Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул

Отдел структурной биологии

Руководитель: Феофанов Алексей Валерьевич, д. б. н., доцент
+7 (495) 336-64-55 · avfeofanov@yandex.ru

www.ibch.ru/structure/groups/optics

круговой дихроизм, мембранные и мембрано-активные белки, микроспектроскопия, оптическая микроскопия, рецепторы эфринов, флуоресценция, фотосенсибилизаторы

В лаборатории создана установка для конфокальной лазерной микроспектроскопии и разработан метод конфокальной микроспектроскопии и реконструкции спектральных изображений (КОМИРСИ). Метод дает уникальную возможность идентификации и изучения молекулярных взаимодействий биологически активных соединений в живых клетках с трехмерным субмикронным пространственным разрешением. Установка и метод КОМИРСИ нашли широкое применение в разработках, научных и клинических исследованиях новых отечественных фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии рака; в исследованиях мембранных и мембраноактивных белков.

Лаборатория располагает уникальным научным оборудованием, которое, включает в себя установку для однофотонной и многофотонной 4π-микроскопии сверхвысокого разрешения, инвертированный флуоресцентный микроскоп с возможностью измерений на основе эффекта полного внутреннего отражения и установку для конфокальной лазерной микроспектроскопии.

Сотрудники лаборатории преподают основы оптической микроскопии студентам УНЦ ИБХ РАН и каф. Биоинженерии Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова. Под руководством сотрудников лаборатории ежегодно выполняются 2–3 бакалаврские и магистерские работы, ведутся научные исследования аспирантов и молодых ученых.

Направления исследований

Лаборатория занимается исследованиями биологически-активных молекул, мембранных и мембраноактивных белков, а также разработкой новых методик оптической микроскопии и спектроскопии применительно к этим задачам.

Развиваемые в лаборатории методы применяются для изучения механизмов действия и структурно-функциональных взаимосвязей исследуемых молекул на разных уровнях структурной организации: молекулярном, клеточном, тканевом.

 

Основные направления исследований включают в себя:

скрининг, структурно-функциональные, доклинические и клинические исследования новых фотосенсибилизаторов для противоопухолевой и антимикробной фотодинамической терапии (ФДТ); 

оптимизация структуры и изучение свойств конъюгатов хлорина е6 с наночастицами бора применительно к ФДТ, бор нейтрон-захватной терапии рака и флуоресцентной диагностике;

изучение функциональной роли трансмембранных доменов эфриновых тирозинкиназных рецепторов EphA2; 

изучение свойств и механизмов действия на клетки эукариот и прокариот пептидов из ядов паукообразных;

поиск новых лигандов потенциал-зависимых калиевых каналов, изучение их активности и свойств.   

Трехмерное конфокальное изображение клеток HEK293, в которых достигнута стабильная экспрессия рецептора эфринов EphA2, слитого с циановым флуоресцентным белком (показан зеленым цветом), совместно с EphA2, слитым c желтым флуоресцентным белком (показан красным цветом). Совпадение локализации двух конструкций показано желтым цветом. Клеточная модель используется для изучения механизмов активации и димеризации эфриновых рецепторов с применением метода резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

 

Ф.И.О.ДолжностьЭл. почта
Арсеньев Александр Сергеевич, д. х. н., профессорЗав. отделом
Астапова Мария Вячеславовна, к. б. н.с.н.с.
Игнатова Анастасия Александровнам.н.с.
Марквичёва Ксения Николаевна, к. б. н.м.н.с.
Феофанова Анна Евгеньевнатех.-лаб.
Шаронов Георгий Владимирович, к. ф.-м. н.н.с.

