А) За счет модульности можно менять нацеливание CAR-T клеток на разные части антигена, а также на другие ассоциированные с опухолью антигены. Изменяя концентрацию молекул-посредников происходит контроль активности CAR-T клеток. Что позволит преодолеть опасности сопряженные с терапией CAR-T клетками (гиперцитокинемия (цитокиновый шторм), синдром лизиса опухоли).

Б) подтверждение регуляции активности in vitro (цитотоксический тест на клетки с гиперэкспрессией HER2, с двумя видами молекул-посредников 9.29-барназа и G3-барназа.

В,Г) подтверждение работоспособности системы in vivo. В) схема эксперимента на мышах. Вводим молекулы-посредники циклами с повышением дозы, что способствует лучшей персистенции  CAR-T клеток, а также предотвращает гиперактивацию CAR-T. Репрезентативные фотографии мышей на IVIS на 40 день после прививания опухоли, всем мышам вводили CAR-T клетки, 1 группе вводили 9.29-барназу, второй G3-барназу (проксимальная часть HER2), в контрольной группе вводили PBS. Г) Объем опухоли измеренный штангенциркулем. 9.29-барназа сработала лучше в мышах, так как антиген на который нацелен 9.29 дарпин на дистальной части HER2.

Иммунный ответ Т-клеток является основным фактором, определяющим эффективный клиренс SARS-CoV-2. Используя недавно разработанный биоинформационный портал T-CoV (https://t-cov.hse.ru), мы проанализировали особенности презентации вирусных пептидов для вариантов SARS-CoV-2 Omicron, Delta и Wuhan. Сначала мы показали отсутствие существенных различий в презентации пептидов, полученных из SARS-CoV-2, наиболее часто встречающимися аллелями HLA класса I/II и соответствующими гаплотипами HLA. Затем анализ был ограничен набором пептидов, происходящих из S-белков рассматриваемых вариантов SARS-CoV-2. Главным результатом стало разрушительное воздействие мутаций Omicron на пептид PINLVRDLPQGFSAL, который был единственным сильно связывающимся пептидом S-белка для аллеля HLA-DRB1*03:01 и некоторых соответствующих гаплотипов. В частности, мы предсказали резкое снижение аффинности связывания HLA-DRB1*03:01 и этого пептида как из-за мутаций Omicron BA.1 (делеция N211, замена L212I и вставка EPE 212-214), так и из-за мутаций Omicron BA.2 (замена V213G). Биоинформатический прогноз был экспериментально подтвержден методом ИФА с использованием соответствующих тиоредоксин-связанных пептидов и рекомбинантных молекул HLA-DR. Еще одним результатом стало значительное уменьшение количества сильно связывающихся пептидов S-белка для аллеля HLA-B*07:02 HLA класса I (как для вариантов Omicron, так и Delta). В целом, на большинство аллелей и гаплотипов HLA мутации существенно не повлияли, что свидетельствует о сохранении эффективного Т-клеточного иммунитета против вариантов Omicron и Delta. Наконец, мы внесли вариант Omicron в портал T-CoV и добавили в него функцию анализа на уровне гаплотипов.

Были исследованы изменения профилей сродства связывания S-белка с HLA между штаммом Wuhan и двумя доминантными вариантами, штаммами Delta и Omicron, среди тайваньской, британской и российской популяций.
Для штамма Delta сильное связывание измененных пептидов с аллелями HLA снижается во всех трех популяциях и почти исчезает в тайваньской популяции. Для штамма Omicron сильные связи в основном сохраняются для обоих классов HLA и в тайваньской и британской популяциях, с небольшим снижением HLA класса II в тайваньской (1,4%), в то время как в российской популяции сохраняется относительно высокая доля сильных связей для обоих классов HLA.

Продемонстрирована схожая картина развития цитокинового шторма при модельной криотравме спинного мозга, оперативном вмешательстве при удалении интрамедуллярных опухолей человека и ARDS. Показан терапевтический потенциал антицитокиновых/хемокиновых моноклональных антител и низкомолекулярных блокаторов ("second medical use") при данных системных нарушениях гомеостаза.

АТР-зависимые Lon-протеазы, ключевые участники системы контроля качества клеточного протеома, преимущественно представлены ферментами подсемейств LonА и LonВ. В бактериях отдела фирмикут обнаружена группа «гибридных» ферментов (LonBA), у которых АТРазный (А) и протеазный (Р) компоненты подобны А- и Р-компонентам разных базовых подсемейств. Рентгеноструктурным анализом на примере LonBA из Bacillus subtilis (BsLonBA) установлено, что деградационная камера Р-домена ферментов нового подсемейства включает уникальную β-структурированную бочкообразную вставку. Предсказана структура полноразмерной BsLonBA, которая основана на совмещении 3D-структуры Р-домена и модельной структуры А-компонента, построенной с помощью программы AlphaFold2. Выдвинуто предположение о возможных особенностях функционирования LonBA-протеаз.

Рецептор, подобный рецептору инсулина (IRR), кодируемый геном insrr, является третьим членом семейства рецептора инсулина, включающего также рецептор инсулина (IR) и рецептор инсулино-подобного фактора роста (IGF-1R). IRR – сенсор внеклеточный щелочной среды. У мышей insrr экспрессируется только в небольших популяциях клеток в специфических тканях, содержащих экстракорпоральные жидкости, pH которых может сильно варьироваться как в кислую, так и в щелочную область. Ранее было установлено, что IRR регулирует вывод избытка бикарбоната в почках. Однако физиологическая роль рецептора IRR во время эмбриогенеза Xenopus laevis была неизвестна, хотя ген insrr имеет сильную экспрессию у зародышей лягушки. Мы исследовали функцию IRR во время развития шпорцевой лягушки Xenopus laevis посредством морфолино-опосредованного селективного нокдауна insrr. Было продемонстрировано, что снижение экспрессии insrr приводит к задержке развития эмбрионов, которая может быть восстановлена инкубацией эмбрионов в щелочной среде с рН 8.5. Секвенирование транскриптома эмбрионов на стадии средней нейрулы показало, что подавление insrr вызвает общий сдвиг экспрессии в сторону генов, специфично экспрессирующихся до и в начале гаструляции. В то же время обработка щелочью частично восстанавливала экспрессию нейруло-специфических генов.

Также для выявления роли рецептора IRR в эмбриогенезе мы провели эксперименты по оценке развития преимплантационных эмбрионов мышей дикого типа и мышей, нокаутных по гену insrr, с использованием МЕА-теста (mouse embryo assay). Оценку развития осуществляли с помощью индекса выхода бластоцист – процента образования бластоцист от общего количества извлеченных зигот. Выход бластоцист у нокаутных животных оказался значительно ниже, чем у животных дикого типа, 6.7% от общего количества извлеченных клеток у нокаутных животных и 43.8% у животных дикого типа. Отличалось и количество извлеченных зигот у мышей дикого типа и нокаутных по гену insrr. В среднем, количество извлеченных зигот из одной самки составило 18.9 зигот для мышей дикого типа, и 11.8 зигот для нокаутных по insrr мышей.

Полученные нами результаты указывают на важную роль рецепторной тирозинкиназы IRR в эмбриональном развитии позвоночных.

Пациенты с БП оказались на 100% CMV-позитивными, тогда как среди здоровых доноров того же возраста и молодых доноров процент CMV-инфицированных был 76 и 73 соответственно. Доля эффекторных Т-клеток памяти, реэкспрессирующих CD45RA, CD57+CD56- и CD57+CD56+ Т-клеток были значительно снижены у пациентов с БП по сравнению с CMV-серопозитивными здоровыми индивидуумами того же возраста. Соотношение CD57+CD56- Т-клеток у пациентов с БП было сходным с таковым у CMV-серопозитивных молодых здоровых доноров. Таким образом, для БП характерно снижение «иммуноcтарения» Т-клеток периферической крови даже на фоне инфекции CMV. Обнаружено увеличение транскрипционной активности стресс индуцированных генов HSPA1A/B и HSPA6 в периферических мононуклеарах (PBMC) пациентов с БП. Базальный уровень содержания белка р62 повышен в PBMC пациентов с БП.

Вакцинация защищает от тяжелого течения COVID-19 посредством образования антител, специфически распознающих рецептор-связывающий домен (RBD) спайк-протеина SARS-CoV-2, но она также оказывает влияние на врожденную иммунную систему. В данной работе показали, что индукция RBD-специфических антител сопряжена с увеличением доли зрелых клеток среди нейтрофилов, готовых выйтив кровоток в ответ на попадающие в респираторный тракт мышей частицы размером 100 нм, покрытые RBD. Кроме того, у мышей с RBD-специфическими антителами нейтрофилы были менее подвержены формированию внеклеточных сетей при неспецифической активации. Полученные данные позволяют предположить, что вакцинация приводит к активации зрелых нейтрофилов в ответ на патоген, что препятствует развитию неконтролируемого воспаления.

Разработан новый одноступенчатый колоночный метод выделения внеклеточных везикул (EV) из биологических жидкостей, дающий в 2-3 раза более высокий выход по сравнению с ультрацентрифугированием и хроматографией. Метод основан на удерживании EV в порах ассиметричного фильтра, отмывки EV и последующей элюции экзосом из перевёрнутой колонки. Продемонстрировано, что концентрация выделенных EV пропорциона концентрации белка в везикулах, что позволяет определять колочество EV простым способом.

Разработан принципиально новый подход доставки лекарств, основанный не на EPR-эффекте, а на быстром разрушении в кровотоке наноконтейнеров, нагруженных химиопрепаратом. Метод включает экстравазацию не наночастиц,  а лекарства из сосуда в интерстиций, и далее в паренхиму опухоли. Эффективность подхода, продемонстрированная in vivo на модели ранних метастазов меланомы в легких, на порядок превосходит эффективность традиционной  химиотерапии.

Разработана генетически-кодируемая система для фотодинамической терапии на основе биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET). Данная система содержит так называемый «внутренний» источник света (люциферазу NanoLuc) и фотосенсибилизатор (фототоксичный белок miniSOG). NanoLuc-miniSOG представляют собой BRET-пару, в которой окисленная форма люциферазного субстрата является донором энергии для возбуждения miniSOG, который, в свою очередь, генерирует АФК. Будучи генетически кодируемой, данная конструкция может быть доставлена к опухолям, расположенным практически на неограниченной глубине. Используя псевдотипированные лентивирусы, специфичные к опухоль-ассоциированному антигену, была продемонстрирована адресная доставка созданной генетической конструкции непосредственно в опухолевые клетки in vivo и проведена ФДТ без внешнего источника света. При этом коэффициент ингибирования роста опухоли (TGI) составил более 67%. Таким образом, проведенное исследование является доказательством возможности проведения ФДТ глубинных новообразований без внешнего источника света.

Флуоресценция - один из самых чувствительных методов детекции в живых системах. Чувствительность этого метода в значительной степени зависит от яркости флуорофоров. В данной работе получены флуоресцентные красители с высокой яркостью путем объединения нескольких флуорофоров на основе силоксановой матрицы. Были синтезированы BODIPY-силоксановые конъюгаты, содержащие от двух до восьми BODIPY флуорофоров. Исследованы фотофизические свойства этих соединений и факторы, влияющие на яркость и время жизни флуоресценции. Как оказалось, время жизни флуоресценции полученных соединений зависит от внешнего окружения, что позволяет использовать их в качестве индикаторов полярности, вязкости и температуры среды.

