С дисфункцией ионотропных рецепторов человека связано развитие множества патологических состояний и хронических заболеваний: острые и хронические боли, паралич, мышечная недостаточность, сердечная аритмия и много другое вплоть до когнитивных расстройств. В настоящее время ионотропные рецепторы человека являются мишенями для множества уже существующих лекарств, и продолжают оставаться перспективными объектами для разработки новых препаратов. Однако, для разработки новых препаратов, обладающих высокой избирательностью и пониженным количеством побочных эффектов, необходимо понимание механизмов, лежащих в основе регуляции рецепторов на молекулярном уровне. В качестве объектов исследования выбраны малоизученные ионотропные рецепторы человека: никотиновый ацетилхолиновый рецептор а7-nAChR, играющий важную роль в когнитивных процессах и мышлении, и кислото-чувствительный канал ASIC3, играющий ключевую роль в регулировании работы системы распознавания боли. Имеющиеся на сегодняшний день данные о механизмах регуляции работы и пространственной структуре а7-nAChR и ASIC3 человека чрезвычайно скудны и не позволяют описывать процессы регуляции активации/инактивации этих рецепторов на молекулярном уровне. В ходе выполнения проекта планируется определить пространственные структуры этих рецепторов, в том числе в комплексе с различными лигандами, методами просвечивающей крио-электронной микроскопии (крио-ПЭМ). В течение последних лет произошел большой прогресс в области применения крио-ЭМ для установления пространственной структуры и изучения механизмов функционирования мембранных белков, включая мембранные рецепторы и ионные каналы. В связи с этим особенно стоит отметить, что предлагаемый проект является первой российской работой по определению структуры мембранных рецепторов с использованием этого метода. Лиганды а7-nAChR и ASIC3, которые планируется использовать в проекте, будут отличаться по своему действию (агонисты, частичные агонисты, антагонисты) и по природному происхождению (экзогенные лиганды из природных ядов и растительных экстрактов, эндогенные модуляторы человека и млекопитающих), что позволит изучить разные структурные состояния ионотропных рецепторов. В случае а7-nAChR будут использованы ингибитор из яда змей а-бунгаротоксин, бета-амилоидный пептид Аb1-42 и нейромодуляторы человека семейства Lynx. В случае ASIC3 будут использованы эндогенный лиганд ретикулин и экзогенный алкалоид линдол и его структурные аналоги. Методами электрофизиологии будет изучено влияние этих лигандов на функцию изучаемых рецепторов. Данные об активности, полученные методами электрофизиологии, будут сопоставлены с изменениями пространственной структуры, наблюдаемыми при взаимодействии лиганд-рецептор. Это позволит не только определить сайты взаимодействия лиганд-рецептор, но и описать механизмы, лежащие в основе функционирования изучаемых рецепторов. Помимо структуры полноразмерного рецептора а7-nAChR будет определена структура водорастворимого внеклеточного домена этого рецептора в комплексе с различными лигандами. Сравнение структуры домена в изолированном виде со структурой домена в составе рецептора позволит определить роль трансмембранного домена рецептора и мембранного окружения во взаимодействии с лигандами и регуляции работы а7-nAChR. По гомологии с полученной в ходе выполнения проекта структурой ASIC3 человека методами компьютерного моделирования будет построена модель ASIC3 крысы и проведено сравнение функциональных свойств этих рецепторов, что позволит объяснить отличия в регуляции этих рецепторов различными лигандами, выявленные авторами проекта ранее. Целью этого этапа работы является доказательство эволюционного перехода рецепторов человека на новый уровень регуляции эндогенными лигандами и дополнительное доказательство ограниченной эффективности животных моделей для оценки свойств модуляторов кислото-чувствительных рецепторов. Стоит особо отметить, что для моделирования природного мембранного окружения ионотропных рецепторов и их стабилизации в растворе в ходе выполнения проекта будут разработаны специальные мембраномоделирующие среды на основе мицелл детергентов, липид-белковых нанодисков, амфиполов, и «стабилизированных липид-белковых нанодисков» на основе циклических вариантов аполипопротеинов, ранее не применявшихся для крио-ПЭМ. Это позволит сохранить природную пространственную организацию изучаемых рецепторов и дополнительно изучить роль мембранного окружения в их функционировании. Полученные в ходе выполнения проекта результаты имеют большую научную значимость, а разработанные методики в дальнейшем могут быть использованы при структурно-функциональных исследованиях и других гомологичных рецепторов семейства DEG/ENaC и Cys-loop. Новые данные о лиганд-рецепторных взаимодействиях и механизмах регуляции изучаемых нейрорецепторов найдут применение при рациональном дизайне новых лекарственных препаратов, направленных на лечение хронической боли и коррекцию когнитивных нарушений.