Избранные публикации

  1. Valieva M.E., Armeev G.A., Kudryashova K.S., Gerasimova N.S., Shaytan A.K., Kulaeva O.I., McCullough L.L., Formosa T., Georgiev P.G., Kirpichnikov M.P., Studitsky V.M., Feofanov A.V. (2016). Large-scale ATP-independent nucleosome unfolding by a histone chaperone. Nat. Struct. Mol. Biol. , [+]

    DNA accessibility to regulatory proteins is substantially influenced by nucleosome structure and dynamics. The facilitates chromatin transcription (FACT) complex increases the accessibility of nucleosomal DNA, but the mechanism and extent of its nucleosome reorganization activity are unknown. Here we determined the effects of FACT from the yeast Saccharomyces cerevisiae on single nucleosomes by using single-particle Förster resonance energy transfer (spFRET) microscopy. FACT binding results in dramatic ATP-independent, symmetrical and reversible DNA uncoiling that affects at least 70% of the DNA within a nucleosome, occurs without apparent loss of histones and proceeds via an 'all-or-none' mechanism. A mutated version of FACT is defective in uncoiling, and a histone mutation that suppresses phenotypes caused by this FACT mutation in vivo restores the uncoiling activity in vitro. Thus, FACT-dependent nucleosome unfolding modulates the accessibility of nucleosomal DNA, and this activity is an important function of FACT in vivo.

    ID:1625
  2. Shulepko M.A., Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Dubovskii P.V., Astapova M.V., Feofanov A.V., Arseniev A.S., Utkin Y.N., Kirpichnikov M.P., Dolgikh D.A. (2016). Towards universal approach for bacterial production of three-finger Ly6/uPAR proteins: Case study of cytotoxin I from cobra N. oxiana. Protein Expr. Purif. 130, 13–20 [+]

    Cytotoxins or cardiotoxins is a group of polycationic toxins from cobra venom belonging to the 'three-finger' protein superfamily (Ly6/uPAR family) which includes small β-structural proteins (60-90 residues) with high disulfide bond content (4-5 disulfides). Due to a high cytotoxic activity for cancer cells, cytotoxins are considered as potential anticancer agents. Development of the high-throughput production methods is required for the prospective applications of cytotoxins. Here, efficient approach for bacterial production of recombinant analogue of cytotoxin I from N. oxiana containing additional N-terminal Met-residue (rCTX1) was developed. rCTX1 was produced in the form of E. coli inclusion bodies. Refolding in optimized conditions provided ∼6 mg of correctly folded protein from 1 L of bacterial culture. Cytotoxicity of rCTX1 for C6 rat glioma cells was found to be similar to the activity of wild type CTX1. The milligram quantities of (13)C,(15)N-labeled rCTX1 were obtained. NMR study confirmed the similarity of the spatial structures of recombinant and wild-type toxins. Additional Met residue does not perturb the overall structure of the three-finger core. The analysis of available data for different Ly6/uPAR proteins of snake and human origin revealed that efficiency of their folding in vitro is correlated with the number of proline residues in the third loop and the surface area of hydrophobic residues buried within the protein interior. The obtained data indicate that hydrophobic core is important for the folding of proteins with high disulfide bond content. Developed expression method opens new possibilities for structure-function studies of CTX1 and other related three-finger proteins.

    ID:1599
  3. Kuzmenkov A.I., Nekrasova O.V., Kudryashova K.S., Peigneur S., Tytgat J., Stepanov A.V., Kirpichnikov M.P., Grishin E.V., Feofanov A.V., Vassilevski A.A. (2016). Fluorescent protein-scorpion toxin chimera is a convenient molecular tool for studies of potassium channels. Sci Rep 6, 33314 [+]

    Ion channels play a central role in a host of physiological and pathological processes and are the second largest target for existing drugs. There is an increasing need for reliable tools to detect and visualize particular ion channels, but existing solutions suffer from a number of limitations such as high price, poor specificity, and complicated protocols. As an alternative, we produced recombinant chimeric constructs (FP-Tx) consisting of fluorescent proteins (FP) fused with potassium channel toxins from scorpion venom (Tx). In particular, we used two FP, eGFP and TagRFP, and two Tx, OSK1 and AgTx2, to create eGFP-OSK1 and RFP-AgTx2. We show that these chimeras largely retain the high affinity of natural toxins and display selectivity to particular ion channel subtypes. FP-Tx are displaced by other potassium channel blockers and can be used as an imaging tool in ion channel ligand screening setups. We believe FP-Tx chimeras represent a new efficient molecular tool for neurobiology.