Нейротрофины и их рецепторы играют центральную роль в жизни нейронов,  однако механизмы, лежащие в основе передачи сигнала внутрь клетки, до сих пор плохо изучены. Согласно одной из основных гипотез, в результате связывания с лигандом димер нейротрофинового рецептора Trk претерпевает ряд конформационных перестроек, которые приводят к запуску сигнальных каскадов внутри клетки. В результате совместной работы с коллегами из Института биомедицины в Валенсии были обнаружили два состояния трансмембранного домена, которые отвечают за активное и неактивное состояние рецептора. Кроме того, было впервые показано, что протяженный внеклеточный примембранный регион является неупорядоченным. Это позволило выдвинуть новую гипотезу, согласно которой лиганд связывается не только с внеклеточным глобулярным доменом, но и с нуепорядоченным примембранным регионом, что приводит к его стабилизации и передаче сигнала внутрь клетки.

Флуороген-активирущие белки (ФАБ) - перспективные агенты для  флуоресцентного окрашивания в живых системах. Для создания на основе ФАБ эффективных инструментов молекулярной биолоигии, необходимо оптимизировать как ФАБ, так и их лиганды, с целью уменьшения размера метки, увеличения яркости, квантового выхода и цветового разнообразия. В результате совместной работы нескольких лабораторий ИБХ РАН были исследованы пространственная структура и подвижность ФАБ FAST и nanoFAST с различными лигандами. Было получено структурное объяснение специфичности nanoFAST к определенному кругу лигандов, что в дальнейшем поможет расширить набор флуорогенов этого белка. На основании структурных данных, полученных для белка FAST были созданы мутантные варианты ФАБ с повышенной яркостью в комплексе с группой флуорогенов - аналогов флуорофора белка GFP. 

Сибирские биолюминесцентные земляные черви Henlea sp. (Henlea petushkovi и Henlea rodionovae) обитают на частных огородах Красноярского края и Иркутской области. Их уникальная биолюминесцентная система требует наличия пяти компонентов для испускания голубого (464 нм) света: люциферин, люцифераза, кислород воздуха, ионы кальция и низкомолекулярный компонент (“активатор”), который многократно увеличивает яркость свечения in vitro. Природные активаторы были доступны лишь в микрограммовых количествах. Несмотря на это, в результате совместной работы Красноярского института биофизики и ИБХ РАН удалось установить структуры двух активаторов биолюминесценции. Ими оказались деазафлавин ActH (ранее известный как “кофактор F0”) и его новое ранее неизвестное в природе сульфопроизводное ActS. Для получения ActH был предложен и реализован новый путь синтеза в четыре стадии. Синтетический ActH усиливает биолюминесценцию в 33 раза и участвует в реакции с константой Михаэлиса Km=220 нМ. Активатор, предположительно, испускает (либо переизлучает) энергию, которая образуется в процессе окисления люциферина. Так же активатор, возможно, участвует в окислительно-восстановительной реакции, принимая протоны и электроны, которые высвобождаются в процессе окисления люциферина.

1. Petushkov VN et al. (2022) Deazaflavin cofactor boosts earthworms Henlea bioluminescence. Org. Biomol Chemistry (submitted) (IF=3.89, Qwos1, Qsjr=1)

S-белок SARS-CoV-2 осуществляет слияние мембран и проникновение вируса в клетку-мишень. В оболочке вируса его заякоривает трансмембранный домен (ТМД), состоящий из трех альфа-спиралей. Несмотря на то, что ряд моделей S-белка включает ТМД, точной его конфигурации внимания практически не уделяли. Между тем, понимание механизма слияния мембран требует реалистичных моделей этого домена, но надежных инструментов для предсказания 3D структуры спиральных ТМ гомотримеров пока нет. Мы разработали комплексный подход, объединивший разнообразные вычислительные инструменты, в первую очередь созданные в нашей лаборатории программы для картирования молекулярного гидрофобного потенциала (МГП) - PLATINUM и PREDDIMER. После такого картирования и анализа первичной структуры было выполнено моделирование на шаблоне и уточнение модели методом молекулярной динамики в явно заданном бислое ПОФХ для корректировки “динамических МГП портретов”. Полученная модель имеет плотную упаковку (практически без зон свободного объема в тримере) и обладает уникальной стабильностью (в том числе при пальмитоилировании в соответствии с экспериментальными данными) по сравнению с рядом альтернативных структур, включая недавно опубликованную ЯМР-структуру тримерного пептида с близкой аминокислотной последовательностью. Наша модель соответствует известным принципам упаковки трансмембранных спиралей (например, имеет консервативные остатки на интерфейсе) и создана с учетом липидного окружения. В дальнейшем модель ТМД будет необходима для изучения процесса слияния мембран, опосредованного S-белком SARS-CoV-2.

Метиловый эфир O-пропилоксим-N-пропоксибактериопурпуринимида является гидрофобным фотосенсибилизатором (ФС) ближнего инфракрасного диапазона с подтвержденной противоопухолевой активностью in vivo.

Мы показали, что конъюгация метилового эфира О-пропилоксим-N-пропоксибактериопурпуринимида с аргинином или лизином по α-аминогруппе (i) значительно улучшает растворимость и стабильность этих производных в эмульсии Cremophore EL с сохранением всех спектральных и фотохимических характеристик; (ii) способствует многократному усилению внутриклеточного накопления и фотоцитотоксичности модифицированных ФС в отношении раковых клеток; (iii) сохраняет активность ФС в отношении грамположительных бактерий S. Aureus в планктонной форме, а для производного с аргинином – и в отношении бактерий S. aureus в биопленках.

Исследования проведены совместно со специалистами Института Тонкой Химической Технологии им. М. В. Ломоносова МИРЭА-Российского технологического университета (П. В. Островерхов, М.А. Грин).

Исследованы свойства нового флуоресцентного хемосенсора, на основе 1,8-нафталимида и стирилпиридина (NI-SP).

Показано, что хемосенсор:

• применим для  селективной высокочувствительной визуализации и ратиометрического определения концентрации ионов Hg2+ в живых клетках;
• эффективно накапливается в клетках различного гистогенеза;
• обеспечивает количественный анализ внутриклеточной концентрации ионов Hg2+ в диапазоне 0,04–1,65 мкМ.

Исследования проведены совместно со специалистами Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института элементоорганических соединений им. А. Н. Несмеянова Российской академии наук (ИНЭОС РАН)  (П.А. Панченко, А.С. Полякова, М.А. Устимова, Ю.В. Федоров, О.А. Федорова).

Методом крио-ЭМ с разрешением 2.5 Å установлена структура полноразмерного тримерного S-белка дельта-варианта вируса SARS-CoV-2 в комплексе с Fab фрагментом нейтрализующего антитела REGN10987. Отдельные участки комплексов рецептор-связывающий домен (RBD) / Fab были локально уточнены до разрешения 3.2-3.4 Å. Два RBD находились в «нижнем/закрытом» состоянии, а третий RBD наблюдался в открытой («верхней») конформации. Fab взаимодействовал с RBD в обеих конформациях и занимал часть рецептор-связывающего мотива, блокируя взаимодействие RBD с рецептором мишенью ACE2. Анализ вариабельности крио-ЭМ структур выявил высокую подвижность областей RBD/Fab. Расчеты молекулярной динамики и свободной энергии связывания позволили объяснить различия, наблюдаемые при взаимодействии REGN10987 с дельта и омикрон вариантами S-белка. Результаты исследования дают структурное представление о роли мутаций, наблюдаемых в RBD штамма омикрон, в уклонении от антитела REGN10987. Полученные данные важны для разработки новых терапевтических антител. (Shenkarev, et al, Commun Biol, 2022, Q1, IF 6.5, revision)

Канал TRPA1 – важная мишень для разработки новых анальгетиков и противовоспалительных препаратов. TRPA1 ответственен за острые болевые ощущения и вовлечен в процесс перехода от острой боли к хронической. В настоящее время известно лишь несколько природных соединений, ингибирующих TRPA1. Одним из таких соединений является токсин Phα1β (PnTx3-6) из яда бразильского странствующего паука (Phoneutria nigriventer), принадлежащий семейству нейротоксинов 09 (Tx3-6). На животных моделях Phα1β уменьшает как острую, так и хроническую боль. Для структурно-функциональных исследований Phα1β была разработана рекомбинантная система продукции в бактериальных клетках. Получен 15N-меченый вариант токсина. Рекомбинантный Phα1β был протестирован на рецепторах TRPA1 в ооцитах Xenopus laevis. Вопреки ожиданиям, инкубация ооцитов с 100 нМ Phα1β в течение 20 с приводила к обратимому увеличению тока на ~50% (p<0.05). Методом ЯМР спектроскопии определена пространственная структура Phα1β – первая структура токсина из семейства Tx3-6. Токсин содержит шесть дисульфидных связей, три из которых образуют цистеиновый узел (Cys-knot). (Mironov, et al, Toxins, 2022, Q1, IF 5.1, submitted)

S-Ацилирование — распространенная посттрансляционная модификация мембранных белков, играющая важную роль в нормальной и патологической биохимии, включая репликацию вирусов в клетках. Эта реакция катализируется 23 ферментами семейства DHHC-ацилтрансфераз (имеющими каталитический Asp-His-His-Cys мотив) в два этапа: 1) аутоацилирование фермента с участием ацил-КоА; 2) трансацилирование белка-субстрата. В этом цикле из двух работ мы провели расчеты молекулярной динамики фермента hDHHC20 перед аутоацилированием и уже после него — в комплексах с ацил-КоА разной длины: C12—C20 (поскольку разные ферменты семейства предпочитают разные «хвосты»). Мы показали, что: 1) вне зависимости от длины цепи, ее кончик всегда упирается в «потолок» связывающей полости фермента; 2) только для C16 длина и геометрия комплекса оказываются оптимальными для эффективного аутоацилирования, что согласуется с данными биохимии; 3) мутации hDHHC20 вблизи «потолка» могут как увеличить, так и уменьшить предпочтительную длину ацильной цепи. Выдвинутая гипотеза геометрического и физико-химического соответствия поможет предсказать селективность еще не изученных членов семейства DHHC, а также спроектировать мутанты с предпочтением к ацильным субстратам нужной длины.

