Пресс-центр / новости / Наука /

Основные научные достижения Института в 2011 году

26 декабря 2011 г. в Институте состоялось заседание Ученого совета, на котором были рассмотрены итоги выполнения НИР в уходящем году. Ниже приведены краткие аннотации научных достижений, представленные руководителями подразделений (все материалы приведены в авторской редакции).

Чугунов А.О.

Оглавление: Лаборатория клеточной биологии рецепторов совместно с Лабораториями биологических испытаний и моделирования биомолекулярных систем — Лаборатория биокатализа — Лаборатория сравнительной и функциональной геномики совместно с Группой флуоресцентных инструментов для иммунологии и нейробиологии — Лаборатории протеомики и химии пептидов — Отдел молекулярных основ нейросигнализации — Лаборатория биофотоники — Лаборатория рентгеноструктурного анализа — Лаборатория биомолекулярной ЯМР спектроскопии — Лаборатория моделирования биомолекулярных систем — Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов — Лаборатория клеточных взаимодействий — Лаборатория белков гормональной регуляции — Отдел биоинженерии — Группа химии хромопротеинов — Лаборатория химии белка ФИБХ — Лаборатория механизмов генной экспрессии — Лаборатория химии липидов — Лаборатория молекулярных основ эмбриогенеза — Лаборатории структуры и функции генов человека

Достижения, представленные в Президиум РАН

Лаборатория клеточной биологии рецепторов совместно с Лабораториями биологических испытаний и моделирования биомолекулярных систем: Открыт белок — сенсор внеклеточной слабощелочной среды, являющийся компонентом системы регуляции кислотно-щелочного равновесия в организме

Установлено, что данную функцию осуществляет рецепторная тирозинкиназа ИРР — член семейства рецептора инсулина, функция и лиганды которой ранее были неизвестны. Показано, что физиологическая роль данного рецептора связана с компенсацией повышения рН крови при алкалозе путем удаления избыточных щелочных веществ из организма. Подробности в пресс-релизе: «Рецептор с „нетрадиционной“ ориентацией».

Ключевой функцией живых организмов является поддержание постоянства гомеостаза, в частности, кислотно-щелочного равновесия. Изменения рН крови и внеклеточной жидкости как в сторону снижения (ацидоз), так и в сторону увеличения (алкалоз), происходят вследствие различных патологических процессов или в результате особой диеты и напрямую связаны с развитием почечной либо легочной недостаточности. Нарушение правильной физиологической компенсации сдвигов кислотно-щелочного баланса представляет непосредственную угрозу жизни.

Нами открыто свойство тирозинкиназного рецептора ИРР (рецептор, подобный рецептору инсулина) активироваться слабощелочной внеклеточной средой. ИРР представляет собой первый известный пример метаботропного рецептора, являющегося сенсором слабощелочной среды. Наши эксперименты выявили заметную активацию ИРР при рН >7,9, что выходит за рамки физиологического диапазона кислотно-щелочного равновесия в крови. Однако, в отличие от своих близких гомологов — рецептора инсулина и рецептора инсулин-подобного фактора роста, которые присутствуют в широком спектре тканей и клеток, — ИРР экспрессируется именно там, где возможен контакт со слабощелочной средой.

Активация ИРР гидроксил-анионом соответствует классическим представлениям о лиганд-рецепторном взаимодействии. Активация ИРР специфична, зависит от дозы, характеризуется насыщением и полностью определяется структурой внеклеточной части рецептора. Активация ИРР щелочной средой приводит к фосфорилированию каскадных внутриклеточных белков IRS-1 и AKT-1, а также к конформационым изменениям в молекуле рецептора.

Для анализа функции ИРР и его роли в поддержании кислотно-щелочного равновесия нами была получена линия мышей с направленной инактивацией (нокаутом) гена ИРР. Анализ почечного фенотипа данных мышей выявил их неспособность экскретировать бикарбонат для компенсации экспериментально-индуцированного алкалоза.

В перспективе данный рецептор может быть использован как мишень для поиска лекарств для лечения почечной недостаточности, связанной с нарушением кислотно-щелочного равновесия, а линия мышей с инактивированным геном ИРР может служить животной моделью некомпенсированного алкалоза.

  1. Deyev I.E., Sohet F., Vassilenko K.P., Serova O.V., Popova N.V., Zozulya S.A., Burova E.B., Houillier P., Rzhevsky D.I., Berchatova A.A., Murashev A.N., Chugunov A.O., Efremov R.G., Nikol’sky N.N., Bertelli E., Eladari D., Petrenko A.G. (2011). Insulin receptor-related receptor as an extracellular alkali sensor. Cell Metab. 13, 679–689.

