессинга микроРНК DROSHA, что указывает на существование особых путей сопряжения процессов транскрипции и
    РНК-интерференции в ядрах клеток человека (Цитология, 2013, 55: 172-177).
  9. Впервые продемонстрировано функциональное родство стероидогенных систем животных и растений in vivo: экспрессия кДНК гена CYP11A1, кодирующего ключевой фермент стероидогенеза животных цитохром P450scc повышает иммунитет (устойчивость к фитопатогенам) и ускоряет процессы роста и развития трансгенных растений табака, наперстянки и томата. Показано наличие у этих растений двух андренодоксиноподобных [2Fe-2S]-ферредоксинов митохондриального типа (патент РФ № 2237717 от 10.10.2004; Генетика, 2009, 45: 1217-1224, Биоорган. химия, 2010, 36: 241-250; Журнал стресс-физиологии и биохимии, 2014, 10: 85-97). Результаты этих работ вошли в перечень важнейших научных достижений РАН 2009 г. (Отчётный доклад Президиума РАН «Научные достижения РАН в 2009 году», с. 220).
  10. Разработан синтез олигонуклеотидов, содержащих новые модификации на основе феноксазина, для детекции вируса Кемерово с помощью кПЦР и продемонстрировано, что праймеры, содержащие данные модификации, позволяют увеличить чувствительность метода обнаружения (к.х.н. А.В. Аралов, 2016, under revision in: J. Org. Chem. – статья на стадии доработки после рецензирования). Получен ряд новых производных тиазолового желтого (BO) и показано, что они могут быть использованы в качестве «light-up» проб для G-квадруплексов и дуплексов, содержащих большое количество A/T пар (например, в промоторных областях генов).

Mapping on the human chromosome 7 several genes that are important for primate evolution: four POLR2J paralogues (J1J4) and sixteen PMS2 paralogues (PMS2, ψ0, ψ1ψ14). Different stages (1, 2 and 3) of POLR2J amplification are shown; two of them are specific for Homo sapiens (marked with pink circles). Mya — million years ago.

 

Избранные публикации

  1. Shpakovski D.G., Shematorova E.K., Shpakovski G.V. (2006). Human PMS2 gene family: origin, molecular evolution, and biological implications. Dokl. Biochem. Biophys. 408 (5), 175–179 [+]

    Проведен филогенетический анализ генов семейства PMS2 приматов и уточнена их классификация. Установлено, что в эволюции этого генного семейства имеются стадии, специфичные для человека. Предложена гипотеза о трёхкомпонентной белковой системе, продуцируемой PMS2-подобными генами Homo sapiens.

    ID:61
  2. Proshkina G.M., Shematorova E.K., Proshkin S.A., Zaros C., Thuriaux P., Shpakovski G.V. (2006). Ancient origin, functional conservation and fast evolution of DNA-dependent RNA polymerase III. Nucleic Acids Res. 34 (13), 3615–24 [+]

    Определены основные этапы эволюции ядерных РНК-полимераз I—III эукариот. Показано, что состоящий из трёх РНК-полимераз базовый аппарат транскрипции ядерных организмов возник очень давно и характерен для представителей всех основных царств (таксономических супергрупп) эукариот. В ходе дальнейшей эволюции трёх ферментов транскрипции состоящий из двенадцати субъединиц кор РНК-полимераз оставался консервативным, а субъединицы, специфичные для каждого из трёх типов полимераз, быстро дивергировали. В составе 12-субъединичного кóра РНК-полимеразы III впервые обнаружены три высоко консервативных домена, специфичных для этого фермента транскрипции.

    ID:60
  3. Shpakovski D.G., Shematorova E.K., Shpakovski G.V. (2004). New genes on human chromosome 7: bioinformatic analysis of a gene cluster from the POLR2J family. Bioorg. Khim. 30 (6), 621–5 [+]

    В составе хромосомы 7 человека выявлены четыре независимых гена, кодирующих различные варианты субъединицы hRPB11 РНК-полимеразы II Homo sapiens. Установлено, что при экспрессии четырёх генов POLR2J человека могут синтезироваться, по крайней мере, 14 видов зрелых, кодирующих слегка различные изоформы hRPB11, мРНК, 11 из которых охарактеризованы. Предложена и обоснована схема происхождения множественных генов семейства POLR2J путём трёх увеличивающихся в размерах дупликаций, позволяющая сделать ряд интересных наблюдений о путях эволюции отдельных человеческих генов и о механизмах генерирования белкового разнообразия у высших эукариот.

    ID:59
  4. Wood V., Gwilliam R., Rajandream M.A., Lyne M., Lyne R., (> 100 authors here) , Paulsen I., Potashkin J., Shpakovski G.V., Ussery D., Barrell B.G., Nurse P., Cerrutti L. (2002). The genome sequence of Schizosaccharomyces pombe. Nature 415 (6874), 871–80 [+]

    При активном участии лаборатории завершено секвенирование и аннотация (см. также: Биоорган. химия, 1999, 25: 450–463) генома делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe. В рамках международного проекта по полному секвенированию генома Schizosaccharomyces pombe в трёх локусах восстановлена непрерывность нуклеотидной последовательности хромосомы I: три изолированных в нашей лаборатории клона (pYUK71, pYUL23 и pYUG7) вошли в список клонов, составляющих полную физическую карту генома делящихся дрожжей. Впервые российская лаборатория была отмечена как полноправный участник проекта полного секвенирования генома эукариотического организма.

    ID:58
  5. Shpakovski G.V., Gadal O., Labarre-Mariotte S., Lebedenko E.N., Miklos I., Sakurai H., Proshkin S.A., Van Mullem V., Ishihama A., Thuriaux P. (2000). Functional conservation of RNA polymerase II in fission and budding yeasts. J. Mol. Biol. 295 (5), 1119–27 [+]

    Ранее нами была впервые продемонстрирована функциональная взаимозаменяемость in vivo отдельных субъединиц эукариотических РНК-полимераз между эволюционно далекими организмами (Г. В. Шпаковский и др.: Gene, 1994, 147: 63–69; Mol. Cell. Biol., 1995, 15: 4702–4710) и и установлено функциональное родство малых субъединиц РНК-полимераз архей и эукариот (Биоорган. химия, 1997, 23: 110–117; J. Biol. Chem., 1999, 274: 8421–8427). В данной итоговой работе было проведено первое систематическое исследование взаимозаменяемости in vivo всех двенадцати субъединиц ядерной РНК-полимеразы II между эволюционно далекими видами дрожжей, Schizosaccharomyces pombe и Saccharomyces cerevisiae, а также завершены клонирование и функциональная характеристика всех компонентов РНК-полимеразы II делящихся дрожжей.

    ID:57

Шпаковский Георгий Вячеславович

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 52, комн. 364
  • Тел.: +7(495)330-65-83
  • Эл. почта: gvs@ibch.ru