Белки семейства Ly6/uPAR — важные нейро- и иммуномодуляторы, напоминающие по структуре ладонь с тремя пальцами (β-тяжами). Часто они «заякорены» в мембране клеток с помощью ковалентно пришитого к C-концу гликозилфосфатидилинозитола (GPI), что ограничивает их подвижность и ориентацию при взаимодействии с мишенями (различными мембранными белками, в первую очередь — ацетилхолиновыми рецепторами никотинового типа). Экспериментально описать, как ведут себя такие заякоренные белки, вряд ли возможно, поэтому мы изучили этот вопрос с помощью моделирования молекулярной динамики (МД) шести модуляторов в не связанном с мишенями состоянии: Lynx1, Lynx2, Lypd6, Lypd6B, Ly6H и CD59, заданных с учетом всех особенностей молекул GPI, липидной мембраны и гликозилирования. Длина траекторий МД для каждого белка составляла 2–3 мкс, что позволило достаточно подробно изучить положение и ориентацию молекул в координатах «высоты» над поверхностью мембраны, «крена» и «тангажа» — проще говоря, пронаблюдать, как нам «машут» трехпальцевые «ладони». Собранная статистика говорит, что большинство белков — Lynx1, Lynx2, Lypd6B, Ly6H — взаимодействует с мембраной единым образом: теми же частями, что и связывается с рецептором; остальные два связываются каждый по-своему, оставляя взаимодействующую с мишенью часть свободной. Оказалось, что «заякоривание» за молекулу GPI не создает пред-формированной ориентации модуляторов для взаимодействия с рецептором.

Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы является одним из самых смертоносных видов рака во всем мире. В большинстве случаев протоковой аденокарциномы поджелудочной железы наблюдается повышенная экспрессия гена SOX9. Мы предположили, что повышенная экспрессия критического фактора развития поджелудочной железы SOX9 необходима для формирования и поддержания опухолевых фенотипов в клетках рака поджелудочной железы. Было изучено шесть клеточных линий рака поджелудочной железы, которые характеризуются разными уровням дифференцировки и обладают специфическими онкогенными мутациями. Функциональная роль фактора SOX9 в клетках рака поджелудочной железы была исследована с помощью подавления его экспрессии методом РНК интерференции. Было обнаружено, что подавление экспрессии SOX9 в клеточных линиях приводит к специфическим для каждой клеточной линии изменениям в уровнях экспрессии эпителиальных и мезенхимальных белковых маркеров (CDH1, CDH3, KRT7, KRT18, KRT19, ZO-1, MUC1, CDH2, VIM, SNAI2 и др.). Кроме того, снижение экспрессии SOX9 оказывает специфическое влияние на экспрессию основных генов развития поджелудочной железы (HNF1A, GATA-4, GATA-6 и FOXA2). Наибольшее влияние даунрегуляция SOX9 оказала на уровни экспрессии белковых регуляторов клеточной пролиферации (CCND3, CDKN1A, CDKN1B и BIRC5). В трех из четырех исследованных клеточных линий подавление экспрессии SOX9 приводило к значительному снижению пролиферативной активности и активации проапоптотических каспаз в клетках. Полученные результаты свидетельствуют о том, что транскрипционный фактор SOX9 выполняет свои многочисленные функции плейотропного регулятора дифференцировки и потенциального промотора опухолевого роста клеточно-специфическим образом в клетках рака поджелудочной железы. 

Mycobacterium tuberculosis персистирует в фагоцитах разного типа. Нейтрофилы не обладают эффективными бактерицидными механизмами против микобактерий, поэтому микобактерии, фагоцитированные нейтрофилами, оказываются недоступными для эффективного врожденного иммунного ответа.

• Мы исследовали профили экспрессии генов M. tuberculosis, которые прошли через фагоцитоз макрофагами или нейтрофилами хозяина in vivo, и параметры инфекции у генетически чувствительных к туберкулезу мышей, зараженных такими микобактериями
• Пребывание внутри нейтрофилов модулирует транскриптом микобактерий: снижается экспрессия генов общего метаболизма, некоторых факторов вирулентности и компонентов синтеза клеточной стенки.
• Такие изменения могут вести к более быстрому переходу части микобактерий в состояние метаболического покоя, что потенциально увеличивает срок выживания популяции в организме хозяина

Эмбрионы многих организмов способны сохранять инвариантность своей структуры, не зависимо от  размера - т.н. явление эмбрионального скейлинга (от анг. scale – масштаб). Например, эмбрионы морского ежа или лягушки, развившиеся из отдельных клеток, изолированных вскоре после начала дробления яйца, регулируют свою структуру так, что выглядят как уменьшенные копии нормальных. Этот феномен, известный уже более 100 лет, является наиболее ярким проявлением фундаментального, но все еще плохо изученного, свойства живых организмов использовать на систематической основе неравновесную  самоорганизацию для своего структурирования. Мы впервые предсказали и математически доказали существование специальных генов-скейлеров, играющих роль размерных сенсоров благодаря зависимости их экспрессии от размеров эмбрионов. Также мы разработали метод прицельного поиска скейлеров и описали на примере одного из них, гена матриксной металлопротеиназы 3 (Mmp3), не известный ранее механизм размер- зависимой регуляции эмбрионального паттернинга у шпорцевой лягушки.

Сотрудники Группы геномного анализа сигнальных систем клетки приняли лидирующее участие в создании онлайн-платформы, позволяющей провести быстрый качественный и количественный анализ активности более 50,000 молекулярных путей человека по транскриптомным данным с удобной навигацией и визуализацией данных.  

Создан онлайн-ресурс OncoboxPD (Oncobox pathway databank), доступный бесплатно и без регистрации по ссылке https://open.oncobox.com, содержащий коллекцию из 51 672 единообразно обработанных молекулярных путей человека. Суперпозиция всех путей образовала интерактомный граф белок-белковых взаимодействий и метаболических реакций, содержащий 361 654 взаимодействия и 64 095 молекулярных участников. Пути единообразно классифицированы по биологическим процессам, а каждый узел пути алгоритмически функционально аннотирован по специфической роли активатора/репрессора. Это позволяет в режиме онлайн рассчитывать подкрепленные статистическим анализом уровни активации путей с помощью встроенных биоинформатических инструментов, используя пользовательские профили экспрессии РНК/белков. Каждый путь может быть визуализирован в виде статического или динамического графа, где вершины - это молекулы, участвующие в пути, а ребра - взаимодействия или реакции между ними. Дифференциально экспрессированные узлы в пути визуализированы в двухцветном режиме с возможностью выбора пользователем цветовой шкалы (Рисунок 1). Для каждого сравнения OncoboxPD также генерирует итоговый отчетный график, обобщающий самые высоко и слабо активированные пути.

Платформа не требует специальной биоинформатической подготовки и может быть интересна всем исследователям, анализирующим экспрессию генов человека.

Работа проведена в сотрудничестве с МФТИ, Сеченовским университетом, компанией Онкобокс (Россия), Университетом Циндао (КНР), компанией Омиксвей (США), а также Европейской организацией исследования и лечения рака (EORTC).

Рисунок 1. Визуализация молекулярного пути TRAF с помощью платформы OncoboxPD. Узлы соответствуют отдельным компонентам пути или их комплексам. Цвет каждого узла пути отражает логарифм среднего значения отношения экспрессии к норме для всех компонентов узла в соответствии с цветовой шкалой. Красные и зеленые стрелки обозначают ингибирующие и активирующие взаимодействия, соответственно. Овалы обозначают генные продукты, восьмиугольники - метаболиты, шестиугольники - комплексы, остальные узлы показаны прямоугольниками. Жирная рамка обозначает значения, выходящие за пределы шкалы. В этом примере профиль экспрессии генов РНК-секвенирования образца папиллярного рака щитовидной железы сравнивался с шестью здоровыми образцами щитовидной железы. A) Статический граф путей. B) Проекция динамического интерактивного графа путей.

В 2022 году список ключевых признаков рака был пополнен 4 новыми признаками, одним из которых является не-мутационное эпигенетическое репрограммирование. Один из важных аспектов опухолевого патогенеза – нарушение работы регуляторов транскрипции генов, в связи с чем изучение эпигенетического ландшафта опухолевых клеток является актуальной задачей.

Нами был разработан высокопроизводительный подход, позволяющий получать полногеномные библиотеки регуляторных элементов генома (энхансеры/промоторы), обогащенные специфичными для исследуемых типов клеток элементами . Предложенный подход основан на сочетании иммунопреципитации хроматина с множественным параллельным репортерным анализом с использованием лентивирусной системы (ChIP-lentiMPRA). Данный подход может быть использован для создания систем специфической экспрессии терапевтических генов в заданных типах клеток с целью повышения эффективности и безопасности противоопухолевой генной терапии.

Также нами был детально изучен эпигенетический ландшафт гена FAP – кодирующего высокоспецифичный поверхностный маркер отдельных типов раковых и стромальных клеток (опухоль-ассоциированных фибробластов) солидных опухолей. Мы идентифицировали и подробно описали дистальные энхансеры, которые обеспечивают специфичность экспрессии гена FAP. Эпигенетический анализ найденных энхансеров позволил предположить существование петли положительной обратной связи между экспрессией FAP и активацией транскрипционного фактора STAT3. Такая взаимосвязь FAP и STAT3 может быть частью более обширной регуляторной петли, поддерживающей воспаление в опухоли и ее прогрессию. Выявленное взаимодействие  FAP и STAT3 может быть перспективной мишенью для противоопухолевой терапии.

Кардиотоксины (CTX), присутствующие в ядах кобр, нарушают функционирование сердечно-сосудистой системы (ССС). Структурно СТХ содержат консервативные гидрофобные петли, характеризующиеся высокой гомологией аминокислотных последовательностей в бета-цепях и вариациями, влияющими на их биологическую активность, в участках изгибов. Известны два типа кардиотоксинов (S и P), различающиеся по структуре центральной петли. Исследование механизмов действия токсинов CTX-1 (S-тип) и CTX-2 (P-тип) кобры Naja oxiana на ССС с использованием препаратов папиллярных мышц (ПМ) и колец аорты (КО) показало, что оба токсина оказывали дозо-зависимое действие, проявляющиеся в контрактуре ПМ и сокращении КО. СТХ-2 Р-типа нарушал функции ПМ и КО сильнее, чем СТХ-1 S-типа. Различие между эффектами СТХ S- и Р-типа также наблюдалось на изолированном сердце крысы. Установлено, что действие СТХ на ССС не связано с выбросом эндогенного адреналина, а обусловлено, в основном, нарушением транспортных систем, ответственных за приток Са2+. Впервые показано участие реверсивного обмена Na+/Ca2+ в действии СТХ на аорту крыс. Следовательно, действие антидотов должно быть направлено на нормализацию транспорта ионов кальция.

Продолжено исследование биологической активности олигоаргининов - открытого нами ранее нового класса ингибиторов никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР) - и установлено, что окта-олигоаргинин R8, нетоксичный линейный пептид, взаимодействующий с высоким сродством с α9α10 подтипом нАХР, на мышиной модели химиотерапии в тестах механической  аллодинии, механической чувствительности и температурной гиперчувствительности уменьшает эффекты индуцированной оксалиплатином нейропатии не менее эффективно, чем рассматривающийся в качестве возможного лекарственного средства анальгетического действия α-конотоксин RgIA (более сложный и дорогой в синтезе 13-ти членный пептид с двумя дисульфидными связями).