Лаборатория биокатализа: Технология получения биокатализаторов с заранее заданными свойствами на основе антител

Впервые предложено осуществлять высокоэффективный скрининг библиотек генов иммуноглобулинов физиологически активными соединениями, способными образовывать ковалентную связь с продуктивными клонами. Полученные таким способом биокатализаторы «Реактибоди» (Reactibody) способны осуществлять целый ряд превращений, важных для целей медицинской биотехнологии. Показано, что такие биокатализаторы могут разрушать токсичные фосфорорганические вещества, в частности, пестицид параоксон. Доказано, что реакция идет по механизму ковалентного катализа с образованием промежуточного ковалентного интермедиата фосфорилированного антитела. Проведен рентгеноструктурный анализ антитела и интермедиата с высоким разрешением — 1,5 и 1,35 Å, соответственно. Методами предстационарной кинетики установлен молекулярный механизм реакции. Предложенная технология может лечь в основу получения «каталитических вакцин», способных осуществлять детоксикацию организма человека.

  1. Smirnov I., Carletti E., Kurkova I., Nachon F., Nicolet Y., Mitkevich V.A., Débat H., Avalle B., Belogurov A.A. Jr., Kuznetsov N., Reshetnyak A., Masson P., Tonevitsky A.G., Ponomarenko N., Makarov A.A., Friboulet A., Tramontano A,. Gabibov A. (2011). Reactibodies generated by kinetic selection couple chemical reactivity with favorable protein dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15954–15959.

Лаборатория сравнительной и функциональной геномики совместно с Группой флуоресцентных инструментов для иммунологии и нейробиологии: Определение важнейшего элемента иммунного статуса человека — индивидуального репертуара Т-клеточных рецепторов лимфоцитов

Подход успешно применен к количественному мониторингу клонального спектра Т-лимфоцитов при аутоиммунных заболеваниях и трансплантации стволовых клеток крови.

Массированное определение структуры антиген-распознающих участков (CDR3) рецепторов Т-лимфоцитов, предоставляющее высокоинформативную характеристику иммунного статуса организма, относится к числу наиболее актуальных задач молекулярной иммунологии. Разработанный нами подход объединяет а) оригинальный метод получения исчерпывающих селективных библиотек зрелых генов β-цепей Т-клеточного рецептора (TCR-B) периферических лимфоцитов; б) оптимизированное использование современных платформ крупномасштабного секвенирования кДНК и в) биоинформатический анализ данных NGS для реконструкции репертуара Т-клонотипов по структуре антиген-распознающих участков Т-клеточных рецепторов. Применение разработанного подхода для долговременного мониторинга репертуара Т-клеток у больных анкилозирующим спондилитом (АС) позволило выявить и охарактеризовать клональные экспансии и общую динамику репертуара при аутологичной трансплантации гематопоэтических стволовых клеток (HSCT) АС больных.

  1. Mamedov I.Z., Britanova O.V., Bolotin D.A., Chkalina A.V., Staroverov D.B., Zvyagin I.V., Kotlobay A.A., Turchaninova M.A., Fedorenko D.A., Novik A.A., Sharonov G.V., Lukyanov S., Chudakov D.M., Lebedev Y.B. (2011). Quantitative tracking of T cell clones after haematopoietic stem cell transplantation. EMBO Mol. Med. 3, 201–207;
  2. Britanova O.V., Staroverov D.B., Chkalina A.V., Kotlobay A.A., Zvezdova E.S., Bochkova A.G., Chudakov D.M. (2011). Single high-dose treatment with glucosaminyl-muramyl dipeptide is ineffective in treating ankylosing spondylitis. Rheumatol. Int. 31, 1101–1103.

Лаборатории протеомики и химии пептидов: Молекулярная диагностика онкологических и инфекционных заболеваний на основе пептидомного анализа образцов крови

В результате сравнительного масс-спектрометрического (МС) профилирования образцов сыворотки крови, полученных от групп практически здоровых женщин, женщин с доброкачественными гинекологическими заболеваниями и пациенток со злокачественными новообразованиями яичников, была построена высокоспецифичная классификационная модель, выявляющая МС-профили сыворотки крови пациенток с раком яичников среди остальных исследованных групп образцов. Специфичность построенной модели по отношению к МС-профилям образцов сыворотки крови, полученным от практически здоровых доноров, пациенток с аденомиозом, миомой матки, гиперплазией эндометрия и доброкачественными новообразованиями яичников, составляет 93,8%, 100%, 100%, 95,2% и 100%, соответственно.

Работы по выделению и идентификации пептидов в образцах сыворотки крови практически здоровых доноров, пациентов с колоректальным раком, раком яичников и сифилисом привели к установлению аминокислотных последовательностей 2732 неповторяющихся пептидов, являющихся фрагментами 1778 белков. Полученные результаты являются основой для последующих работ по выявлению потенциальных маркеров социально-значимых заболеваний человека.