    ID:1561
  4. Dubovskii P.V., Vassilevski A.A., Kozlov S.A., Feofanov A.V., Grishin E.V., Efremov R.G. (2015). Latarcins: versatile spider venom peptides. Cell. Mol. Life Sci. 72 (23), 4501–22 [+]

    Arthropod venoms feature the presence of cytolytic peptides believed to act synergetically with neurotoxins to paralyze prey or deter aggressors. Many of them are linear, i.e., lack disulfide bonds. When isolated from the venom, or obtained by other means, these peptides exhibit common properties. They are cationic; being mostly disordered in aqueous solution, assume amphiphilic α-helical structure in contact with lipid membranes; and exhibit general cytotoxicity, including antifungal, antimicrobial, hemolytic, and anticancer activities. To suit the pharmacological needs, the activity spectrum of these peptides should be modified by rational engineering. As an example, we provide a detailed review on latarcins (Ltc), linear cytolytic peptides from Lachesana tarabaevi spider venom. Diverse experimental and computational techniques were used to investigate the spatial structure of Ltc in membrane-mimicking environments and their effects on model lipid bilayers. The antibacterial activity of Ltc was studied against a panel of Gram-negative and Gram-positive bacteria. In addition, the action of Ltc on erythrocytes and cancer cells was investigated in detail with confocal laser scanning microscopy. In the present review, we give a critical account of the progress in the research of Ltc. We explore the relationship between Ltc structure and their biological activity and derive molecular characteristics, which can be used for optimization of other linear peptides. Current applications of Ltc and prospective use of similar membrane-active peptides are outlined.

    ID:1395
  5. Kuzmenkov A.I., Vassilevski A.A., Kudryashova K.S., Nekrasova O.V., Peigneur S., Tytgat J., Feofanov A.V., Kirpichnikov M.P., Grishin E.V. (2015). Variability of Potassium Channel Blockers in Mesobuthus eupeus Scorpion Venom with Focus on Kv1.1: AN INTEGRATED TRANSCRIPTOMIC AND PROTEOMIC STUDY. J. Biol. Chem. 290 (19), 12195–209 [+]

    The lesser Asian scorpion Mesobuthus eupeus (Buthidae) is one of the most widely spread and dispersed species of the Mesobuthus genus, and its venom is actively studied. Nevertheless, a considerable amount of active compounds is still under-investigated due to the high complexity of this venom. Here, we report a comprehensive analysis of putative potassium channel toxins (KTxs) from the cDNA library of M. eupeus venom glands, and we compare the deduced KTx structures with peptides purified from the venom. For the transcriptome analysis, we used conventional tools as well as a search for structural motifs characteristic of scorpion venom components in the form of regular expressions. We found 59 candidate KTxs distributed in 30 subfamilies and presenting the cysteine-stabilized α/β and inhibitor cystine knot types of fold. M. eupeus venom was then separated to individual components by multistage chromatography. A facile fluorescent system based on the expression of the KcsA-Kv1.1 hybrid channels in Escherichia coli and utilization of a labeled scorpion toxin was elaborated and applied to follow Kv1.1 pore binding activity during venom separation. As a result, eight high affinity Kv1.1 channel blockers were identified, including five novel peptides, which extend the panel of potential pharmacologically important Kv1 ligands. Activity of the new peptides against rat Kv1.1 channel was confirmed (IC50 in the range of 1-780 nm) by the two-electrode voltage clamp technique using a standard Xenopus oocyte system. Our integrated approach is of general utility and efficiency to mine natural venoms for KTxs.