Яды животных представляют собой сложную смесь различных биологических молекул, многие из которых, в частности, токсины, имеют потенциал в качестве лекарственных препаратов. Большое структурное разнообразие пептидных и белковых токсинов делает актуальным разработку метода их быстрого структурного анализа. Совместно с ИОФ РАН мы разработали экспресс-метод, основанный на рамановской спектроскопии в сочетании с методом главных компонент, позволяющий классифицировать эти природные токсины в соответствии с их структурными особенностями, используя микрограммовые количества вещества в сухом виде. Данный подход был опробован на большой серии трехпетельных токсинов змей, конотоксинов и линейном пептиде и показал возможность не только выявлять принадлежность к этим большим группам соединений, но и различать конфигурацию дисульфидных связей в одном токсине.

Изучена интернализация синтезированных флуоресцентных производных ингибитора транспортёра обратного захвата дофамина GBR-12909 в дофаминергическиенейроны мышей как в первичной культуре, так и на переживающих срезах среднего мозга. GBR-BODIPY, в отличие от GBR-ATTO, специфически проникает в дофаминергические  и некоторые норадренергические и серотонергические нейроны по клатринзависимому механизму, но не проникает в не-моноаминергические нейроны. GBR-12909 не токсичен для клеток. Эти результаты открывают перспективу селективной визуализации дофаминергических нейронов в смешанной популяции клеток. 

Сконструирован и получен гибридный биспецифичный белок HRH-DR5-B на основе DR5-селективного мутантного варианта TRAIL с антиангиогенным синтетическим пептидом HRHTKQRHTALH. С помощь методов белковой инженерии проведена оптимизация экспрессии, повышена стабильность белка и его содержание в растворимой клеточной фракции. Полученный фьюжн-белок SRH-DR5-B с высокой аффинностью связывается с рецепторами VEGFR2 и DR5 и имеет повышенную цитотоксическую активность в мультиклеточных 3D сфероидах из различных опухолевых клеток, что позволяет рассматривать его в качестве перспективного терапевтического препарата с двойной антиангиогенной и противоопухолевой активностью.

Интерес к микробным родопсинам связан с перспективами использования их в оптогенетике с целью регуляции активности нейронов, в том числе для терапии различных заболеваний. Бактериальный родопсин Exiguobacterium sibiricum (ESR) отличается от бактериородопсина, наиболее изученного ретинального белка, наличием остатка лизина в положении 96, которое соответствует внутрибелковому донору протонов для основания Шиффа. С помощью мутагенеза по этому положению показано, что остатки Asp или Glu могут эффективно выполнять функцию донора в молекуле в ESR, но кинетики фотоцикла и переноса зарядов в этих мутантных вариантах существенно отличаются от таковых в бактериородопсине, что указывает на альтернативный механизм репротонирования основания Шиффа в ESR.

Метастатическая меланома является высокозлокачественной опухолью, клетки которой секретируют внеклеточные везикулы, усиливающие злокачественность опухоли и способствующие трансформации нормальных клеток. Нами показано, что клетки меланомы при закислении внешней среды до 6.5 секретируют более проонкогенные везикулы, чем клетки, культивируемые при рН 7.4: с повышенной экспрессией проонкогенной микроРНК mi221, фактора стволовости CD133, про-миграционного фактора SNAI1, а также про-онкогенного рецептора α7-nAChR. Инкубация с везикулами стимулировала рост и миграцию как метастатических клеток меланомы и нормальных кератиноцитов. Также везикулы из закисленных меланом изменяли морфологию кератиноцитов на более «стволовую», что подтверждалось повышением экспрессии факторов стволовости KLF4 и CD133. В целом, наши данные означают, что везикулы метастатической меланомы играют важную роль в трансформации нормальных кератиноцитов.

Прогрессия опухолей зачастую сопровождается закислением окружения, а протон-активируемые ионные каналы (ASIC) – сенсоры протонов, обеспечивают адаптацию раковых клеток к закислению. Мы изучили эффекты и молекулярные мишени мамбалгина-2 из яда черной мамбы Dendroaspis polylepis, - ингибитора каналов ASIC1a, в клетках аденокарциномы легкого. Мамбалгин-2 ингибирует рост и миграцию клеток аденокарциномы легкого, которые экспрессируют ASIC1a, но не действует на нормальные легочные фибробласты, в которых экспрессия ASIC1a отсутствует. Мамбалгин-2 в клетках аденокарциномы легкого вызывает арест клеточного цикла в G2/M фазе и апоптоз. Показано, что антипролиферативная и антимиграционная активность мамбалгина-2 в клетках A549 обусловлена взаимодействием с опухолеспецифичными гетероканалами ASIC1a/α-ENaC/γ-ENaC. Выявлено, что мамбалгин-2 ингибирует каналы ASIC1a/α-ENaC/γ-ENaC с большей эффективностью, чем каналы ASIC1a. Показано, что повышенная экспрессия ASIC1 и γ-ENaC коррелирует с худшим прогнозом выживания пациентов с аденокарциномой легкого. Таким образом, таргетирование опухолеспецифичного гетеротримера ASIC1a/α-ENaC/γ-ENaC может стать перспективной стратегией онкотерапии.

Белки Ly6/uPAR представляют собой белки с трехпетельной пространственной структурой, стабилизированной дисульфидами. Эти белки выполняют различные важные регуляторные функции, взаимодействуя с рецепторами, регулирующими работу нервной системы и клеточный гомеостаз и обнаружены у разных организмов – от саламандр до человека. Ранее наши коллеги из НИИ Цитологии РАН (Санкт-Петербург) показали наличие трехпетельных белков в целомической жидкости морской звезды Asterias rubens. Мы проанализировали геномы морской звезды A. rubens и обнаружили гены еще 5 трехпетельных белков. Один из них, названный Lystar5, экспрессируется в клетках целомической жидкости A. rubens и имеет последовательность, гомологичную нейромодулятору из мозга человека Lynx2. Анализ структуры Lystar5 с помощью ЯМР-спектроскопии подтвердил гомологию пространственной структуры Lystar5 и Lynx2. Как и Lynx2, Lystar5 ингибирует ток через никотиновые рецепторы ацетилхолина α4β2-nAChR. Кроме того, инкубация с Lystar5 снижала экспрессию ацетилхолинэстеразы и субъединиц α4 и α7 nAChR в нейронах гиппокампа. Таким образом, нами впервые обнаружен модулятор никотиновых рецепторов ацетилхолина в морских звездах.

На основе агитоксина 2 (AgTx2), пептидного блокатора калиевых потенциал-зависимых Kv1 каналов, методами пептидного синтеза и белковой инженерии получены новые флуоресцентные лиганды - Atto488-AgTx2 и GFP-AgTx2.

Показано, что введение метки по N-концу AgTx2 обеспечивает лиганду способность флуоресцировать, повышает его селективность  к Kv1.3 каналу и сохраняет высокую аффинность взаимодействия вне зависимости от типа метки – органического красителя или флуоресцирующего белка.

Лиганды Atto488-AgTx2 и GFP-AgTx2 могут быть использованы для имиджинга Kv1.3 каналов в клетках и тканях, а также в качестве компонента аналитической клеточной системы для поиска и изучения блокаторов этого канала, представляющего собой мишень при лечении аутоиммунных заболеваний.

Работа выполнена совместно с сотрудниками кафедры биоинженерии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова. Работа поддержана грантом РНФ 22-14-00406.

Харпино-подобные антимикробные пептиды растений обладают разнообразными биологическими активностями: антимикробной, трипсин-ингибирующей, рибосом-инактивирующей. Эволюционно оптимизированная структура имеет вид «спираль-поворот-спираль», при этом, две α-спирали стабилизированы двумя S-S-связями. Структурные детерминанты активности этих пептидов изучены недостаточно подробно, поэтому возможности по укорочению пептида оценивали по измеряемой антифунгальной активности. Сперва путём твердофазного пептидного синтеза были получены две укороченные формы пептида по внешнюю и по внутреннюю дисульфидные связи соответственно, которые теряли антифунгальная активность значительно по сравнению с нативным пептидом. Далее путём гетерологической экспрессии в E. coli были получены аналог с заменой Trp20Ala в области β-поворота и аналог, укороченный только  по неструктурированному С-концевому участку, который также были значительно менее активны в тестах. Таким образом, можно заключить, что все удаляемые/изменяемые тут фрагменты  пептида EcAMP1 вносят вклад в его антимикробную активность.

Нейробластома человека SH-SY5Y является инструментом, используемым для изучения нейропатофизиологических процессов. Мы исследовали каналы ASIC и TRP (TRPV1 и TRPA1), присутствующие в интактной и дифференцированной нейробластоме SH-SY5Y, чтобы оценить возможность их изучения в этой модели. Низкий уровень экспрессии ASIC1a и ASIC2 был обнаружен в интактных клетках. Обработка 10 мкМ ретиноевой кислоты в течение 6 дней приводила к дифференцировке нейронов, сопровождавшейся заметным увеличением экспрессии ASIC1a, при минимальной экспрессии ASIC2. Подробная кинетическая и фармакологическая характеристика регистрируемых токов позволила предположить, что гомомерная изоформа ASIC1a является доминирующей среди кислото-активируемых каналов после применения ретиноевой кислоты, и наоборот при дифференциации экспрессия TRPV1 и TRPA1 становилась незначительной. Нейробластома SH-SY5Y после обработки ретиноевой кислотой  может служить модельной системой для изучения эффектов различных лигандов при разработке новых нейропротекторных и обезболивающих препаратов.

Глутаматергическая передача вызывает выход K+ через постсинаптические NMDA рецепторы, повышение которого деполяризует пресинаптическую терминаль, усиливая высвобождение глутамата, но влияет ли это также на захват глутамата в локальной астроглии, остаётся вопросом. Было показано, что фармакологическое блокирование или условный нокаут постсинаптических NMDA рецепторов подавляют увеличение амплитуды и продолжительности токов астроцитарных глутаматных транспортеров, тогда как блокирование астроцитарных K+ каналов предотвращает только увеличение продолжительности таких токов. Точечный анкейджинг глутамата показывает, что для уменьшения амплитуды и продолжительности токов астроцитарных глутаматных транспортеров требуется деполяризация астроцитов, а не повышение внеклеточного K+ как такового. Биофизическое моделирование подтверждает, что кратковременное локальное повышение внеклеточного К+ может ингибировать локальный захват глутамата в тонких астроцитарных отростках. Оптический имиджинг, выполненный с использованием глутаматного сенсора, показал постсинаптический выход K+, связанный с усилением внесинаптической глутаматной сигнализацией. Таким образом, повторяющаяся глутаматергическая передача запускает обратную связь, в которой постсинаптический выход K+ может временно способствовать пресинаптическому высвобождению при одновременном снижении локального захвата глутамата.

Считается, что диета с высоким содержанием жиров негативно влияет на тело, мозг и познание. Тем не менее, жиры и жирные кислоты необходимы для питания и построения тканей мозга, а астроциты играют центральную роль в липолизе и метаболизме жирных кислот.

В данной работе показано как диета с высоким содержанием жиров влияет на метаболизм, морфологию и физиологию астроцитов. Было показано, что один месяц диеты с высоким содержанием жиров для молодых животных приводит к увеличению содержания липидов и относительного количества восстановленных цитохромов в астроцитах по сравнению с контрольной группой. Подобного увеличения в нейронах при этом не происходит. Данные метаболические изменения в астроцитах приводили к увеличению их территориальных доменов из за разрастания веточек и листочков. Морфологические перестроения сопровождались и увеличением экспрессии эзрина. Изменения в экспрессии не наблюдались в глиальном фибриллярном кислом белке, глутаматных транспортерах 1 типа и глутаминсинтетазе.