  1. Зиганшин Р.Х., Арапиди Г.П., Азаркин И.В., Балмасова И.П., Тимченко О.Л., Федькина Ю.А., Морозова Е.А., Пирадов М.А., Супонева Н.А., Ющук Н. Д., Говорун В.М. (2011). Протеомные технологии для выявления в сыворотке крови потенциальных биомаркеров аутоиммунных демиелинизирующих полиневропатий. Биоорган. химия 37, 36–44;
  2. Ziganshin R., Arapidi G., Azarkin I., Zaryadieva E., Alexeev D., Govorun V., Ivanov V. (2011). New method for peptide desorption from abundant blood proteins for plasma/serum peptidome analyses by mass spectrometry. J. Proteomics 74, 595–606.

Другие достижения

Отдел молекулярных основ нейросигнализации: Изучение структуры и функций регулятора никотиновых рецепторов Lynx1

Белок Lynx1, предположительно имеющий трехпетельную укладку змеиных нейротоксинов, с помощью GPI якоря закреплен вблизи никотиновых рецепторов и регулирует их функцию. В совместной работе с Отделами биоинженерии и структурной биологии впервые водорастворимый домен Lynx1 (ws-lynx1) получен в виде индивидуального белка, методом ЯМР определена его структура в растворе. Методами радиолигандного анализа и электрофизиологии впервые показано, что его взаимодействие с никотиновыми рецепторами мышечного типа происходит в участке связывания классических антагонистов, а с нейрональными — вне его.

  1. Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Shulepko M.A., Mineev K.S., D’Hoedt D., Kasheverov I.E., Filkin S.Y., Krivolapova A.P., Janickova H., Dolezal V., Dolgikh D.A., Arseniev A.S., Bertrand D., Tsetlin V.I., Kirpichnikov M.P. (2011). NMR structure and action on nicotinic acetylcholine receptors of water-soluble domain of human LYNX1. J. Biol. Chem. 286, 10618–10627.

Лаборатория биофотоники: Механизмы созревания хромофоров красных флуоресцентных белков методом синтеза биомиметических предшественников хромофоров

Были изучены возможные механизмы созревания красного хромофора DsRed-типа с помощью химического синтеза модельных соединений. Впервые был разработан метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-онов, соответствующих хромофору зеленого флуоресцентного белка GFP (Green Fluorescent Protein) c ациламиноалкильными заместителями в положении 2 имидазолона. По сути, такие соединения представляют собой хромофор GFP с фрагментом предшествующей белковой цепи, что позволяет моделировать созревание хромофоров красных флуоресцентных белков из биомиметических предшественников с зеленым хромофором. Было обнаружено, что эти модельные соединения легко реагируют с молекулярным кислородом с образованием DsRed-подобных хромофоров. Наши данные впервые показали, что GFP-подобный хромофор склонен к окислению по Сα-атому аминокислоты в положении 65 (GFP хромофор формируется аминокислотными остатками в положениях 65–67). Единственным требуемым фактором такого окисления являются щелочные условия. Мы заключили, что в случае красных флуоресцентных белков, созревающих через GFP-подобный интермедиат (таких как z2FP574 и asFP595), роль белкового окружения в формировании красного хромофора сводится к основному катализу.

Наши результаты проливают свет на причины многократного независимого возникновения красных флуоресцентных белков и хромобелков с химически идентичным DsRed-подобным хромофором в ходе эволюции. Легкость окисления GFP хромофора по положению 65, продемонстрированная в нашей работе, помогает объяснить этот интригующий пример конвергентной эволюции, показывая, что превращение зеленого хромофора в красный — не такой сложный процесс, как думали ранее.

Наши результаты позволяют предложить новый подход к созданию красных флуоресцентных белков на основе существующих зеленых флуоресцентных белков, а именно, введение аминокислотных остатков, способных играть роль основания, в непосредственно близости от Сα-атома в положении 65.

  1. Ivashkin P.E., Lukyanov K.A., Lukyanov S., Yampolsky I.V. (2011). A synthetic GFP-like chromophore undergoes base-catalyzed autoxidation into acylimine red form. J. Org. Chem. 76, 2782–2791;
  2. Ивашкин П.Е., Лукьянов К.А., Ямпольский И.В. (2011). Синтез биосинтетических предшественников хромофоров красных флуоресцентных белков. Биоорг. химия 37, 464–474.

Лаборатория рентгеноструктурного анализа: Строение и свойства флуоресцентного белка eqFP578 и его дальне-красного генно-инженерного варианта Katushka

Методом рентгеноструктурного анализа высокого разрешения установлена пространственная организация и структурно-функциональная взаимосвязь флуоресцентного белка дикого типа eqFP578 (Entacmaea quadricolor; λэм=578нм) и его дальне-красного генно-инженерного варианта Katushka (λэм=635нм) при низких и высоких значениях рН. Показано, что наблюдаемое тушение флуоресценции при понижении рН у eqFP578 (от pH 5.5 к pH 4.0) и Katushka (от pH 8.5 к pH 5.0) сопровождается противоположной транс—цис и цис—транс изомеризацией хромофоров, соответственно. Вблизи хромофора у Katushka выявлены ключевые остатки Ser143, Leu174 и Arg197 (замещающие соответствующие остатки Asn, Phe и His у wt eqFP578), отвечающие за изомеризацию хромофора и желаемый сдвиг флуоресценции в дальне-красную область спектра.