    ID:1310
  6. Kudryashova K.S., Chertkov O.V., Nikitin D.V., Pestov N.A., Kulaeva O.I., Efremenko A.V., Solonin A.S., Kirpichnikov M.P., Studitsky V.M., Feofanov A.V. (2015). Preparation of mononucleosomal templates for analysis of transcription with RNA polymerase using spFRET. Methods Mol. Biol. 1288, 395–412 [+]

    Single positioned nucleosomes have been extensively employed as simple model experimental systems for analysis of various intranuclear processes. Here we describe an experimental system containing positioned mononucleosomes allowing transcription by various RNA polymerases. Each DNA template contains a pair of fluorescent labels (Cy3 and Cy5) allowing measuring relative distances between the neighboring coils of nucleosomal DNA using Forster resonance energy transfer (FRET). The single-particle FRET (spFRET) approach for analysis of DNA uncoiling from the histone octamer during transcription through chromatin is described in detail.

    ID:1471
  7. Dubovskii V., Vorontsova V., Utkin N., Arseniev S., Efremov G., Feofanov V. (2014). Cobra cytotoxins: determinants of antibacterial activity. Mendeleev Communications 25 (1), 70–71 [+]

    The investigation of antibacterial activity of three-finger cobra cytotoxins towards Gram-negative and Gram-positive bacteria showed no activity against the former species, whereas M. luteus was found most susceptible to cytotoxins. A correlation was revealed between this activity and hydrophobicity of the toxins (HTL scores), total charge and its distribution over the toxin molecule: the absence of Glu-16 residue and the presence of positively charged residues (Lys30/His31) in the tip of the loop 2.

    ID:1398
  8. Кузнецов А.С., Дубовский П.В., Воронцова О.В., Феофанов А.В., Ефремов Р.Г. (2014). Взаимодействие линейных катионных пептидов с фосфолипидными мембранами и полимерами сиаловой кислоты. Биохимия 79 (5), 583–594583–594 ID:1123
  9. Kudryashova K.S., Nekrasova O.V., Kuzmenkov A.I., Vassilevski A.A., Ignatova A.A., Korolkova Y.V., Grishin E.V., Kirpichnikov M.P., Feofanov A.V. (2013). Fluorescent system based on bacterial expression of hybrid KcsA channels designed for Kv1.3 ligand screening and study. Analytical and bioanalytical chemistry , [+]

    Human voltage-gated potassium channel Kv1.3 is an important pharmacological target for the treatment of autoimmune and metabolic diseases. Increasing clinical demands stipulate an active search for efficient and selective Kv1.3 blockers. Here we present a new, reliable, and easy-to-use analytical system designed to seek for and study Kv1.3 ligands that bind to the extracellular vestibule of the K(+)-conducting pore. It is based on Escherichia coli spheroplasts with the hybrid protein KcsA-Kv1.3 embedded into the membrane, fluorescently labeled Kv1.3 blocker agitoxin-2, and confocal laser scanning microscopy as a detection method. This system is a powerful alternative to radioligand and patch-clamp techniques. It enables one to search for Kv1.3 ligands both among individual compounds and in complex mixtures, as well as to characterize their affinity to Kv1.3 channel using the "mix and read" mode. To demonstrate the potential of the system, we performed characterization of several known Kv1.3 ligands, tested nine spider venoms for the presence of Kv1.3 ligands, and conducted guided purification of a channel blocker from scorpion venom.

    ID:782
  10. Polyansky A.A., Vassilevski A.A., Volynsky P.E., Vorontsova O.V., Samsonova O.V., Egorova N.S., Krylov N.A., Feofanov A.V., Arseniev A.S., Grishin E.V., Efremov R.G. (2009). N-terminal amphipathic helix as a trigger of hemolytic activity in antimicrobial peptides: a case study in latarcins. FEBS Lett. 583 (14), 2425–8 [+]

    In silico structural analyses of sets of alpha-helical antimicrobial peptides (AMPs) are performed. Differences between hemolytic and non-hemolytic AMPs are revealed in organization of their N-terminal region. A parameter related to hydrophobicity of the N-terminal part is proposed as a measure of the peptide propensity to exhibit hemolytic and other unwanted cytotoxic activities. Based on the information acquired, a rational approach for selective removal of these properties in AMPs is suggested. A proof of concept is gained through engineering specific mutations that resulted in elimination of the hemolytic activity of AMPs (latarcins) while leaving the beneficial antimicrobial effect intact.