Данные морфологические перестроения привели к более эффективному захвата глутамата, что в свою очередь привело к увеличению долговременной потенциации и к изменению поведения животых, сидевших на диете.

Таким образом, потребление пищевых жиров не всегда вредно и может оказывать благотворное влияние в зависимости от биологического контекста.

В условиях низкого содержания кислорода поддержка доставки кислорода в мозг осуществляется за счёт увеличения мозгового кровотока. Однако механизмы, лежащие в основе расширения мозговой сосудистой сети, вызванного гипоксией, до конца не изучены. Было показано, что астроциты накапливают нитрит и, в ответ на гипоксию, вырабатывают оксид азота посредством митохондриального восстановления нитрита молибденсодержащим ферментом сульфитоксидазой. Эти данные свидетельствуют о том, что астроциты могут модулировать мозговой кровоток в соответствии с оксигенацией тканей головного мозга посредством митохондриальной выработки оксида азота.

Настоящая работа выполнена в рамках сотрудничества с британскими учёными, предварительная публикация которой выпущена в базе bioRxiv.

Известно, что физиологическое старение (в отличие от нейродегенерации) не связано с серьёзными изменениями в количестве нейронов и их морфологии. На количество астроцитов в различных областях мозга старость так же не влияет, в то время как морфометрические исследования противоречивы, ведь сообщается как об увеличении, так и об уменьшении размеров астроцитов с возрастом. Все эти результаты, однако, показаны на грызунах. Возрастные же изменения человеческих астроцитов практически не исследованы.

В данной работе были исследованы кортикальные астроциты и нейроны ткани доступа полученной в результате удаления опухолей головного мозга. Пациенты были разделены на две группы: молодые(от 22 до 50 лет) и пожилые (от 51 до 72 года). Было показано, что количество восстановленных цитохромов в астроцитах уменьшается с возрастом. Подобной тенденции в нейронах замечено не было. Общее количество белков снижалось с возрастом в астроцитах и увеличивалось в нейронах. У пожилых пациентов, по сравнению с молодыми, было замечено уменьшение длины веточек и неразрешенных отростков астроцитов, что приводило к уменьшению астроцитарного домена. Уменьшение астроцитарного домена с возрастом коррелировало с уменьшением числа связанных через щелевые контакты клеток. Так же с возрастом повышалось входное сопротивление астроцитов. Старение сопровождалось повышением экспрессии глиального фибриллярного кислого белка и снижением экспрессии эзрина. При этом возрастных изменений в возбудимости и спонтанных постсинаптических тормозных токах в нейронах не наблюдалось.

Старение связано с изменением морфологии астроцитов и работе митохондрий, уменьшением разветвленности астроцитарного синцития и увеличением сопротивления астроцитов, что может быть следствием уменьшения размеров клеток. В нейронах таких изменений замечено не было. Таким образом именно астроциты, а не нейроны должны являться мишенью для предотвращения или замедления механизма старения.

Предварительная публикация настоящей работы выпущена в базе bioRxiv.

Изоформа потенциал-чувствительных калиевых каналов Kv1.6 широко представлена в нервной системе млекопитающих. При этом о функциональном значении Kv1.6 известно мало. Причина кроется в отсутствии в распоряжении исследователей высокоаффинных и селективных лигандов этой изоформы. С помощью скаффолд-инженерии α-гарпининов нам удалось получить искусственный пептид Tk-hefu-11, который отличается высокой аффинностью (IC50 = 10 нМ) и селективностью в отношении Kv1.6. Надеемся, что созданный нами лиганд калиевых каналов Kv1.6 найдет применение в качестве исследовательского инструмента в нейробиологии.

Дифтерийный токсин (ДТ) - главный фактор вирулентности бактерий Corynebacterium diphtheriae и C. ulcerans. Детекция ДТ в бактериальных культурах имеет первостепенное значение в лабораторной диагностики дифтерии. Мониторинг уровня продукции ДТ важен при изучении вирулентности бактериальных штаммов. Существующие методы лабораторной диагностики дифтерии позволяют выявить возбудителя - токсигенных C. diphtheriae – только на пятые сутки после отбора пробы. Для качественной и количественной оценки продукции ДТ мы разработали иммунохимический тест («сэндвич»-ИФА), основанный на моноклональных антителах (МКАт). Была подобрана пара МКАт, которая обеспечивала детекцию ДТ с пределом чувствительности менее 1 нг/мл. Разработанный тест был испытан в ходе анализа 218 образцов культуральных супернатантов от различных штаммов высоко-, низкопродуцирующих и нетоксигенных коринебактерий. Показано, что результаты ИФА коррелировали с результатами ПЦР на наличие гена tox и теста Элека – стандартного лабораторного теста на продукцию ДТ. Диагностическая чувствительность ИФА составила более 99%, специфичность – 100%. Показано, что штаммы C. ulcerans, в среднем, продуцируют в 10 раз меньше токсина, чем штаммы C. diphtheriae. Таким образом, показано, что разработанный иммунохимический тест позволяет с высокой точностью детектировать ДТ в культуральных супернатантах коринебактерий. Используемые в ИФА МКАт далее планируется использовать для дальнейшей разработки иммунохроматографического экспресс-теста, позволяющего снизить трудоемкость и стоимость лабораторной диагностики дифтерийной инфекции.

Таблица 1. Результаты качественного определения ДТ в культурах коринебактерий методом «сэндвич-ИФА». ЛО—ложноотрицательные; ЛП—ложноположительные; ИО—истинно отрицательные; ИП—истинно положительные. Перед проведением ИФА все штаммы были охарактеризованы следующим образом: наличие гена токсина определялось методом ПЦР; в отствутсвии гена токсина продукция ДТ в большинстве случаев не определялась и штамм считался отрицательным (*). В присутствии гена tox продукция ДТ подтверждалась тестом Элека, и в этом случае штамм считался положительным (**). Если продукция токсина в тесте Элека не подтверждалась, то штамм считался отрицательным (*).

Впервые выделен бактериофаг Ayka, инфицирующей патогены растений рода Curtobacterium, показана его эффективность в качестве средства биоконтроля бактериозов бобовых культур. Проведён детальный анализ генома, адсорбционного аппарата, показано, что фаг является представителем нового семейства вирусов, родственного семейству Salasmaviridae.

Разработаны алгоритмы и методы создания новых персонализированных средств защиты растений от вирусов на основе интеграции РНК интерференции и NGS-анализа нативных вирусных популяций. Проведен анализ методом секвенирования нового поколения РНК листовых и клубневых проб картофеля (RNA-seq) из различных областей РФ с последующим биоинформатическим поиском консенсусных последовательностей Y вируса картофеля (как наиболее опасного патогена) и сборкой de novo геномов YВК. Показано, что разнообразие вариантов YВК в Астраханской области (с жарким климатом) выше, чем в Московской области. Предсказана и синтезирована двуцепочечная РНК против консервативного участка в составе геномов выявленных штаммов/изолятов вируса для создания универсального РНК препарата против различных вариантов YВК. 

RAPID ALKALINIZATION FACTOR (RALF) — это цистеин-богатые пептиды, которые регулируют множество физиологических процессов в растениях. Это семейство пептидов значительно расширилось в ходе эволюции наземных растений, поэтому для изучения функций RALF  пептидов используют простые модельные системы. Количественный протеомный анализ выявил согласованное снижение металлопротеаз М6 и некоторых мембранных белков участвующих в реакции на стресс у нокаутных линий. Мы обнаружили, что нокаут генов PpRALF2 и PpRALF3 приводит к повышению устойчивости к бактериальным и грибным фитопатогенам - Pectobacterium carotovorum и Fusarium solani. Сравнительный транскриптомный анализ PpRALF3 KO и растений дикого типа при заражении Fusarium solani показал четкое различие в регуляции генов, принадлежащих к фенилпропаноидному пути и связанных с модификацией клеточной стенки и биогенезом между этими генотипами. Таким образом, наше исследование проливает свет на функцию ранее не охарактеризованного пептида PpRALF3 и дает представление о функциях пептидов RALF в реакции растений на стресс.

C помощью технологии CRISPR/Cas9 впервые в России отредактирован геном мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) — главной зерновой культуры нашей страны. Целью геномного редактирования являлось получение новых нуклеотидных изменений в консервативной промоторной области гена яровизации VRN-A1, играющего важную роль в регуляции колошения у сортов яровой и озимой пшеницы. Наличие мутаций в этой области изменяет функциональную активность гена и ускоряет время колошения. Для получения растений пшеницы с отредактированным геномом проводили биоинформатический подбор различных гидовых РНК, in vitro тестирование их способности создавать разрывы ДНК в целевых участках, конструирование экспрессионных векторов и  биобаллистическую доставку системы CRISPR/Cas9 в клетки пшеницы. В результате, получены растения пшеницы содержащие различные нуклеотидные изменения в целевой последовательности промотора рецессивного гена vrn-А1. Показана возможность получения семенного поколения пшеницы, свободного от «инструментов» геномного редактирования, а также выявлено изменение срока колошения у гомозиготной линии содержащей 8-ми нуклеотидную делецию в промоторной области VRN-А1 в сравнении с исходным сортом. Работа выполнена в сотрудничестве c ВНИИСБ РАН

Геном растительной клетки, построенной в основном из полисахаридов (ПС), богат углевод-специфичными белками (это гликозидазы, гликозил-трансферазы, белки-переносчики и лектины); однако лишь некоторые из них идентифицированы на уровне белка, и совсем малая часть этих белков функционально охарактеризована. До нашего исследования не было удобного инструмента для широкого поиска (по принципу скрининга) растительных белков. Совместно с коллегами по гранту РНФ, из Казани и Сыктывкара, мы разработали микрочип, в состав которого вошли 180 ПС, покрывающих наиболее распространенные структурные типы ПС растительной клеточной стенки, хорошо охарактеризованные. Статья на эту тему (ссылка дана внизу) посвящена конструированию эррея, описанию (классификации) взятых для этого ПС, демонстрации высокого качества полученного инструмента исследования, и наконец, описанию первых примеров его применения для гликобиологических исследований. В частности, охарактеризовано несколько известных растительных лектинов (среди них исторически первый известный лектин рицин), в результате чего была показана ранее не описанная их способность связывать растительные ПС.

Растительная пища обеспечивает правильное функционирование человеческой микробиоты, которая в свою очередь определяет репертуар периферических антител; поэтому мы изучили взаимодействие  антител нормальных доноров с ПС разработанного эреея, и нашли существенные уровни  IgG и IgM ко многим пектинам и гемицеллюлозам. Ранее эти антитела не были описаны; физиологическую оценку этому явлению еще предстоит дать.

Совместный проект РНФ (2020-2023 гг) с Казанским институтом биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН и с Институтом физиологии Коми НЦ УрО РАН, г. Сыктывкар.