  1. N. V. Pletneva, V. Pletnev, D. M. Chudakov, I. Artemyev, A. Wlodawer, Z. Dauter, S. Pletnev (2011). Crystallographic study of red fluorescent protein eqFP578 and its far-red variant Katushka reveals opposite pH-induced isomerization of chromophore. Prot. Sci. 20, 1265–1274.

Лаборатория биомолекулярной ЯМР спектроскопии: Термодинамика и равновесная кинетика взаимодействия между трансмембранными α-спиралями

Получены пространственные структуры двух димерных мембранных доменов рецепторов семейства ErbB (ErbB3 и ErbB4), для которых затем были измерены термодинамические и кинетические параметры взаимодействия между α-спиралями. Было показано, что ассоциация трансмембранных спиралей — это эндотермический процесс, протекающий с существенным увеличением энтропии и теплоемкости системы. Димеризация α-спиральных сегментов характеризовалась высокой энергией и энтропией переходного состояния. На основании полученных результатов была продемонстрирована значительная роль липидов при сборке α-спиральных мембранных доменов и наличие эффекта, аналогичного гидрофобному в липидной мембране.

  1. Mineev K.S., Khabibullina N.F., Lyukmanova E.N., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P., Arseniev A.S. (2011). Spatial structure and dimer—monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim Biophys Acta 1808, 2081–2088.

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем: Идентификация в липидных бислоях молекулярных мишеней действия кардиотоксинов из яда змей

С помощью метода флуоресцентной спектроскопии исследована литическая активность ряда цитотоксинов с модельными липидными мембранами, содержащими минорный анионный компонент (сульфатид или фосфатидилсерин (ФС)). Для всех ЦТ наблюдали максимальную литическую активность в отношении именно ФС-содержащих липосом. На основании результатов молекулярного моделирования выявлены и охарактеризованы три сайта связывания головки ФС молекулой токсина. Выдвинута гипотеза о 2-х стадийном специфическом взаимодействии токсина с бислоем, молекулярными детерминантами которого являются полярные головки анионных липидов, взаимодействующие с определенными сайтами ЦТ.

  1. Kоншинa A.Г., Болдырев И.А., Омельков А.В., Уткин Ю.Н., Ефремов Р.Г. (2010). Анионные липиды как детерминанты связывания цитотоксинов из яда змей на поверхности клеточной мембраны. Acta Naturae 2, 93–101;
  2. Konshina A.G., Boldyrev I.A., Utkin Yu.N., Omel’kov А.V., Efremov R.G. (2011). Snake cytotoxins bind to membranes via interactions with phosphatidylserine head groups of lipids. PLoS ONE 6, e19064.

Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов

Достижение 1. Обнаружена высокая антихламидийная активность одного из представителей нового класса антимикробных пептидов — цито-инсектотоксина CIT1a из яда среднеазиатского паука Lachesana tarabaevi. Сконструирован плазмидный вектор, экспрессирующий ген cit 1a, соответствующий последовательности зрелой цепи цито-инсектотоксина под контролем регулируемого тетрациклин-зависимого промотора цитомегаловируса человека. После трансфекции вектором клеток линии HEK293 показано 80%-ингибирование в них инфекции C. trachomatis.

Продемонстрирован антихламидийный эффект пептида из яда паука Lachesana tarabaevi — цито-инсектотоксина CIT1a, который представляет собой линейный, катионный, амфифильный, a-спиральный пептид, активный в отношении как Грам-положительных, так и Грам-отрицательных бактерий.

Антихламидийная активность синтетического пептида CIT1a была продемонстрирована (а) на элементарных тельцах C. trachomatis; (б) с использованием стратегии регулируемой экспрессии гена cit 1a в инфицированной клетке. Показано, что цито-инсектотоксин CIT1a действует на ЭТ C. trachomatis при довольно высокой концентрации — 100 мкМ, что согласуется с литературными данными по тестированию биологической активности на хламидиях дефензинов и протегринов, и, по-видимому, объясняется особенностями строения наружной оболочки ЭТ и структурной жесткостью ЭТ, которая определяется чрезвычайно сшитой природой комплекса белков наружной мембраны.

Для изучения активности CIT1a по отношению к хламидийной инфекции в инфицированной клетке был сконструирован рекомбинантный плазмидный вектор, в котором последовательность, кодирующая зрелую цепь CIT1a находится под контролем тетрациклин-зависимого промотора CMV, а также в состав вектора входит ген трансактиваторного белка rtTA. Продемонстрирована антихламидийная активность пептида CIT1a после трансфекции рекомбинантного вектора pBI/rtTA/CIT1a в культуре клеток линии HEK 293. Уровень ингибирования инфекции C. trachomatis составил около 80%, что превосходит ингибирующий эффект мелиттина, продемонстрированный ранее. При этом цито-инсектотоксин CIT1a обладает менее выраженным цитотоксическим действием по сравнению с мелитином. C использованием различных схем заражения клеток и индукции экспрессии гена, впервые показано, что антимикробная активность цито-инсектотоксина реализуется на ранней стадии развития хламидийной инфекции.