    ID:318
  11. Феофанов А.В. (2007). Спектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях. Успехи биолог. хим. 47, 371–410 [+]

    В работе рассматриваются применения флуоресцентного спектрального анализа в лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (ЛСКМ). Спектральная ЛСКМ позволяет идентифицировать и разделять в исследуемых образцах перекрывающиеся сигналы нескольких флуоресцирующих соединений и (или) белков слияния, а также учитывать вклад эндогенной флуоресценции, что существенно повышает чувствительность, надежность и точность анализа по сравнению с традиционной ЛСКМ. Анализ полных спектров флуоресценции дает возможность изучать молекулярные взаимодействия флуоресцирующих биологически активных соединений (БАС) в живых клетках с трехмерным субмикронным пространственным разрешением. Спектральная ЛСКМ позволяет измерять концентрации БАС и их комплексов в живых клетках, оценивать средние концентраций БАС в органоидах, клеточных доменах, в среднем по клетке, а также проводить статистически достоверный анализ клеточных концентраций БАС на ограниченной выборке клеток. Спектральная ЛСКМ является уникальным дополнением к традиционным методам флуоресцентной микроскопии и ЛСКМ.

    ID:91
  12. Sharonov G.V., Karmakova T.A., Kassies R., Pljutinskaya A.D., Grin M.A., Refregiers M., Yakubovskaya R.I., Mironov A.F., Maurizot J.C., Vigny P., Otto C., Feofanov A.V. (2006). Cycloimide bacteriochlorin p derivatives: photodynamic properties and cellular and tissue distribution. Free Radic. Biol. Med. 40 (3), 407–19 [+]

    В работе проведено сравнительное исследование 11 новых фотосенсибилиаторов для фотодинамической терапии рака — циклоимидных производных бактериохлорина р с различными боковыми заместителями. Показано, что данные соединения обладают интенсивным поглощением в спектральном диапазоне прозрачности биологической ткани (780—830 нм), высоким квантовым выходом генерации синглетного кислорода (0,54—0,56) и способностью проникать и накапливаться в опухолевых клетках in vitro. Установлено, что с помощью боковых заместителей можно направлять данные соединения преимущественно в аппарат Гольджи, или липидные капли, или лизосомы и обеспечивать высокие коэффициенты накопления этих соединений в раковых клетках. На модели перевивной опухоли мышей выявлено усиленное накопление изучаемых соединений в опухоли и окружающей соединительной ткани, что с учетом перечисленных выше свойств позволяет рекомендовать циклоимидные производные бактериохлорина р в качестве перспективных фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии рака.

    ID:92
  13. Feofanov A.V., Sharonov G.V., Astapova M.V., Rodionov D.I., Utkin Y.N., Arseniev A.S. (2005). Cancer cell injury by cytotoxins from cobra venom is mediated through lysosomal damage. Biochem. J. 390 (Pt 1), 11–8 [+]

    Статья посвящена исследованию механизмов цитотоксического действия цитотоксинов (ЦТ) из яда кобр. В данной работе показано, что ЦТ 1 и 2 из яда кобры Naja oxiana, ЦТ 1 из Naja haje и ЦТ 3 из Naja kaouthia способны накапливаться в лизосомах клеток промиелоцитарной лейкемии человека HL60 и аденокарциномы легкого человека A549. Кинетика и концентрационная зависимость накопления ЦТ в лизосомах согласуется с кинетикой и концентрационной зависимостью гибели клеток, что свидетельствует о том, что лизосомы могут быть одной из мишеней ЦТ, а воздействие на эту мишень заключается в концентрационно-зависимой пермеабилизации мембраны лизосом.