Галектины проявляют невысокую избирательность по отношению к гликанам-лигандам in vitro и высокую специфичность in vivo. Механизмы этого явления остаются малопонятными. Одним из них может быть высокая кооперативность взаимодействия галектина с гликанами, взаимная подстройка их в процессе межклеточного взаимодействия. В подстройке по-видимому, охватывает несколько субсайтов белка, так что детальная структурная характеристика полноразмерного gal-5 является существенной для понимания механизма; заметим, что gal-5 относится к наименее изученным галектинам. В данной статье (ссылка внизу) сообщается первая кристаллографическая информация о контактах gal-5 с гликаном и динамике взаимодействия. Каноническими лигандами галектинов являются дисахариды лактоза и лактозамин, однако для большинства галектинов находят заметно более аффинные три- и тетрасахариды. Используя сконструированный нами ранее гликановый эррей, мы выяснили, что для gal-5 высокоаффинными являются антигены группы крови В, особенно тетрасахарид B(type 2). Его со-кристаллизация с полноразмерным белком позволила выявить контактные сайты компонентов, а MD симулирование понять, что первичное связывание приводит к перестройке гликан-узнающего участка (сравнительно с безлигандным белком); и что индуцированный тетрасахаридом сдвиг равновесия между гибкими и упорядоченными конформерами белка открывает новые его контакты с гликаном. По-видимому, кооперативность последовательных стадий подстройки белка и гликана обеспечивается микроокружением гликана in vivo.

Фосфолипазы А2 — жизненно важные ферменты, способные селективно отщеплять жирную кислоту из положения sn-2 фосфолипида. Для ФЛА2 из яда пчелы были описаны способы связывания фермента с мембраной. В дополнение к уже известным из литературы способам связывания нами обнаружены два новых, ранее неизвестных. Стабильные положения белка на мембране были показаны независимо с помощью методов атомно-силовой микроскопии и молекулярной динамики.  Предполагается, что обнаруженные способы связывания реализуются в процессе высвобождения нерастворимых в воде продуктов реакции в окружающую среду, а также при перемещении белка вдоль поверхности мембраны.

Оптические переключатели — молекулы, способные изменять конформацию под действием света. В липидных мембранах оптические переключатели используются как для управления свойствами бислоя, так и для контроля поведения мембранных белков. Мы разработали новые оптические переключатели для мембран на основе азоинданов. Эти переключатели, в отличие от других известных, в цис-форме имеют не один стабильный конформер, а четыре, что способно усилить возмущающее действие на упаковку липидного бислоя и увеличить эффективность управления его свойствами.

Международным коллективом с участием ученых из Группы синтетической биологии и Группы молекулярных меток для оптической наноскопии ИБХ РАН был охарактеризован ландшафт приспособленности зеленых флуоресцентных белков (GFP). Этого удалось достигнуть сочетанием экспериментального подхода (направленной эволюции GFP и получением десятков тысяч мутантов) и разработки на основе этих данных алгоритма предсказания функциональных вариантов. Данный алгоритм позволил получить светящийся вариант GFP, несущий 48 мутаций по сравнению с природными белками. Чтобы оценить, может ли разработанный алгоритм быть эффективно использован для других белков, авторы провели эксперименты с тремя GFP, которые произошли от эволюционно далеких видов — cgreGFP, amacGFP и ppluGFP2. Они обнаружили, что алгоритм на основе машинного обучения лучше предсказывает функциональные варианты cgreGFP, чем amacGFP и ppluGFP2. Анализ ландшафта приспособленности показал, что гомологи различались по количеству вносимых мутаций, при которых белки сохраняли активность: в среднем от трех до четырех мутаций для cgreGFP и avGFP и от семи до восьми мутаций в случае amacGFP и ppluGFP2. Белки также отличались общей устойчивостью: ppluGFP2 был стабилен при воздействии высоких температур, тогда как cgreGFP был более чувствителен к изменениям температуры. Повышенная мутационная чувствительность avGFP и cgreGFP, по-видимому, была обусловлена ​​негативным эпистазом, при котором негативный эффект комбинации мутаций превышает эффект мутаций по отдельности.

В целом, опубликованные результаты показывают, что для работы алгоритма для создания функциональных вариантов белка и предсказания функции белка необходимы только данные об одиночных мутациях и их влиянии друг на друга (эпистаза низкого порядка). Это способствует развитию области белковой инженерии, поскольку это открытие предполагает, что предварительное знание об эпистазе высокого порядка — взаимодействия между большими наборами мутаций — не требуется для дизайна белков.

Сотрудниками ИБХ РАН совместно с коллегами из Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова (ТИБОХ РАН) была описана новая группа депсипептидных антибиотиков. Новые соединения с антибактериальной активностью были обнаружены в культуральной жидкости штамма Streptomyces sp. KMM 9044 из коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ РАН, выращенном на среде с морской водой. Структура обнаруженных соединений была установлена с использованием методов ядерного магнитного резонанса и хромато-масс-спектрометрии высокого разрешения, а также подтверждена серией химических трансформаций. Было показано, что данное семейство соединений представляет собой хлорированные циклические депсигептапептиды, содержащие редкие и ранее не встречавшиеся в макроциклической структуре депсипептидов аминокислоты 3-гидрокси-4-хлорвалин и 4-ацетокси-5-метилпролин, а также глицериновую кислоту. Интересное свойство этих антибиотиков – сильное селективное ингибирование нескольких грам-позитивных бактерий: Micrococcus sp. (МИК 6 нг/мл, штамм KMM 1467), Arthrobacter sp. (МИК 20 нг/мл, штамм ATCC 21022) и Mycobacterium smegmatis (МИК 300 нг/мл, штамм MC2 155). Результаты опубликованы в журнале Organic Letters.

Ген стильбенсинтазы VlvSTS, выделенный из гибрида винограда Vitis labrusca x Vitis vinifera L. Изабелла, использован для трансформации растений табака. Впервые показано, что этот ген обеспечивал растениям устойчивость к фитопатогенным бактериям Erwinia carotovora subsp. carotovora B15. Трансгенные растения были частично устойчивы к серой гнили, вызываемой грибами B. cinerea, но не к фузариозу. В наиболее устойчивых к фитопатогенам растениях показан синтез фитоалексина транс-резвератрола в количестве 150-170 мкг/г сырой массы. Экспрессия гена VlvSTS в трансгенных растениях повлияла на синтез антоцианов в венчиках цветков, размеры пыльцевых зерен, их фертильность и на дальнейшее развитие семян.

(1) Разработаны методы формирования плазмонных (Si-Au) и магнитных  (Si-Fe) наночастиц, основанные на использовании абляции индуцированной фемтосекундными лазерными импульсами.

(2) Показана эффективность гипертермического воздействия на клетки в результате плазмонного и магнитного эффектов под воздействием электромагнитного облучения.

(3) С использованием разработанной в лаборатории уникальной научной установки «Система зондово-оптической 3D корреляционной микроскопии», продемонстрирована возможность реконструкции 3D распределения наночастиц в опухолевых клетках и визуализации разрушений, вызванных локальным нагревом наночастиц.

Совместно с Московским государственным медико-стоматологическим университетом им. А.И. Евдокимова и ФНИЦ «Кристаллография и фотоника».

Определены причины хронических воспалительных процессов, развивающихся в слизистой оболочке полости рта и в тканях костного ложа, связанные с установкой в полости рта сертифицированных медицинских изделий. Показано, что существенная роль принадлежит наночастицам, продуктам деградации имплантов. Комплексом физических методов (оптика, рентген, МС, …), определены параметры и состав наночастиц. Выявлено взаимодействие иммунокомпетентных клеток с ранее считавшимися "биоинертными" медицинскими материалами.

Разработан низкотемпературный метод получения оптически прозрачных, нанофибриллярных, нанопористых гидрогелей из природных полисахаридов. Получены структурно-организованные изделия из хитозана со сложной морфологией поверхности, различных размеров методами литья в формы и экструзионной 3D-печати. Показана биосовместимость изделий, полученных данным способом in vitro и in vivo.

Работа проводилась совместно с ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» и Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

В Лаборатории биомедицинских материалов  (рук. Марквичева Е.А.) были разработаны и охарактеризованы  биодеградируемые матриксы, в частности  2D ( пленки ) и 3D криоструктуры (макропористые гидрогели) на основе графт-сополимеров хитозана с  L,L-/L,D-олиголактидами. Методом конфокальной микроскопии было показано,  что гидрогели представляли собой макропористые криоструктуры с системой сообщающихся пор (средний размер пор 150 мкм). Биодеградация этих матриксов зависела от типа олиголактида. Кроме того, были изучены в модели  in vitro адгезия и распластывание клеток, а также их рост и пролиферация/дифференцировка.  Локализация мышиных фибробластов  (L929) и мезенхимальных стромальных клеток (МСК), выделенных из жировой ткани человека, в гидрогелях были  исследованы методом конфокальной лазерной микроскопии, а  количественная оценка роста и пролиферации клеток была дана с помощью МТТ-теста после их культивирования в течение 10-14 дней. Остеогенная дифференцировка МСК была изучена методом ПЦР (qRT-PCR). Максимальные уровни экспрессии остеогенных маркеров  (ALPL, Runx2, SPP1) были выявлены  для клеток на пленках из сополимера  хитозана с L,D-олиголактидом. Таким образом, было установлено, что дифференцировка клеток зависела от композиции полимерного матрикса. Оба типа матриксов перспективны для использования в тканевой инженерии.

[Tatiana V. Tolstova, Maria G. Drozdova, Tatiana N. Popyrina , Diana K. Matveeva , Tatiana S. Demina, Tatiana A. Akopova, Elena R. Andreeva, Elena Markvicheva, Biodegradable films and macroporous hydrogels based on chitosan-g-oligolactides for tissue engineering: fabrication and in vitro evaluation,  J Biomaterials Science, 2022 (in press)]

Продемонстрирована эффективность синтетических гликоконъюгатов на основе фрагментов капсульного полисахарида (КПС) A. baumannii в качестве иммуногенов, т.е. прототипов вакцин. Оптимальным был гликоконъюгат, синтезированный помощью квадратной кислоты и состоящий из двух мономерных звеньев КПС и белка-носителя (рис.1). Иммунизация индуцировала высокое содержание IgG,  длительную иммунологическую памятью (рис.2). Показана  опсонизирующая способность иммунных сывороток на протяжении всей жизни подопытных животных (рис.3). Иммунизация приводила к сбалансированной продукции про-/ анти- воспалительных лимфокинов (рис.4). Заражение иммунизированных животных A. baumannii K9 показало высокую защитную способность. Все иммунизированные животные выживали после введения летальной дозы бактерий (рис.5). В крови и селезенке иммунизированных животных бактерии не обнаруживались уже через 30 ч после заражения летальной дозой (рис.6).