  1. Lazarev V.N., Polina N.F., Shkarupeta M.M., Kostrjukova E.S., Vassilevski A.A., Kozlov S.A., Grishin E.V., Govorun V.M. (2011). Spider venom peptides for gene therapy of Chlamydia infection. Antimicrob Agents Chemother. 55, 5367–5369.

Достижение 2. На основе клеточной тест-системы разработан метод быстрого и эффективного скрининга природных и синтетических соединений, влияющих на функциональную активность ваниллоидных рецепторов TRPV1, в том числе веществ с модулирующим действием.

С использованием T-REx System (Invitrogene) получена стабильная линия клеток CHO, экспрессирующая рецептор rTRPV1 под контролем тетрациклин-зависимого промотора CMV. Метод скрининга основан на измерении Са2+ сигнала клеток, индуцируемого при стимуляции клеток агонистами TRPV1 рецептора (капсаицин, 2APB, рН), без и в присутствии различных тестируемых соединений. Клетки, экспрессирующие рецептор, в присутствии Са2+-чувствительных флуоресцентных зондов (Fluo-4) анализируются с использованием планшетного спектрофотометра с интегрированной автоматической системой дозирования жидкостей NOVOstar (BMG LABTECH). Изучено действие анальгетических пептидов APHC1-3 из анемоны Heteractis crispa. Показано, что пептиды APHC1-3, в отличие от капсазепина — известного блокатора TRPV1 каналов, — не вызывают значительного падения Са2+ ответа клеток при однократной активации клеток капсаицином, а также при приложении рН=6.0—5.5 и повышенной температуры (44 °С), однако, при применении слабого активационного стимула (рН ≈6.5, 2АРВ) APHC1-3 значительно изменяют кальциевый ответ на последующий капсаициновый стимул. Полученные данные свидетельствуют в пользу более сложного механизма действия пептидов, затрагивающего различные переходные состояния рецептора во время активации-десенсетизации. Показано, что данная клеточная система может быть использована для быстрого скрининга и поиска новых активных соединений.

Достижение 3. Определена пространственная структура нового уникального антимикробного пептида семян ежовника обыкновенного (Echinochloa crusgalli) EcAMP1 (совместно с лабораторией биомолекулярной ЯМР спектроскопии). Установлено, что она представляет собой новый тип укладки (фолд) полипептидной цепи шпилечного типа, стабилизованный двумя дисульфидными связями. Методами лазерной конфокальной флуоресцентной микроскопии изучено взаимодействие пептида со спорами гриба Fusarium solani, и показано, что он связывается с оболочкой клеток и не разрушает их мембраны. Полученные результаты важны как для понимания молекулярных механизмов иммунной системы растений, так и для повышения устойчивости сельскохозяйственных растений к биотическим и абиотическим факторам окружающей среды.

Лаборатория клеточных взаимодействий

Достижение 1. Обнаружено, что миелопептиды МП-4 и МП-6 индуцируют созревание эритромиелоидных предшественников до зрелых форм клеток-продуцентов гемоглобина, что свидетельствует о существенной дифференцировочной активности этих миелопептидов.

Создание препаратов, способных восстанавливать процесс дифференцировки трансформированных клеток-предшественников, является одним из новых разрабатываемых подходов к лечению лейкозов. Ранее нами было продемонстрировано, что миелопептиды МП-4 и МП-6 обладают дифференцировочной активностью в культуре опухолевых клеток костномозгового происхождения. Основываясь на этих данных, мы протестировали способность МП-4 и МП-6 к индукции созревания эритромиелолейкозной линии К562 до зрелых, функционально активных клеточных форм — продуцентов гемоглобина. С применением бензидинового метода детекции гемоглобина было установлено, что под действием миелопептидов МП-4 и МП-6 уровень синтеза гемоглобина в культуре этих клеток превосходит таковой, наблюдаемый при использовании ДМСО — стандартного индуктора дифференцировки клеток К562 в эритроидном направлении. Полученные результаты указывают на возможность использования МП-4 и МП-6 для создания новых противолейкозных препаратов.

  1. Фонина Л.А., Кудрявцева Е.В., Беспалова Ж.Д., Ефремов М.А., Михайлова А.А., Кирилина Е.А. (2010). Синтез и свойства миелопептидов с дифференцировочной активностью. Биоорг. химия 36, 493–497.

Достижение 2. Разработан способ создания противоаллергических вакцин с использованием наноносителей из модифицированного хитозана, содержащих синтетические пептиды — аналоги В-эпитопов аллергенов и Т-эпитопов распространенных инфекционных агентов.