    ID:93
  14. Sharonov G.V., Feofanov A.V., Bocharova O.V., Astapova M.V., Dedukhova V.I., Chernyak B.V., Dolgikh D.A., Arseniev A.S., Skulachev V.P., Kirpichnikov M.P. (2005). Comparative analysis of proapoptotic activity of cytochrome c mutants in living cells. Apoptosis 10 (4), 797–808 [+]

    В работе докладывается о разработке метода измерения проапоптотическй активности экзогенного цитохрома с в живых клетках. Метод основан на введении белка в цитоплазму клетки с помощью электропорации и выявлении с помощью флуоресцентной микроскопии признаков развития апоптоза в клетках. С помощью данного метода были измерены относительные про-апоптозные активности лошадиного цитохрома с и четырех мутантных вариантов данного белка. Обнаружено, что аминокислотная замена К72W полностью блокирует про-апоптозную активность цитохрома с, но не влияет на его «дыхательную» функцию. Методом КОМИРСИ была впервые оценена минимальная цитоплазматическая концентрация лошадиного цитохрома с, необходимая для индукции апоптоза в клетках WEHI-3b.

    ID:94
  15. Feofanov A., Sharonov G., Grichine A., Karmakova T., Pljutinskaya A., Lebedeva V., Ruziyev R., Yakubovskaya R., Mironov A., Refregier M., Maurizot J.C., Vigny P. (2004). Comparative study of photodynamic properties of 13,15-N-cycloimide derivatives of chlorin p6. Photochem. Photobiol. 79 (2), 172–88 [+]

    В работе проведено сравнительное исследование четырех новых фотосенсибилизаторов на основе циклоимидных производных хлорина p6 с различными боковыми заместителями. Установлено, что фотодинамическая активность данных соединений в отношении опухолевых клеток in vitro в несколько сот раз выше, чем активность используемого в клинике препарата Фотогем. Показано, что данные соединения эффективно образуют синглетный кислород (квантовый выход 0,35—0,66) и накапливаются в клетках в мономерной фотоактивной форме в связанном с липидными структурами состоянии. В работе продемонстрировано, что с помощью боковых заместителей можно направлять данные соединения в различные внутриклеточные компартменты: аппарат Гольджи, митохондрии, ядерную мембрану и липидные капли. Под действием света данные фотосенсибилизаторы вызывают гибель клеток преимущественно по механизму апоптоза при сублетальном режиме (гибель 50% клеток) и по механизму некроза — при летальном (гибель 100% клеток).

    ID:95

Руководитель подразделения

Феофанов Алексей Валерьевич

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 31, комн. 215
  • Тел.: +7 (495) 336-64-55
  • Эл. почта: avfeofanov@yandex.ru

Структурная реорганизации нуклеосом под действием белкового фактора FACT (2016-11-18)

А.В.Феофанов

(Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул)

К.С. Кудряшова,  М.П.Кирпичников

(Отдел биоинженерии)

            Аннотация: Разработаны методики флуоресцентной микроскопии одиночных молекул, позволяющие изучать структурные перестройки ДНК в одиночных нуклеосомах под действием белковых факторов.  В исследованиях дрожжевого белкового фактора FACT (facilitates chromatin transcription) методом микроскопии одиночных молекул установлено, что  FACT вызывает масштабное, обратимое, АТФ-независимое раскручивание нуклеосомной ДНК. Это раскручивание происходит по механизму «все-или-ничего», симметрично, затрагивает не менее 70% ДНК, уложенной на гистоновом коре, и не приводит к потере гистонов. FACT-индуцированное раскручивание нуклеосомы усиливает доступность ДНК для ядерных ферментов, что является важнейшей функцией FACT in vivo.   

Публикации:

Valieva M.E., Armeev G.A., Kudryashova K.S., Gerasimova N.S., Shaytan A.K., Kulaeva O.I., McCullough L.L., Formosa T., Georgiev P.G., Kirpichnikov M.P., Studitsky V.M., Feofanov A.V. Large-Scale ATP-Independent Nucleosome Unfolding by a Histone Chaperone. Nat Struct Mol Biol. 2016,  doi: 10.1038/nsmb.3321, in press.