В рамках многолетнего изучения структуры и функции природных гуминовых веществ впервые с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) с негативным контрастированием уранилацетатом проведен анализ морфологии электрофоретических фракций А, В и C+D, полученных из гуминовых кислот (ГК) чернозема методом сочетания препаративной эксклюзивной хроматографии с аналитическим электрофорезом в ПАГ (рис.1). Впервые обнаружено, что гуминовые вещества образуют принципиально различные морфологические формы в зависимости от индекса ароматичности (IA) - соотношения ароматических и алифатических компонентов по результатам 13С-ЯМР. Фракция А (IA=0.7), обогащенная алифатическими компонентами (насыщенными и ненасыщенными жирными кислотами, алкенами, алканами, аминокислотами и сахарами) формирует в растворе мицеллоподобные прозрачные капли (цифра 5 на рис.2), в то время как фракция C+D (IA=3.2), состоящая преимущественно из ароматических компонентов, формирует как одиночные длинные цепочечные фибриллы (6), так и их пучки (7). Исходный препарат ГК (IA=1.9), а также фракция В (IA=1.4), образуют в растворе более мелкие морфологические структуры: точечные частицы (1), кольцевые частицы (2), сфероиды (3) и червеподобные частицы (4). Анализ ТЭМ изображений фракционированных ГК позволил впервые продемонстрировать, что морфологические формы типа сфероидов, червеподобных частиц, длинных цепочечных фибрилл и их пучков сформированы в виде супрамолекулярных ассоциатов мелких кольцевых частиц, которые в свою очередь представляют собой ассоциаты нескольких более мелких точечных частиц.По результатам исследования подготовлена и отправлена статья «Significant morphological differences of soil humic acids electrophoretic fractions: transmission electron microscopy verification» для опубликования в международном журнале Geoderma (IF-7.422, Q1)

Опубликована новая версия базы данных VDJdb, содержащей сведения об известных последовательностях Т-клеточных рецепторов с определенной антигенной специфичностью. Собраны и проанализированы данные по последовательностям Т-клеточных рецепторов, распознающих различные эпитопы SARS-CoV-2, полученные ведущими мировыми лабораториями, специализирующимися на анализе антиген-специфичных Т-клеточных ответов. Показана согласованность и воспроизводимость данных из разных источников. Данные включают  более 3000 последовательностей α- и β-цепей Т-клеточных рецепторов и десятки эпитопов, представленных HLA класса I и II, которые могут найти применение в крупномасштабных клинических и экспериментальных исследованиях, посвященных COVID-19. База данных доступна по адресу https://vdjdb.cdr3.net.

Анкилозирующий спондилоартрит (АС) – ревматологическое заболевание аутоиммунной природы. В основе развития аутоиммунных патологий лежит реализация иммунного ответа организма против антигенов собственных клеток. Идентификация антигенов, распознаваемых рецепторами Т-лимфоцитов, в особенности аутоантигенов, на данный момент представляет технологически весьма сложную задачу. К настоящему времени удалось охарактеризовать антигенную специфичность буквально лишь нескольких таких Т-клеточных рецепторов (TCR). При этом получаемые сведения совершенно необходимы как для понимания общих правил распознавания Т-клетками специфических антигенов, так и для понимания механизма развития аутоиммунного заболевания и разработки терапевтических подходов подобных состояний.

В лаборатории Сравнительной и функциональной геномики отдела Геномики адаптивного иммунитета ИБХ удалось установить полную последовательность для TCR, ассоциированного с анкилозирующим спондилоартритом. Совместно с коллегами из университетов Стэнфорда, Оксфорда и университета Дж. Вашингтона в Сент-Луисе, удалось расширить группу АС-ассоциированных TCR с известной последовательностью и определить узнаваемые ими Т-клеточные эпитопы (антигены). С помощью рентгеноструктурного анализа нескольких комплексов ТCR с соответствующими комплексами пептид-МНС удалось определить ключевые аминокислотные остатки, определяющие узнавание антигенных пептидов. Были найдены распознаваемые этими TCR антигенные пептиды из белков организма человека и ряда кишечных бактерий.

Полученные результаты поддерживают гипотезу кросс-реактивности Т-клеток при узнавании микробных антигенов и антигенов клеток собственного организма как механизма запуска аутоиммунной реакции при АС.  Знание структуры антигенов, распознаваемых АС-ассоциированными TCR открывает широкие возможности для изучения механизма участия этой группы Т-клеток в патогенезе заболевания и развития принципиально новых подходов к терапии анкилозирующего спондилита.

Выполнено глубокое профилирование и сравнительный анализ репертуаров Т-лимфоцитов периферической крови и синовиальной жидкости когорты пациентов со спондилоартритами (СпА). Выявлено несколько СпА-ассоциированных клональных групп CD8+ лимфоцитов со сходными структурами Т-клеточных рецепторов и повышенной частотой встречаемости в очаге воспаления. Показано, что отдельные клональные группы характерны для репертуаров пациентов с рисковыми аллелями HLA-B*27 или HLA-B*38. Совместно с коллегами из Стэнфодского и Оксфордского университетов [Yang X, Garner LI, Zvyagin IV et al., Nature. 2022] определен набор эпитопов для СпА-ассоциированных Т-клеток и восстановлена структура тройного комплекса TCRpHLA-B*27:05.

В данной работе мы описываем обновление базы данных VDJdb проведенное в период 2019-2022гг и связанное с пандемией вируса SARS-CoV-2. Это обновление включает в себя последовательности альфа- и бета-цепей Т-клеточных рецепторов, способных распознавать различные эпитопы вируса представляемые различными аллелями HLA. Кроме того, нами были выявлены характерные аминокислотные мотивы последовательностей Т-клеточных рецепторов распознающих эпитоп A*02-YLQ вируса SARS-CoV-2 и показана воспроизводимость результатов по данным анализа крови пациентов полученных в различных лабораториях расположенных по всему земному шару.

Разнообразные длинные некодирующие РНК играют важную роль в патогенезе глиобластомы, однако молекулярные функции большинства из них до сих пор остаются неясными. В данной работе мы исследовали длинную некодирующиую РНК linc-RoR в клетках первичных культур нейросфер глиобластомы. По нашим данным, linc-RoR усиливает пролиферацию раковых клеток и повышает долю раковых стволовых клеток в общей популяции клеток глиобластомы. Данные РНК-секвенирования показали, что linc-RoR влияет на экспрессию генов, участвующих в регуляции митоза. В соответствие с этим наблюдением было обнаружено, что наиболее высокий уровень linc-RoR обнаруживается в G2/M фазу клеточного цикла, когда linc-RoR колокализуется с хромосомами делящихся клеток. Таким образом, на основе наших результатов, мы предполагаем, что linc-RoR выполняет проонкогенные функции в клетках глиобластомы человека, что может быть связано с регуляцией митотической прогрессии и стволовости раковых клеток. Лаборатория мембранных и биоэнергетических систем (Павлюков М., Шахпаронов М., Коваленко Т.) в сотрудничестве с Лабораторией молекулярной вирусологии (Рубцов Ю.)

Разнообразные длинные некодирующие РНК играют важную роль в патогенезе глиобластомы, однако молекулярные функции большинства из них до сих пор остаются неясными. В данной работе мы исследовали длинную некодирующиую РНК linc-RoR в клетках первичных культур нейросфер глиобластомы. По нашим данным, linc-RoR усиливает пролиферацию раковых клеток и повышает долю раковых стволовых клеток в общей популяции клеток глиобластомы. Данные РНК-секвенирования показали, что linc-RoR влияет на экспрессию генов, участвующих в регуляции митоза. В соответствие с этим наблюдением было обнаружено, что наиболее высокий уровень linc-RoR обнаруживается в G2/M фазу клеточного цикла, когда linc-RoR колокализуется с хромосомами делящихся клеток. Таким образом, на основе наших результатов, мы предполагаем, что linc-RoR выполняет проонкогенные функции в клетках глиобластомы человека, что может быть связано с регуляцией митотической прогрессии и стволовости раковых клеток.

Лаборатория мембранных и биоэнергетических систем (Павлюков М., Шахпаронов М., Коваленко Т.) в сотрудничестве с Лабораторией молекулярной вирусологии (Рубцов Ю.)

Глиобластома (GBM) - первичная опухоль головного мозга, является одним из наиболее агрессивных онкологических заболеваний человека. Для неё до сих пор не существует эффективных методов лечения, в результате чего частота возникновения рецидивов GBM близка к 100%, а средний срок жизни больных не превышает 2х лет. Трудность борьбы с GBM во многом объясняется чрезвычайной степенью внутриопухолевой гетерогенности – наличием большого количества разнообразных популяций раковых клеток в пределах одной опухоли. Несмотря на то, что эти популяции клеток достаточно хорошо изучены, до настоящего времени ничего не было известно о механизмах, объясняющих их возникновение. В данной работе мы впервые показали, что по мере роста опухоли в её центральной зоне происходит снижение рН, которое приводит к увеличению уровня белка регулятора сплайсинга SRSF4. SRSF4 изменяет сплайсинг пре-мРНК рибосомального белка RPL22L1 и вызывает образование новой, впервые описанной нами, изоформы RPL22L1b. Появление этой изоформы приводит к изменению специфичности рибосом к транслируемым ими молекулам мРНК, а также вызывает деградацию длинной некодирующей РНК MALAT1. Всё это вместе способствует возникновению более агрессивной популяции мезенхимальных клеток GBM. Полученные результаты позволили нам обнаружить новое низкомолекулярное соединение FG1059, которое нарушает функции белка SRSF4, изменяет сплайсинг RPL22L1 и приводит к гибели клеток GBM как in vitro, так и in vivo. Таким образом, в данном исследовании нам удалось, во-первых, продемонстрировать молекулярный механизм, объясняющий причины возникновения фенотипически различных популяций клеток GBM, обитающих в центре и на периферии опухоли, и, во-вторых, найти и испытать новое соединение, способное помочь в борьбе с этим заболеванием.

Лаборатория мембранных и биоэнергетических систем (Павлюков М., Шахпаронов М., Коваленко Т.), Лаборатория молекулярной онкологии (Донцова О., Рубцова М.)

Недавно было установлено, что ароматический поликетид тетраценомицин X (TcmX) является мощным ингибитором синтеза белка; его сайт связывания расположен в уникальном сайте туннеля большой рибосомальной субъединицы. Характерный механизм действия делает этот относительно узкий класс ароматических поликетидов перспективным для разработки лекарств в целях предотвращения распространения лекарственно-устойчивых патогенов. Мы выделили и выяснили структуры двух новых природных соединений, родственных тетраценомицину X: 6-гидрокситетраценомицина X (6-OH-TcmX) и O4-Me-тетраценомицина C (O4-Me-TcmC). В отличие от TcmX, 6-OH-TcmX проявил более низкую антимикробную и цитотоксическую активность, но сравнимую способность ингибирования синтеза белка in vitro. Спектральные свойства 6-OH-TcmX указывают на значительное влияние 6-гидроксилирования на хромофор тетраценомицина X. O4-Me-TcmC изомерен тетраценомицину X (TcmX), однако, в отличие от TcmX, он не проявляет антимикробной активности и не способен ингибировать синтез белка in vitro. Структурное соответствие тетраценомицинов локусу связывания из данных криоэлектронной микроскопии рибосомы TcmX-70S показало ключевую роль 4-гидроксильной группы. Эти результаты могут оказаться важными для дальнейшей разработки полусинтетических тетраценомицинов как потенциальных антибактериальных препаратов.