В настоящее время одним из наиболее эффективных методов профилактики и лечения аллергии является специфическая иммунотерапия (СИТ), основанная на десенсибилизации иммунной системы с помощью инъекций экстрактов аллергенов. Однако процедура СИТ может вызвать серьезные осложнения, вплоть до анафилактического шока, что связано с содержанием в препаратах экстрактов аллергенов широкого спектра. Такого недостатка лишены пептидные вакцины с узким детерминированным профилем антигенности. Нами совместно с лабораторией химии пептидов и лабораторией полимеров для биологии были продемонстрированы возможности создания гетерологичных пептидных противоаллергических вакцин повышенной эффективности при использовании биополимерных наноносителей, нагруженных В-эпитопами аллергенов и Т-эпитопов наиболее общих инфекционных агентов. Указанные Т-эпитопы обеспечивают активацию пула предсуществующих в организме Т-клеток памяти, ускоряя тем самым формирование защитного иммунного ответа на аллерген.

Лаборатория белков гормональной регуляции: Определена нуклеотидная последовательность гена, кодирующего новый белок rYM-1olf

Структура соответствующей кДНК депонирована в международную базу данных GenBank (JF781276). Выявлена высокая гомология изучаемого нами белка rYM-1olf с процессированной (короткой) формой белка AMCase из тканей человека, предположена их сходная функциональная роль в организме. Для анализа уровня относительной экспрессии генов rYM-1olf и rSec14р в обонятельном эпителии крысы разработан метод количественного ПЦР-анализа в реальном времени с использованием в качестве внутреннего контроля генов В-Act и GAPDH. Показано, что количество транскриптов гена rYM-1olf в ткани опытных животных с синдромом острого воспаления увеличивается в 22,6 раза по сравнению с контрольной группой, а гена rSec14р в 5,4 раза. У животных с хроническим воспалением уровень экспрессии гена rYM-1olf был невысоким. Установлено, что накапливание rYM-1olf в тканях является индикатором развития воспаления.

Отдел биоинженерии: Бесклеточная система синтеза интегральных мембранных белков

Разработана бесклеточная система синтеза интегральных мембранных белков, основанная на использовании мембраномоделирующих сред. Бесклеточные системы имеют ряд преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции, и в последнее время пользуются все большей популярностью для получения мембранных белков. Для бесклеточной продукции мембранных белков в растворимой и одновременно функционально активной форме нами был опробован новый подход: синтез в присутствии мембраномоделирующих сред, таких как мицеллы детергентов, бицеллы, липосомы и липид-белковые нанодиски (ЛБН). На примере бактериородопсина из Exiguobacterium sibiricum (ESR) был проведен сравнительный анализ эффективности синтеза в присутствии различных мембранных миметиков. О правильно сформированной пространственной структуре и функциональной активности ESR судили по наличию характерного поглощения синтезированного белка на длине волны 535 нм. Было показано, что продукция функционально активного бактериородопсина в растворимой форме наблюдается при котрансляционном встраивании белка в мембрану ЛБН. Кроме того, было показано, что только использование липид-белковых нанодисков, состоящих из насыщенных липидов, приводит к образованию стабильных комплексов ЛБН/ESR. (Совместно с лабораторией биомолекулярной ЯМР-спектроскопии.)

  1. E.N. Lyukmanova, Z.O. Shenkarev, N.F. Khabibullina, G.S. Kopeina, M.A. Shulepko, A.S. Paramonov, K.S. Mineev, R.V. Tikhonov, L.N. Shingarova, L.E. Petrovskaya, D.A. Dolgikh, A.S. Arseniev, M.P. Kirpichnikov. (2012). Lipid-protein nanodiscs for cell-free production of integral membrane proteins in a soluble and folded state: comparison with detergent micelles, bicelles and liposomes. BBA — Biomembranes 1818, 349–358;
  2. N.F. Khabibullina, E.N. Lyukmanova, Z.O. Shenkarev, A.S. Paramonov, K.S. Mineev, A.S. Arseniev, D.A. Dolgikh, M.P. Kirpichnikov. (2011). Different approaches for effective cell-free synthesis of integral membrane proteins with different topologies in a soluble form. 36 FEBS Congress, Torino, Italy;
  3. E.N. Lyukmanova, N.F. Khabibullina, L.N. Shingarova, L.E. Petrovskaya, Z.O. Shenkarev, A.S. Arseniev, D.A. Dolgikh, M.P. Kirpichnikov. (2011). Large-scale cell-free production of membrane proteins. 2nd Russian-Hellenic Symposium with International Participation and Young Scientist’s School;
  4. Хабибуллина Н.Ф., Люкманова Е.Н., Шенкарев З.О. (2011). Мембраномоделирующие среды для бесклеточной продукции мембранных белков: мицеллы детергентов, бицеллы, липосомы и липид-белковые нанодиски. Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» Москва—Пущино.