Feofanov, A.V., Kudryashova, K.S., Chertkov, O.V., Nikitin, D.V., Pestov, N.A., Kulaeva, O.I., Studitsky, V.M. and Kirpichnikov, M.P. Analysis of nucleosome transcription using single-particle FRET. Springer Proceedings in Physics,  2015, Vol.164, pp. 255-260. ISBN:978-3-319-16918-7 Chapter DOI:10.1007/978-3-319-16919-4_33

Kudryashova, K.S., Chertkov, O.V., Nikitin, D.V., Pestov, N.A., Kulaeva, O.I., Efremenko, A.V., Solonin, A.S., Kirpichnikov, M.P., Studitsky, V.M. and Feofanov, A.V.  Preparation of Mononucleosomal Templates for Analysis of Transcription with RNA Polymerase Using spFRET. Methods Mol Biol. 2015, 1288, 395-412.

К.С. Кудряшова, Д.В. Никитин, О.В. Чертков, Н.С. Герасимова, М.Е. Валиева, В.М. Студитский, А.В. Феофанов. Разработка флуоресцентно-меченых мононуклеосом для изучения механизмов транскрипции методом микроскопии одиночных комплексов. Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 16. Биология. 2015. № 4, C. 41-45.

 

Работа выполнена совместно с сотрудниками Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (М.Е. Валиева, Г.А. Армеев, Н.С. Герасимова, А.К. Шайтан), Института биологии гена РАН (П.Г. Георгиев), University of Utah, USA (T. Formosa, L.L. McCullough), Fox Chase Cancer Center, USA  (V.M. Studitsky, O.I. Kulaeva)

Новый подход к исследованию молекулярных основ взаимодействия пептидных блокаторов с калиевым каналом Kv1.6 (2016-11-18)

Авторы: О.В.Некрасова, К.С. Кудряшова, С.А. Якимов, М.П.Кирпичников

(Отдел биоинженерии)

Ю.В. Королькова

(Отдел молекулярной нейробиологии)

А.В.Феофанов

(Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул)

 

            Разработан комплексный подход к поиску, исследованию и конструированию  пептидных блокаторов калиевого канала Kv1.6. Подход основан на применении разработанной нами биоинженерной аналитической системы для изучения связывания блокаторов с гибридным каналом KcsA-Kv1.6 методом конфокальной микроскопии и молекулярного моделирования комплексов пептидных блокаторов с каналом Kv1.6. Используя разработанный подход, охарактеризована аффинность ряда пептидных блокаторов к каналу Kv1.6, построены молекулярные модели их комплексов, описан интерфейс взаимодействия и аминокислотные остатки, влияющие на селективность  взаимодействия блокаторов с каналом Kv1.6.

Публикации:

Nekrasova OV, Volyntseva AD, Kudryashova KS, Novoseletsky VN, Lyapina EA, Illarionova AV, Yakimov SA, Korolkova YV, Shaitan KV, Kirpichnikov MP, Feofanov AV. Complexes of Peptide Blockers with Kv1.6 Pore Domain: Molecular Modeling and Studies with KcsA-Kv1.6 Channel. J Neuroimmune Pharmacol (2016). doi:10.1007/s11481-016-9710-9.

 

Работа выполнена совместно с сотрудниками кафедры биоинженерии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (К.В.Шайтан, В.Н.Новоселецкий, А.Д.Волынцева).

Биомолекулярные инструменты для визуализации ионных каналов (2016-11-18)

Участники:

Группа молекулярных инструментов для нейробиологии (А.И. Кузьменков, А.А. Василевский, Е.В. Гришин)

Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул (А.В. Феофанов)

Группа нанобиоинженерии (К.С. Кудряшова, О.В. Некрасова)

Лаборатория молекулярной токсинологии (И.В. Шелухина)

Краткая формулировка:

Мы создали высокоаффинные химерные молекулы на основе флуоресцентных белков и токсинов скорпионов, селективно воздействующих на потенциал-чувствительные калиевые каналы человека. Мы также продемонстрировали возможности использования таких химер в нейробиологии для визуализации ионных каналов: изучения их локализации, профиля экспрессии в клетках, тканях и органах. Кроме того, представляется возможным использование новых инструментов для скрининговых технологий и диагностики целого ряда заболеваний.