Исследование было сосредоточено на вопросе: есть ли специфические антитела против белков SARS-CoV2 и соответствующие антиген-специфические Т-клетки у здоровых доноров, и достаточно ли их для защиты от инфекции и заболевания COVID-19?

5400 здоровых доноров города Москвы были протестированы на IgG и IgM к белкам SARS-CoV-2. Значительная часть неинфицированных доноров имела значительный уровень анти-SARS-CoV2 Ig, а также вирусспецифические Т-клетки, продуцирующие IFN-g и IL-2. Величина ответов обратно пропорциональна вероятности заражения, в то время как уровень иммуноглобулина оказывал более выраженное влияние на защиту, чем ответ Т-клеток.

Данные о титрах вирусспецифических IgG могут быть информативными для принятия решений по сопосбам борьбы с COVID-19.

Хлорноватистая кислота (HOCl) является высоко реакционноспособным соединением, которое способно взаимодействовать со многими биологическими молекулами. Клетки нейтрофилы образуют HOCl в реакции, катализируемой ферментом миелопероксидазой, для защиты организма от патогенов. Однако многие воспалительные заболевания неинфекционной природы также сопровождаются выраженным гипохлоритным стрессом. HOCl образует в клетках различные активные производные. Например, N-хлорамины также являются окислителями, однако отличаются бо́льшим временем жизни и характеризуются большей селективностью по сравнению с HOCl. Поэтому остается открытым вопрос об участии подобных соединении в клеточном сигналинге. На сегодняшний день мало сведений о пространственной и временной динамики HOCl и ее производных в биологических системах.

Мы разработали первый в своем роде генетически кодируемый биосенсор для визуализации HOCl и ее производных в живых системах. В качестве основы для сенсоры мы выбрали бактериальный белок NemR из E.coli, в структуру которого интегрировали флуоресцентный белок cpYFP. При окислении HOCl или хлорамином флуоресцентные свойства данной химерной белковой молекулы обратимо изменяются. Полученный биосенсор мы назвали Hypocrates (от Hypochlorite Ratiometric Sensor) и детально охарактеризовали его свойства. Hypocrates был успешно протестирован в бактериях и клетках млекопитающих, а также in vivo на модели воспаления в тканях рыбы Danio rerio. 

Каскадный синтез арабинозидов является перспективным способом получения ряда важных противовирусных и антираковых лекарств. Низкая активность первого фермента каскада, рибокиназы, в отношении D-арабинозы ограничивает технологическую целесообразность данного подхода. Был осуществлен рациональный дизайн в активном центре рибокиназы из E. coli, и создана мутантная форма A98G с увеличенной в 15 раз активностью (kcat) в отношении D-арабинозы. Разработанная мутантная форма фермента была успешно использована для оптимизации каскадного синтеза арабинозидов.

Синтезирован ряд аналогов аденозина – производных 2-хлорпурин-рибозида, содержащих в положении С6 амиды аминокислот, и проведен молекулярный докинг по их сродству к аденозиновым рецепторам типа А₁ (A₁AR). На модели изолированного предсердия мыши было исследовано стимулирующей A1AR активности. Производные с остатками тирозина, валина и серина проявляют свойства частичных агонистов A₁AR. Эксперименты на животных в тесте «открытое поле» показали, что эти соединения имеют разные профили психоактивного действия. Производное с сериновым заместителем обладает офтальмологическим гипотензивным эффектом. Синтезированные нуклеозиды могут стать основой для дальнейшего дизайна и синтеза новых агонистов A₁AR.

В 2022 году опубликован метод определения нейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2, основанный на блокировании взаимодействия ангиотензин-превращающего фермента 2 (ACE2) и рецептор-связывающего домена шиповидного белка (RBD) в формате ИФА. Он не требует специальных условий безопасности и квалификации персонала и может использоваться для рутинного анализа в обычных лабораториях. Все рекомбинантные белки, использующиеся для теста – внеклеточный домен рецептора ACE2 и рецептор-связывающий домен шиповидного белка получены сотрудниками лаборатории биотехнологии гликопротеинов и доступны для исследований на некоммерческой основе.

Модель характеризуется диффузным альвеолярным повреждением левого легкого, 100% выживаемостью животных, резким увеличением уровней TNFα, INFg и IL-6 в плазме крови и значительной перегрузкой миокарда правых отделов сердца. Модель подходит для оценки эффективности инновационных препаратов при лечении ДАП и ОРДС, развивающихся у пациентов как клинические проявления после заражения SARS-CoV-2. Проведено сравнение морфологических особенностей легких в неинфекционной («стерильной») модели ДАП, индуцированной ЛПС и α-галактозилцерамидом и в инфекционной модели ДАП, индуцированной SARS-CoV-2. Предложенная нами модель ДАП может быть широко использована для изучения эффективности молекул-кандидатов для лечения инфекционных заболеваний органов дыхания, таких как вирусные пневмонии различной этиологии, в том числе после SARS-CoV-2, без использования специализированных лабораторий уровня ABSL3.

С целью поиска новых пептидных конструкций с антибактериальными свойствами синтезирована небольшая библиотке пептидов состоящих из амилоидогенных последовательностей, линкера и интернализирующего пептида. В дизайне использована концепция индукции образования аггрегатов при взаимодействии амилоидогенного фрагмента с исходным белком. Ввиду различия амилоидогенных последовательностей у белков различных микроорганизмов возможно достижение селективности антимикробного эффекта одной пептидной конструкции в отношении ряда микроорганизмов. Показано, что такой эффект наблюдается, но он не является общим. Антимикробная активность по величине МИК для некоторых соединений сравнима с таковой для антибиотика Гентамицина.

Разработан быстрый и эффективный метод выделения геномной ДНК из бацилл, основанный на разрушении клеточной стенки пептидогликангидролазами разной специфичности – l,d-пептидазой и N-ацетилмурамидазой, показана его высокая эффективность по сравнению с методами, основанными на физическом, химическом воздействии на клеточную стенку или неспецифическом протеолизе. Оптимизация метода за счет сокращения времени обработки клеток ферментами до 10 минут сохраняла выход нуклеиновых кислот максимальным; в коктейле HEWL/ EndoRB49 наблюдался выраженный синергизм пептидазы и мурамидазы.

1) pH-индикатор. Мы описали мутантный вариант зеленого флуоресцентного белка EGFP-Y145L/S205V в качестве рН-индикатора. В клетках млекопитающих в диапазоне pH 7.5–9.0 время жизни флуоресценции белка EGFP-Y145L/S205V изменяется в 3.5 раза. Такое значительное изменение в сравнительно узком диапазоне слабощелочных рН позволяет с высокой точностью измерять рН в митохондриях живых клеток использую FLIM-микроскопию.

2) Индикатор мембранного потенциала. Мы впервые применили престин – электроподвижный белок слухового анализатора млекопитающих – в качестве потенциал-чувствительного ядра генетически кодируемого индикатора мембранного потенциала. В качестве репортерного домена был взят красный флуоресцентный белок FusionRed. После тестирования множества вариантов, был отобран индикатор Prestin-5, который продемонстрировал флуоресцентный ответ на изменение мембранного потенциала, характеризующийся субмиллисекундной кинетикой. Кинетические характеристики Prestin-5 ставят его в один ряд с наиболее “быстрыми” существующими генетически кодируемыми индикаторами мембранного потенциала на основе прокариотических опсинов.

Структура нового яркого фиолетового флуоресцентного белка (ФБ) с необычным хромофором, bfVFP (ланцетник, Branchiostoma floridae), установлена рентгеноструктурным методом высокого разрешения и подтверждена данными масс-спектрометрии. Это первый пример GFP-подобного ФБ со стабильным флуоресцентным хромофором, без 5-ти членного имидазолинонового кольца. Хромофор состоит из окисленного по связи Ca-Cb аминокислотного остатка Tyr68, фланкированного с обеих сторон Gly67 и Ala69. Фотофизические характеристики bfVFP (lвозб/lэм ~323/~430 нм, квантовый выход (QY) ~0.33, коэффициент экстинкции (Ec) - 14 300 М-1 cm-1) делают его потенциально полезным для многоцветных экспериментов в биологии, расширяя диапазон возбуждения и безызлучательного резонансного переноса энергии (FRET) на акцепторы ФБ синего и голубого диапазона.

Принцип работы многих биомолекулярных сенсоров, используемых для изучения белок-белковых взаимодействий в живых клетках основан на Ферстеровском резонансном переносе энергии (FRET). Однако, точное измерение эффективности FRET в живых клетках остается сложной задачей, требующей трудоемких контрольных измерений, таких как фотообесцвечивание акцептора интенсивным светом. Другие подходы для количественной оценки FRET, включая измерение времени жизни флуоресценции, спектральную детекцию и измерение поляризации флуоресценции, гораздо менее доступны для исследователей и/или требуют дорогостоящего оборудования.

Мы создали принципиально новую модулируемую FRET-пару на основе флуороген-активирующего белка DiB1 и зеленого флуоресцентного белка mNeonGreen. Модулируемые акцепторы способны переключаться между двумя состояниями с различным поглощением, эффективно включая и выключая перенос энергии. При добавлении проникающего в клетку хромофора флуоресценция зеленого флуоресцентного белка mNeonGreen в составе FRET-пары снижается, что позволяет проводить упрощенное одноканальное измерение FRET. Разработанный нами модулируемый акцептор FRET применим в живых клетках и позволяет проводить длительные эксперименты с динамическим измерением эффективности FRET.

В работе показано, что образование комплекса мембранного белка кавеолин-1 с нейрональным кольцевым сенсором фоторецепторной системы рековерином, служащим мембраносвязывающим регулятором родопсинкиназы, является окислительно-восстановительным процессом. Биохимические и биофизические эксперименты in vitro выявили двукратное снижение сродства рековерина к мутантной форме кавеолина-1 Y14E, имитирующей фосфорилированую форму белка, вызванное окислительным стрессом. В то же время кавеолин-1 дикого типа демонстрировал 5–10-кратное увеличение сродства к дисульфидному димеру рековерина (dRec) или его мутанту C39D, имитирующему тиоловое окисление. На образование dRec in vitro кавеолин-1 не влиял, но оно значительно усиливалось цинком, хорошо известным медиатором окислительно-восстановительного гомеостаза. В модели клеток MDCK окислительный стресс действительно запускал Y14 фосфорилирование кавеолина-1 и дисульфидную димеризацию рековерина. Примечательно, что окислительные условия способствовали накоплению фосфорилированного кавеолина-1 в плазматической мембране и колокализации рековерина в тех же местах. Совместная локализация этих белков сохранялась при уменьшении концентрации внутриклеточного кальция, т. е. в условиях, снижающих сродство рековерина к мембране, но способствующих его взаимодействию с кавеолином-1. Совокупность полученных данных позволяет предположить окислительно-восстановительную регуляцию сигнального комплекса между рековерином и кавеолином-1. Во время окислительного стресса высокоаффинное взаимодействие окисленного рековерина с кавеолином-1 может нарушать индуцированную светом транслокацию первого в фоторецепторы и влиять на десенсибилизацию родопсина.