Группа химии хромопротеинов: In silico — In vitro метод установления структуры флуоресцентных белков

Разработан метод установления структуры флуоресцентных белков, объединяющий гомологичное моделирование in silico для определения общей пространственной структуры белка и эксперименты in vitro для установления структуры хромофора. Экспериментальное установление структуры хромофора включает в себя выделение из белка небольшого хромофорсодержащего пептида и последующий его масс-спектрометрический анализ. Включение структуры хромофора в рассчитанную модель белка позволяет получить полную пространственную структуру исследуемого белка. C помощью разработанного метода построена модель трехмерной структуры желтого флуоресцентного белка phiYFP. Полученная модель на следующем этапе использовалась для определения аминокислот в окружении хромофора, которые могут влиять на фотофизические свойства белка, и по этим аминокислотам проводился направленный мутагенез. Анализ спектральных свойств полученных мутантов показал, что несколько факторов определяют фотофизические характеристики phiYFP и вклад этих факторов имеет, по-видимому, аддитивный характер.

  1. Пахомов А.А., Мартынов В.И. (2011). Метод определения трехмерной структуры флуоресцентных белков при помощи гомологичного моделирования и масс-спектрометрии. Биоорг. химия 37, 429-432;
  2. Pakhomov A.A., Martynov V.I. (2011). Probing the structural determinants of yellow fluorescence of a protein from Phialidium sp.. Biochem. Biophys. Res. Commun. 407, 230–235.

Лаборатория химии белка ФИБХ: Механизм образования филаментов из самоформирующихся пептидов

Впервые предложен механизм образования филаментов из самоформирующихся пептидов с использованием в качестве модели H-(ArgAlaAspAla)4-OH. Показано, что ядром образования филамента можно считать тетрамер, в котором β-антипараллельные структуры димеров стабилизируются гидрофобными взаимодействиями остатков Ala между димерами, а сам филамент представляет собой двухслойную структуру, где внутри каждого слоя присутствуют β-антипараллельные структуры, а слои связаны между собой гидрофобными взаимодействиями.

  1. Данилкович А.В., Соболев Е.В., Тихонов Д.А., Шадрина Т.Е., Удовиченко И.П. (2011). Математическая биология и биоинформатика 6, 92–101;
  2. Данилкович А.В., Соболев Е.В., Тихонов Д.А., Удовиченко И.П., Липкин В.М. // Доклады Академии Наук (в печати).

Лаборатория механизмов генной экспрессии

Установлено, что в клетках иммунной ткани человека (клеточная линия Jurkat) специфические изоформы субъединицы РНК-полимеразы II Homo sapiens hRPB11ca и hRPB11ba (в отличие от основной изоформы hRPB11a) взаимодействуют с продуктом экспрессии одного из двух генов ретротранспозона LINE-1 (L1) — РНК-связывающим белком ORF1p (p40), — точная функция которого в клетке и жизненном цикле L1-элемента до сих пор не выяснена. По-видимому, именно РНК-полимеразные комплексы, содержащие вместо субъединицы hRPB11a минорные изоформы hRPB11ca и hRPB11ba, ответственны за транскрипцию и связанную с ней 3’-трансдукцию ретротранспозонов L1 человека.

Лаборатория химии липидов: Разработка нового флуоресцентного субстрата для высокочувствительного обнаружения секреторной фосфолипазы А2 в плазме крови человека

Мониторинг активности секреторной фосфолипазы А2 особенно актуален для пациентов с осложнениями сердечно-сосудистых заболеваний. Для определения активности фермента используют фосфолипидные зонды, содержащие одновременно и флуорофор, и специфический тушитель его флуоресценции. Для понижения уровня фоновой флуоресценции и повышения чувствительности зондов стараются располагать флуорофор и тушитель как можно ближе друг к другу, то есть на возможно более коротких ацильных цепях. Однако при этом теряется сродство к ферменту.

Обнаружено, что в липидном бислое некоторые ароматические молекулы можно расположить параллельно поверхности мембраны. В этом случае дипольные моменты перехода флуорофора и тушителя коллинеарны, и эффективность тушения флуоресценции значительно выше. Основываясь на этом принципе, синтезирован новый флуоресцентный субстрат и разработана мицеллярная матрица, которая позволяет нужным образом сориентировать в пространстве флуорофор и тушитель. В качестве тушителя использован хромофор красителя Судана III, флуорофор — BODIPY-группа. Испытания с контрольными образцами фосфолипазы А2 из пчелиного яда и с образцами плазмы крови человека показали достоверный уровень определения крайне малых количеств фермента. Разработанная система позволит создать доступный для применения в клинике диагностикум. Заявка на патент оформляется.

Лаборатория молекулярных основ эмбриогенеза

Секретируемый белок Noggin1 — известный индуктор дифференцировки таких важных туловищных структур в эмбриогенезе позвоночных животных, как спинной мозг, хорда и скелетные мышцы. Индукция этих структур происходит благодаря способности Noggin1 связывать и ингибировать TGFβ-факторы семейства BMP. Нами впервые выявлена способность белков Noggin1 и Noggin2 ингибировать, помимо BMP, сигнальные каскады Activin/Nodal и Wnt. На модели эмбрионов шпорцевой лягушки было установлено, что Noggin2 продуцируется клетками зачатка головного мозга на ранних стадиях эмбрионального развития и, подавляя функционирование сигнальных каскадов BMP, Activin/Nodal и Wnt, создает необходимые условия для дифференцировки переднего отдела мозга.