Публикации

  1. Kuzmenkov A.I., Nekrasova O.V., Kudryashova K.S., Peigneur S., Tytgat J., Stepanov A.V., Kirpichnikov M.P., Grishin E.V., Feofanov A.V., Vassilevski A.A. (2016). Fluorescent protein-scorpion toxin chimera is a convenient molecular tool for studies of potassium channels. Sci Rep 6, 33314 [+]

    Ion channels play a central role in a host of physiological and pathological processes and are the second largest target for existing drugs. There is an increasing need for reliable tools to detect and visualize particular ion channels, but existing solutions suffer from a number of limitations such as high price, poor specificity, and complicated protocols. As an alternative, we produced recombinant chimeric constructs (FP-Tx) consisting of fluorescent proteins (FP) fused with potassium channel toxins from scorpion venom (Tx). In particular, we used two FP, eGFP and TagRFP, and two Tx, OSK1 and AgTx2, to create eGFP-OSK1 and RFP-AgTx2. We show that these chimeras largely retain the high affinity of natural toxins and display selectivity to particular ion channel subtypes. FP-Tx are displaced by other potassium channel blockers and can be used as an imaging tool in ion channel ligand screening setups. We believe FP-Tx chimeras represent a new efficient molecular tool for neurobiology.

    ID:1561

Разработка интегрального транскриптомного и протеомного подхода для поиска блокаторов калиевых каналов в ядах животных (2016-03-26)

Авторы: 

Кузьменков А.И., Василевский А.А., Гришин Е.В. Отдел молекулярной нейробиологии.

Кудряшова К.С., Некрасова О.В., Кирпичников М.П. Отдел биоинженерии.

Феофанов А.В. Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул. 

Аннотация: 

Разработан оригинальный подход для поиска новых лигандов калиевых каналов, объединяющий биоинженерную клеточную тест-систему и транскриптомный и протеомный анализ яда животных. С применением этого подхода из яда скорпиона Mesobuthus eupeus были получены восемь высокоаффинных пептидных блокаторов потенциал-зависимого калиевого канала Kv1.1, включая пять новых пептидов. Предложенный подход является универсальным и эффективным инструментом для направленного поиска блокаторов калиевых каналов в природных ядах.

Публикации

  1. Kuzmenkov A.I., Vassilevski A.A., Kudryashova K.S., Nekrasova O.V., Peigneur S., Tytgat J., Feofanov A.V., Kirpichnikov M.P., Grishin E.V. (2015). Variability of Potassium Channel Blockers in Mesobuthus eupeus Scorpion Venom with Focus on Kv1.1: AN INTEGRATED TRANSCRIPTOMIC AND PROTEOMIC STUDY. J. Biol. Chem. 290 (19), 12195–209 [+]

    The lesser Asian scorpion Mesobuthus eupeus (Buthidae) is one of the most widely spread and dispersed species of the Mesobuthus genus, and its venom is actively studied. Nevertheless, a considerable amount of active compounds is still under-investigated due to the high complexity of this venom. Here, we report a comprehensive analysis of putative potassium channel toxins (KTxs) from the cDNA library of M. eupeus venom glands, and we compare the deduced KTx structures with peptides purified from the venom. For the transcriptome analysis, we used conventional tools as well as a search for structural motifs characteristic of scorpion venom components in the form of regular expressions. We found 59 candidate KTxs distributed in 30 subfamilies and presenting the cysteine-stabilized α/β and inhibitor cystine knot types of fold. M. eupeus venom was then separated to individual components by multistage chromatography. A facile fluorescent system based on the expression of the KcsA-Kv1.1 hybrid channels in Escherichia coli and utilization of a labeled scorpion toxin was elaborated and applied to follow Kv1.1 pore binding activity during venom separation. As a result, eight high affinity Kv1.1 channel blockers were identified, including five novel peptides, which extend the panel of potential pharmacologically important Kv1 ligands. Activity of the new peptides against rat Kv1.1 channel was confirmed (IC50 in the range of 1-780 nm) by the two-electrode voltage clamp technique using a standard Xenopus oocyte system. Our integrated approach is of general utility and efficiency to mine natural venoms for KTxs.

    ID:1310