  1. Bayramov A.V., Eroshkin F.M., Martynova N.Y., Ermakova G.V., Solovieva E.A., Zaraisky A.G. (2011). Novel functions of Noggin proteins: inhibition of Activin/Nodal and Wnt signaling. Development 138, 5345–5356;
  2. Ерошкин Ф.М., Байрамов А.В., Мартынова Н.Ю., Зарайский А.Г. (2011). Использование люциферазных репортерных конструкций для изучения способности белка Noggin2 ингибировать сигнальные каскады клеток в эмбрионах шпорцевой лягушки. Биоорг. химия — принято к публикации.

Лаборатории структуры и функции генов человека

Достижение 1. Разработан метод изучения состояния метилирования регуляторных областей генов, основанный на определении температур плавления соответствующих фрагментов ДНК. На примере метилирования промоторов генов TIMP4, GATA4, SOX18 и EGFL7 в образцах немелкоклеточного рака легкого показано, что метилирование гетерогенно не только в опухоли, но и в прилегающих к опухоли нормальных тканях легкого, в отличие от здоровой ткани. Увеличение гетерогенности метилирования в нормальных тканях, прилегающих к опухолевым, указывает на начало эпигенетических процессов, предшествующих генетическим и морфологическим изменениям, характерным для опухоли. Оценка степени неоднородности метилирования регуляторных областей генов-опухолевых супрессоров может быть использована как биомаркер ранних стадий опухолеобразования. Метод является простым и высокочувствительным, может служить для ранней диагностики эпигенетических изменений, сопровождающих раковое перерождение.

  1. T. Azhikina, A. Kozlova, T. Skvortsov, E. Sverdlov. (2011). Heterogeneity and degree of TIMP4, GATA4, SOX18, and EGFL7 gene promoter methylation in non-small cell lung cancer and surrounding tissues. Cancer Genetics 204, 492–500.

Достижение 2. Предложен метод определения степени компактности хроматина в живых клетках человека на основе доступности хроматина для метилирования метилазой Dam E. coli. При помощи разработанного метода проведен анализ распределения доступных для метилазы участков хроматина внутри области генома человека длиной 140 тыс. пар оснований. Картину распределения доступных для метилазы участков сравнили с распределением участков, чувствительных и устойчивых к ДНК-азе I, участков с различным уровнем CpG метилирования и участков, содержащих ацетилированный гистон Н3. Обнаружена прямая корреляция между степенью доступности для метилазы Dam и уровнем метилирования цитозинов в последовательности CpG. Промоторы активных генов в высокой степени доступны для метилазы Dam, тогда как промоторы молчащих генов обладают низкой доступностью. Некоторые высоко доступные для метилазы Dam участки расположены в межгенных областях и, по-видимому, соответствуют новым регуляторным элементам генома. Новый метод позволяет проводить анализ структуры хроматина in vivo в протяженных областях генома, включая полногеномный анализ.

  1. Bulanenkova S.S., Kozlova A.A., Kotova E.S., Snezhkov E.V., Azhikina T.L., Akopov S.B., Nikolaev L.G., Sverdlov E.D. (2011). Dam methylase accessibility as an instrument for analysis of mammalian chromatin structure. Epigenetics 6, 1068–1077.

Лаборатория молекулярной иммунологии: Разработка фундаментальных принципов конструирования неприродных антител с заданными свойствами и нанокомплексов на их основе

На основе разработанных принципов сконструированы и охарактеризованы субмикронные полимерные частицы, содержащие флуоресцентные полупроводниковые кристаллы CdSe/ZnS (квантовые точки) и нацеленные на опухолевые клетки с помощью специфических антител. Полученные соединения характеризуются высоким квантовым выходом и фотостабильностью и пригодны для разных видов биоанализа, в том числе для селективной визуализации опухолевых клеток in vitro. (Совместно с лабораториями полимеров для биологии и молекулярной биофизики.)

  1. Generalova A.N., Sizova S.V., Zdobnova T.A., Zarifullina M.M., Artemyev M.V., Baranov A.V., Oleinikov V.A., Zubov V.P., Deyev S.M. (2011). Submicron polymer particles containing fluorescent semiconductor nanocrystals CdSe/ZnS for bioassays. Nanomedicine (Lond). 6, 195–209;
  2. Генералова А. Н., Зубов В. П., Мочалов К. Е., Здобнова Т. А., Сизова С. В., Деев С. М., Петров Р. В. (2011). Биоаналитические флуоресцентные реагенты на основе полиакролеинсодержащих частиц, наполненных полупроводниковыми CdSe/ZnS нанокристаллами. ДАН 439, 122–125.

15 января 2012 года